利用種子細胞及新型生物材料進行尿道狹窄修復的研究進展

史建國，陳宇東

(解放軍第二五二醫(yī)院泌尿外科，河北 保定 071000)

尿道狹窄嚴重影響著患者的生活質量，并易繼發(fā)感染、膀胱結石、尿瘺、敗血癥等，并最終導致腎功能衰竭。尿道狹窄的發(fā)病率為2‰～12‰，55歲以上人群的發(fā)病率呈明顯升高的趨勢[1]。在美國，每年在門診就診的男性尿道狹窄患者約150萬人次，住院約5 000人次[2]。復雜性尿道狹窄常導致尿道缺損，因缺乏重建所需的自體組織，治療起來非常棘手。傳統(tǒng)替代組織為自體外生殖器皮膚、膀胱黏膜以及口腔黏膜等。自體組織取材后取材部位常發(fā)生各種并發(fā)癥，如神經損傷、出血、血腫形成、口腔感覺異常等[3]。此外，自體組織來源有限，尤其是需要大面積材料或病變復發(fā)時，不足以提供充足的材料。因此，當前這種犧牲自體組織以傷治傷的方法無法滿足臨床需求。

組織工程與再生醫(yī)學為尿道組織工程重建提供了新方法。在再生醫(yī)學領域，組織工程學被定義為應用工程學和生命科學原理開發(fā)恢復、維持或改善組織功能或整個器官的生物替代物的交叉學科[4]。已有研究開始嘗試使用新型材料和各種種子細胞(尤其是干細胞)進行尿道重建以修復尿道缺損[5]?，F對目前研究中的新型材料和種子細胞予以綜述。

1 種子細胞在尿道組織工程修復中的應用

早在20世紀80年代，人類就已經邁出了尿道組織工程的第一步：培養(yǎng)尿路上皮細胞。最初，這些體外培養(yǎng)的細胞只是用來研究外源性物質對組織的影響。當組織工程學進一步發(fā)展時，培養(yǎng)細胞的目標變?yōu)樘鎿Q受損或缺失的器官。后一種策略的基本原理是用有限數量的組織(小塊組織活檢)，通過細胞培養(yǎng)擴增，獲得更多的自體細胞用于移植。由于是自體細胞，所以排斥反應可以忽略。植入體內時，因組織具有與周圍組織相似的性質，從而達到了組織替代的目的。這種方法避免了因大塊組織取材而導致的并發(fā)癥，并最大限度地減少了患者的損傷及痛苦。組織再生包含纖維蛋白沉積、再上皮化、組織重塑，這個過程受限于組織缺損的大小。瘢痕形成源于器官本身細胞在缺損處的再生缺乏。組織工程尿道策略可分為兩類：①使用不含細胞的基質材料修復尿道缺損部位。這種方法以脫細胞基質材料為依托，再生主要依賴組織修復的自然進程。②使用一種攜帶細胞的支架材料修復病變的尿道。目前研究證實了細胞種植會減少瘢痕形成，并促進工程化尿道組織的再生及血管化[6]。有研究表明，用無細胞的基質修復缺損范圍超過1 cm的管狀尿道會導致組織攣縮、纖維增生以及鈣化等，最終導致尿道狹窄復發(fā)[7]。Dorin等[8]建立家兔尿道狹窄模型發(fā)現，當尿道管狀替代距離超過0.5 cm時，用無細胞支架材料進行管狀尿道替代易導致狹窄的再發(fā)生。在尿道組織工程重建研究中，攜帶細胞的材料明顯優(yōu)于無細胞種植材料。

1.1成體細胞 文獻報道的尿道組織工程使用的種子細胞種類較多，包括口腔黏膜角質細胞、成纖維細胞、包皮表皮細胞、膀胱尿路上皮細胞、膀胱平滑肌細胞、網膜細胞等。Orabi等[9]以犬為實驗對象，使用膀胱脫細胞基質構建管狀結構，種植尿路上皮及平滑肌細胞，形成組織工程尿道，修復6 cm長的尿道缺損。觀察1年發(fā)現，組織工程尿道寬敞無狹窄發(fā)生，而無細胞種植的支架材料發(fā)生了管腔狹窄和閉鎖。De Filippo等[10]用膀胱脫細胞基質種植自體膀胱尿路上皮及平滑肌細胞，最終形成了尿道形態(tài)的管狀結構。該研究發(fā)現，種植了細胞的支架材料組術后尿道管腔寬闊，而未種植細胞的支架材料組管腔塌陷并出現尿道狹窄。Xie等[11]以絲素蛋白基質，以口腔黏膜角質細胞和成纖維細胞為種子細胞，制作了組織工程口腔黏膜用于修復犬5 cm長的尿道缺損。研究發(fā)現，植入組織工程黏膜的犬排尿通暢，術后6個月行逆行尿道造影檢查提示尿道管腔通暢無狹窄[11]。Gu等[12]取網膜組織培養(yǎng)網膜細胞，擴增后種植于膀胱脫細胞基質表面，形成網膜樣組織，將形成的組織工程腹膜樣管狀組織替代尿道。

1.2干細胞 在人體所有的組織中都可以找到干細胞，這些干細胞具有自我更新、長期生存以及在特定微環(huán)境下多向分化的潛能。因具有控制穩(wěn)態(tài)、再生以及修復組織的作用，對再生醫(yī)學至關重要[13-15]。要將干細胞應用于再生醫(yī)學，必須滿足在無創(chuàng)或微創(chuàng)條件下大批獲取的條件。此外，干細胞的分化過程及分化途徑是以一種可重復的方式進行，并且需要保證將其移植到自體或異體宿主的過程是安全有效的。根據來源不同，干細胞可以分為胚胎干細胞[16]、胎兒干細胞[17]以及成體干細胞[18]。在這些干細胞中，胚胎干細胞的分化潛能最大，但倫理學問題限制了應用。

在成體干細胞中，對間充質干細胞的研究較多，尤其是骨髓間充質干細胞和脂肪干細胞。骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞在特定環(huán)境下都具有向平滑肌細胞和尿路上皮細胞分化的潛能。然而與脂肪干細胞相比較，獲取骨髓間充質干細胞的方法創(chuàng)傷性大，獲取效率低下，擴增速度慢，這些缺點限制了骨髓間充質干細胞的廣泛應用。而脂肪干細胞分布廣泛，易于獲取，取材創(chuàng)傷小，增殖效率高，并具有向上皮細胞分化的潛能[19]。此外，脂肪干細胞還能夠分泌多種營養(yǎng)因子刺激細胞增殖分化，并使多種細胞遷移。脂肪干細胞分泌的營養(yǎng)因子以及旁分泌效應對于其在再生醫(yī)學的應用至關重要[20]。Li等[21]用膀胱脫細胞基質種植脂肪干細胞分化的上皮細胞發(fā)現，脂肪干細胞來源的上皮細胞可以替代尿路上皮細胞用于尿道組織工程，并在預防尿道管腔狹窄以及各種并發(fā)癥方面具有優(yōu)勢。杜小文等[22]取雄性新西蘭大白兔附睪旁的脂肪組織分離培養(yǎng)脂肪間充質干細胞，以Ⅰ型膠原蛋白表面修飾的聚乳酸乙酸共聚物膜為組織工程材料，構建內縱外螺旋雙層結構的管狀尿道支架，采用一次沉淀法將轉染的脂肪干細胞和平滑肌細胞分別種植于尿道支架的內外層，構建管狀尿道支架復合體，并將其包埋于實驗動物腹股溝皮下血管旁，3周后采用帶血管蒂轉移皮管修復尿道缺損。結果表明，這種攜帶干細胞的管狀尿道支架復合體是修復長段尿道缺損較為合理的方法。

除脂肪干細胞外，也可從尿液中分離出干細胞，稱為尿源性干細胞。尿源性干細胞具有多向分化潛能，可分化為平滑肌細胞、內皮細胞等，具有取材方便、安全、無損傷等優(yōu)點[23]。尿源性干細胞可用于壓力性尿失禁、膀胱輸尿管反流以及膀胱尿道組織工程等的研究[24-25]。Liu等[5]將培養(yǎng)的家兔尿源性干細胞種植在用5%過氧乙酸處理過的小腸黏膜下層脫細胞基質支架材料上進行尿道重建，這種干細胞復合支架材料適用于復雜性長段尿道狹窄的重建。雖然尿源性干細胞可用于組織工程修復，但其數量和純度均十分有限，因而此方面的研究尚有待深入。

2 應用于尿道組織工程修復的新型生物材料

種子細胞對成功進行組織工程尿道重建具有至關重要的作用，但僅僅使用培養(yǎng)的細胞進行尿道重建會因為缺乏承載細胞的載體而難以成功。支架材料解決了細胞的承載問題，并具備一定的機械性能。理想的支架材料應具備良好的生物相容性、生物可降解性、可吸收性，能促進種植細胞的增殖，促進植入區(qū)域原位細胞的滲透性生長，并具有良好的機械和物理學性能。用于修復尿道的組織工程支架主要分為兩種，一種是含有多種多聚物的合成支架，即可降解高分子材料，代表材料有聚乳酸、聚羥基乳酸等[3]；另一種是取自各組織的脫細胞基質,如脫細胞真皮組織、脫細胞小腸黏膜下層、脫細胞膀胱黏膜[21]等，其他新型材料如細胞膜片[26]、靜電紡絲絲素蛋白支架等[27]。

2.1脫細胞基質材料 脫細胞基質，又稱為無細胞膠原基質材料，是一種良好的生物支架材料。這種材料是通過脫細胞處理生物組織而獲得，其優(yōu)點是低抗原性和良好的生物趨化性。脫細胞基質中含有一些細胞黏附和分化所必需的生長因子，如血管內皮生長因子、轉化生長因子、成纖維細胞生長因子以及上皮生長因子等。此外，因保留了細胞外基質結構，這類材料具有接近細胞外基質的生物力學性能和細胞網架結構。源于小腸黏膜下層、膀胱黏膜、口腔黏膜的脫細胞基質已成功用于動物研究，并已嘗試在臨床應用[28]。目前脫細胞基質材料主要來源于豬，但其存在倫理學問題，并具有傳播疾病的可能。此外，由于脫細胞基質材料取自不同個體，不同批次材料之間的蛋白及膠原含量不一致，導致材料的可控性差。雖然脫細胞基質材料具有有效性，但應用脫細胞基質材料進行尿道組織工程重建的研究始終處于臨床前的實驗階段。

2.2人工合成多聚物 人工合成多聚物具有較好的機械力學性能，在體內經生物降解轉化為二氧化碳和水，通過人體正常的組織代謝排出體外。此類材料不需進行組織獲取，避免了組織獲取帶來的倫理學問題、傳播疾病的風險以及可控性差等問題。此外，由于人工合成多聚物可以成規(guī)模生產，材料的三維結構、孔隙率、機械性能等都在可控范圍，且成本低廉，易于推廣。人工合成多聚物的缺點是缺乏細胞外基質蛋白，這些細胞外基質蛋白具有重要的生物學功能，可參與支持細胞的增殖與分化。另外，人工合成多聚物往往具有疏水表面，且無相應的信號分子，導致細胞難以黏附在支架材料上，從而無法進入支架材料內部發(fā)揮種子細胞的功能[29]。

2.3其他新型材料的探索 由于天然衍生材料和人工合成材料均存在局限性，因而研究者嘗試采用新型材料(如細胞膜片材料、基因轉染抗瘢痕材料、攜帶緩釋血管內皮細胞生長因子納米微球材料、靜電紡絲絲素蛋白材料等)用于組織工程尿道修復，這些新型材料集人工材料和天然衍生材料的優(yōu)點，在促進愈合、減少瘢痕、促進局部血運等方面均具有優(yōu)越性。

Ram-Liebig等[30]使用新型組織工程材料TEOMG進行尿道球部和陰莖部重建，結果表明該材料安全有效，在12～24個月的隨訪中大部分患者的療效較好。Zhou等[26]采用少許口腔黏膜組織和脂肪組織分離并培養(yǎng)口腔黏膜上皮細胞、成纖維細胞及脂肪干細胞，在體外環(huán)境下利用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，制作出一種含有三層細胞的膜片樣結構，將這種膜片樣結構的組織工程尿道植入皮下組織以促進植入物的血管化，并提高生物機械性能。3周后將組織工程尿道取出后原位植入，用于修復2 cm長的尿道。3個月后發(fā)現該組織工程尿道能夠基本模擬正常尿道的功能。細胞膜片技術是一種不需要基質材料的技術，是在體外環(huán)境下培養(yǎng)含有三層不同類型細胞的細胞膜片，這種膜片本身具有良好的機械性能，適合于外科操作。

Li等[31]獲取口腔角質細胞，并用轉化生長因子β1基因轉染，將轉染的細胞種植在預制的支架材料上以構建新型抗瘢痕形成的尿道支架，結果發(fā)現，將這種材料原位植入尿道后達到了抗瘢痕形成的作用。Wang等[32]制作了一種緩釋血管內皮細胞生長因子納米微球修飾的膀胱脫細胞基質支架材料，并成功進行了家兔的前尿道重建。研究發(fā)現這種新型支架材料可促進植入部位的血管化。蠶蛹經Na2CO3、水溶液充分處理后，脫去能引起炎癥反應的絲膠，得到絲素蛋白，利用靜電紡絲絲技術制備具有多孔三維立體結構的絲素蛋白尿道支架，將制備完成的靜電紡絲絲素蛋白材料放置于90%的乙醇中進行拉伸處理顯著提高了材料的機械強度[33]。將移行上皮細胞種植于靜電紡絲絲素蛋白材料上，細胞生長良好，形成了類似天然尿路的多層移行上皮細胞結構，使用復合尿路上皮細胞的絲素蛋白材料修復3 cm長的尿道黏膜缺損發(fā)現，術后6個月內未發(fā)生尿道狹窄、尿瘺等并發(fā)癥[33]。

3 展 望

尿道狹窄的組織工程重建給尿道狹窄的治療帶來了希望與挑戰(zhàn)。干細胞和新型支架材料成為未來解決這一難題的關鍵。新型支架材料包括含有人工合成和天然成分的混合支架材料、細胞膜片支架材料以及含有細胞外基質蛋白和生長因子修飾的人工合成支架等[34]，這些新型支架材料可在體內原位刺激細胞的再生過程。此外，3D生物打印技術[35]是以含有細胞的凝膠為原料進行細胞外基質打印，以制作新型支架材料，但尚未有應用于尿道組織工程重建的報道，在不久的將來可能成為最有發(fā)展?jié)摿Φ纳镏Ъ懿牧稀?/p>