組織工程支架在骨軟骨修復中的應用進展

馬 鋼，肖云峰，劉曉民※，丁良甲，劉長路，高 博

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院關節(jié)外科，呼和浩特 010030； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心，呼和浩特 010100)

創(chuàng)傷或退行性疾病引起的骨軟骨組織損傷很難再生。目前臨床常用的多種治療手段能夠有效緩解骨軟骨損傷帶來的病痛，但仍存在很多弊端[1]，組織工程技術的興起為這些問題的解決帶來了希望。在骨軟骨修復過程中，為獲得滿意的細胞附著功能和最佳的生物活性分子的治療作用，首先需要考慮的因素是支架的設計與性能。能夠用作支架的材料首先應具有組織相容性、生物可降解性、機械穩(wěn)定性以及多孔隙結構等；支架可以被制備為多種類型如水凝膠、多孔泡沫、纖維網(wǎng)絡等；同時，支架還應有利于細胞黏附、遷移、生長、分化，從而益于新生骨軟骨形成。因此，利用合適的材料、先進的制備技術以及可調(diào)控的信號分子仿生雙相功能性支架，可以有效幫助解決骨軟骨損傷后修復與再生的難題，為骨軟骨損傷后的修復再生治療提供希望。

1 支架的性能和結構

1.1生物相容性及可降解性材料的選擇 生物材料制作的支架不能引起宿主免疫反應或異物反應，需符合宿主體內(nèi)組織的增長速率。支架材料的來源有天然聚合物、人工合成聚合物、金屬材料、無機材料以及復合材料。天然或合成的聚合物柔韌性較佳，可塑形成理想的形狀。天然聚合物富含對細胞有益的分子，如糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)、膠原、 類GAG、 絲素蛋白等，這些天然聚合物易被復合入支架中，從而改善支架與宿主組織的生物親和力[2-3]。聚合明膠藻酸鈣支架具有改善細胞黏附、增殖以及促進骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化形成軟骨及成骨細胞的潛能[4]。天然聚合物在細胞相容性與生物活性方面普遍優(yōu)于合成聚合物，但在機械性能和可降解性方面相對較弱?？缮锝到獾暮铣删酆衔?如脂肪族聚酯)已被用于骨軟骨支架材料。根據(jù)合成條件，較易調(diào)控支架的機械性能。合成聚合物具有較差的表面活性與細胞親和力，為改善這些性能，可采用復合以及共聚作用合成不同的聚合物，如聚乙烯醇復合聚己酸內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)納米纖維支架，其可以改善原有支架的生物兼容性與拉伸性能。與單純PCL支架相比，復合PCL納米纖維支架能夠增強MSCs細胞增殖與軟骨細胞分化能力[5]。但復合不同聚合物的支架仍不足夠維持來自關節(jié)運動產(chǎn)生的機械應力和生物降解，在這些聚合物中加入無機離子可以改善機械性能，如加入金屬和陶瓷，形成生物活性玻璃。少量的金屬材料(如鈦、鈷及其合金成分)有利于改善支架的機械負載能力，使支架在軟骨區(qū)域變得更柔軟。在修復骨軟骨缺損中，雙相鈦結合聚乙二醇水凝膠支架，可以較好地與鄰近組織整合[6]。組織工程中的金屬材料缺乏生物降解性，可造成組織磨損或腐蝕[7]。因此，將金屬材料復合到骨軟骨支架時必須小心。已知的生物活性陶瓷(如鈣磷酸鹽或生物活性玻璃)具有生物兼容性和生物降解性，已被廣泛用于骨軟骨支架，特別是在改善生物礦化方面的作用有利于骨形成，但同時也增大了脆性，因此與可生物降解的聚合物復合較普遍。由瓊脂糖水凝膠/復合聚乳酸-羥基乙酸(polylactide-co-glycolide acid，PLGA)/生物活性玻璃材料復合組成的支架改善了支架的礦化作用，提高了骨軟骨修復的整合能力[8]。生物活性陶瓷材料自身的脆性可為骨形成提供良好的硬度。

1.2支架的機械性能 深入了解骨軟骨組織的機械性能有助于骨軟骨支架的設計。根據(jù)關節(jié)軟骨表面到軟骨下骨的纖維走向、細胞形態(tài)與密度、GAG及膠原含量、含水量等生物學差異及相應的力學梯度差異，可將關節(jié)骨軟骨分為淺表層、中間層(過渡層)、深層(輻射層)、鈣化層、軟骨下骨層。透明軟骨層與鈣化層交界處有一潮線結構，其將相對較軟的關節(jié)軟骨組織與相對堅硬的鈣化軟骨連接在一起,有抵抗剪切力、分散橫向應力、緊密連接骨軟骨以及限制組織液在骨軟骨界面自由交換等作用[9]。鈣化層下方為軟骨下骨平臺，兩層交錯結合錨定，形成黏合線[10]。骨軟骨組織每一層都有不同的機械強度。骨軟骨組織不匹配的黏彈性可導致軟骨組織間壓力分布不均。表面軟骨能夠承受局部壓力為0.8～2 MPa，拉伸模量為5～25 MPa，平衡剪切模量為0.05～0.25 MPa[11]。這些差異源自組成軟骨的生物和化學成分在各層結構分布的不同。

為實現(xiàn)骨軟骨組織的最佳抵抗力，表面的膠原蛋白平行于剪切方向，而中間層、深層的膠原蛋白垂直于表面。從淺表層到深層，Ⅱ型膠原和含水量呈遞減趨勢，Ⅰ型膠原與GAG含量呈遞增趨勢。由于中間層GAG含量較高，組織的滲透率也低于淺表層。因此，中間層可適度調(diào)節(jié)和緩沖來自關節(jié)的壓應力[12]。利用轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和機械刺激可以加快軟骨組織重塑的進程，并使其拉伸模量高達3.4 MPa[13-14]，但這還遠小于天然組織的拉伸模量值。骨軟骨組織就像一個無摩擦軸承，將負載轉移到骨骼以防止局部應力過大。支架能否與周圍組織良好整合以及如何保持植入物的機械穩(wěn)定性是制造低摩擦表面支架的關鍵問題。軟骨的潤滑特性來源于擠壓膜潤滑的復雜組合方式，包括彈性流體力學潤滑、邊界潤滑方式、間質液增壓、遷移接觸面潤滑等[11]。若無軟骨的摩擦系數(shù)(摩擦系數(shù)：0.005～0.02)，接觸剪切將引起巨大的磨損[15]。由聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷酮水凝膠組成的低摩擦軟骨支架具有良好的生物兼容性與負重性能[16]，但機械性能與天然軟骨組織接近的支架目前還尚未報道。

1.3支架的孔隙結構 在大部分支架中，孔隙結構會影響細胞應答，調(diào)節(jié)細胞侵襲、血管生成、組織再生等過程。支架的多孔結構的形成主要依賴于制造過程。傳統(tǒng)制備方法包括纖維粘接法、溶劑澆鑄/粒子瀝濾法、發(fā)泡法、相位分離法等[17]。使用這些技術加工的多孔支架具有適合組織工程使用的可控的孔徑大小及孔隙率。天然骨具備50%～90%的多孔環(huán)境，孔隙直徑通常為1 mm[18-19]。有學者認為，大于50%的多孔環(huán)境以及孔隙直徑為300 μm的支架結構能夠增強骨和血管的生成[20]。90～120 μm的孔隙有利于MSCs增殖形成軟骨組織[21]。

1.4支架的雙相結構及界面整合能力 多相支架能夠提供利于細胞間、細胞與基質間信號交流的最佳環(huán)境[22]。同時，整合材料能夠將軟骨層的物理或化學成分轉移至骨層。支架內(nèi)細胞間的交互作用使得骨軟骨支架中軟骨與骨相界面的整合成為可能。事實上，雙相梯度的負載細胞支架在植入手術后較非細胞支架具備更強的骨軟骨形成能力[23]。因此，具有雙相梯度的負載同源或異源細胞的骨軟骨支架經(jīng)過改進，已具有較好的機械穩(wěn)定性與整合能力。Yunos等[24]報道，通過分散同源單細胞進入雙相的數(shù)量,可以考察由靜電紡絲聚乳酸纖維作為軟骨相及聚乳酸包被生物活性玻璃支架作為骨相的雙相支架的界面整合能力。同樣，由負載瓊脂糖水凝膠的軟骨細胞及負載微球復合生物活性玻璃的成骨細胞組成的異源細胞的雙相支架也已經(jīng)開發(fā)[8]。雙相支架內(nèi)部細胞相互接觸避免各層間的分層現(xiàn)象，利于改善機械穩(wěn)定性。

2 支架的設計

2.1纖維支架 纖維支架，特別是納米纖維支架，在骨軟骨組織修復方面擁有巨大潛能。納米纖維形態(tài)很容易通過靜電紡絲技術實現(xiàn)[25]，即在強大電場環(huán)境下，聚合物溶液通過注射針注入纖維內(nèi)部，形成納米纖維狀支架。這種結構可促進細胞黏附，引導生長以及組織特異性分化[26]，并憑借可調(diào)節(jié)工藝，實現(xiàn)梯度合成，調(diào)整纖維比例以及小孔幾何結構。當納米纖維結構與超細纖維結合時，細胞接種效率與3D網(wǎng)格化效果將被改善。與附著于納米纖維狀微孔支架的MSCs比較，附著于粉末狀纖維大孔支架上的MSCs分化能力更強[27]。雖然納米纖維材料支架具備卓越的MSCs附著能力，但細胞浸潤卻受到限制。以上文獻討論的支架孔徑絕大部分<30 μm，因此不適用于根據(jù)孔徑尺寸評價骨軟骨組織的再生能力。

許多學者已經(jīng)對靜電紡絲骨軟骨支架的最佳孔隙結構展開研究。Zhang等[28]報道，50～300 μm孔徑對由膠原和靜電紡絲聚乳酸納米纖維組成的雙相支架有有利影響。孔徑<300 μm的傳統(tǒng)靜電紡絲纖維支架可能妨礙成骨，因此在骨軟骨修復過程中制備孔徑>300 μm纖維雙相支架對于骨生成是非常必要的。為了生產(chǎn)更大孔徑的支架，有學者利用飛秒脈沖激光加工技術生產(chǎn)出孔徑達500 μm的支架[29]。結合鹽浸法制備靜電紡絲纖維支架雖然增加了孔徑，但也降低了支架的機械穩(wěn)定性[25]。

快速成型技術通過計算機輔助制造系統(tǒng)與分層處理技術高度精確控制孔隙的幾何形狀，可以很容易地制造出界限明顯的3D互連孔隙結構，同時具備適當?shù)臋C械性能與生化特性[30]。Hutmacher[31]開發(fā)了一種熔融沉積模型技術制造用于骨組織工程的高孔隙度的PCL支架。這種基于計算機引導的3D繪圖技術通過加熱的噴嘴與滾筒提供預成型纖維。作為改良的熔融沉積模型技術，Woodfield等[32]發(fā)明了3D纖維沉積技術用來制備具有互通孔隙通道及高孔隙度(415 μm)的骨軟骨支架，由3D纖維沉積技術制備的支架平均連接孔徑增加到1 650 μm[33]。據(jù)推測，擁有這樣孔徑結構的支架非常適合骨軟骨組織工程。此外，Bian等[34]發(fā)明了一種光刻與凝膠澆筑相結合的技術以制備纖維雙相支架，支架由磷酸三鈣與Ⅰ型膠原構成。這種纖維雙相支架的骨相內(nèi)部孔徑大小為700～900 μm，孔隙率為50%～65%，兩相間錨定結合的特別緊密，仿生出過渡結構[34]。

2.2水凝膠支架 水凝膠是由大量水填充的親水聚合物網(wǎng)絡組成，是3D凝膠狀的天然細胞外基質(extracellular matrix,ECM)仿生物，被廣泛用作支架材料。水凝膠支架具備完整的結構與穩(wěn)定的機械性能，利于組織結構成型[35]，還能夠以可控的方式結合輸送的藥物及生長因子。因具備以上優(yōu)點，Ⅰ型膠原蛋白、明膠、GAG等黏彈性水凝膠被用于修復不規(guī)則的軟骨損傷。水凝膠的單相成分不足以模擬骨軟骨界面組織的復雜結構，其較差的機械穩(wěn)定性也不足以承載界面組織的多種運動[36]。盡管水凝膠在某種程度上增加了細胞的遷移活性以及營養(yǎng)物質向細胞轉遞的能力，但受水凝膠理化特性與單相成分引導的細胞行為與應答明顯不如典型的多孔支架指導的細胞行為與應答?？蓪椥运z制備成微球作為運載工具控釋生長因子，進而修復骨軟骨組織。無論是在體內(nèi)還是體外，支架能釋放生長因子，但含有微球體孔隙結構的支架，其機械穩(wěn)定性仍未達到骨軟骨組織的需要。雜交無機離子的雙相水凝膠支架可以增加支架的機械穩(wěn)定性。水凝膠雙相支架的梯度無機成分在ECM合成與細胞表型中具有誘導骨軟骨樣轉化的能力。Munoz-Pinto等[37]報道，采用光刻法制備雙相鈦結合聚乙二醇水凝膠水凝膠交聯(lián)梯度聚二甲基硅氧烷支架發(fā)現(xiàn)，隨著梯度無機成分的增加，ECM合成硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白增加，軟骨細胞分化相關轉錄因子sox9的水平升高，支架的機械穩(wěn)定性增加，但卻觀察到成骨細胞向軟骨細胞樣細胞轉分化的現(xiàn)象。雖然基于水凝膠開發(fā)的雙相支架經(jīng)過許多嘗試已取得成功，但由于水凝膠的微弱剪切力，雙相界面的穩(wěn)定性仍然較差。

2.3支架輸送信號分子 信號分子包含生長因子、治療藥物以及基因。骨軟骨組織工程充分利用信號分子的傳送策略促進細胞生長與組織形成。這些策略促進了智能雙相支架在骨軟骨組織工程中的發(fā)展。信號分子通過誘導作用影響骨軟骨組織中ECM的形成，同時刺激細胞連續(xù)不斷地分泌蛋白以保證細胞生長的舒適環(huán)境。在支架設計時首先要信號分子的釋放時效和劑量控制。

在骨軟骨修復的信號分子中，纖維母細胞生長因子、TGF-β在成軟骨細胞培養(yǎng)條件下能夠增強ECM形成，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)能誘導成骨細胞生成[38]。BMP-2與聚多巴胺結合涂覆在支架上可改善支架材料的細胞附著力；用于修復骨缺損時，BMP-2可以在骨缺損區(qū)域發(fā)揮長期調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)出優(yōu)異的生物活性[39]。將血管內(nèi)皮生長因子和BMPs加載到明膠/PLGA納米復合支架中可使生長因子在修復骨軟骨缺損時持續(xù)釋放，促進骨髓MSCs在支架上的黏附、增殖以及分化[40]。雖然生長因子對骨軟骨修復有影響，但這種影響受生長因子釋放時間的影響。要想獲得更可持續(xù)、更可控的釋放，需要精細設計支架，將信號分子包封入微球表面或內(nèi)部，隨后進入雙相支架中[41]。微球既可作為支架又可作為載體，是可以負載多種信號分子用于組織工程修復骨軟骨缺損的良好模型。

精確控制多種生長因子的時空釋放動力學有利于受損組織的愈合[42]。序貫生長因子遞送系統(tǒng)是指從不同理化性質的雙分子層基質釋放不同范圍的生長因子[43]。當微球復合入支架后，不同降解速率的兩種類型的微球被用來遞送兩種功能不同的生長因子[44]。Wang等[45]將一種雙載體系統(tǒng)，即負載利于骨生成的BMP-2和利于軟骨生成的胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)，引入多孔聚合物支架中。兩種生長因子被負載于PLGA/紡絲微球表面，發(fā)揮持續(xù)釋放BMP-2的作用，但IGF-1的釋放受到限制。盡管PLGA/紡絲微球MSCs的軟骨形成效率不高，但這套系統(tǒng)提供了通過時空控制實現(xiàn)生長因子共同遞送的新思路。

骨軟骨修復的基因遞送技術如非病毒陽離子聚合物或脂質體已經(jīng)被廣泛用于提高基因轉染效率的運載體的研究中。如纖維母細胞生長因子2和(或)IGF-1脂質內(nèi)源性基因遞送系統(tǒng)，成功實現(xiàn)培養(yǎng)基因修飾的軟骨細胞向骨軟骨支架的研制[46]。近年來，基因遞送系統(tǒng)已經(jīng)被進一步發(fā)展，將載體固定于支架基質表面，通過特殊靶基因有效地控制細胞分化。Chen等[47]報道，將分別編碼TGF-β1與BMP-2的兩種質粒固定于雙相支架上的MSCs中，用于區(qū)別軟骨生成與骨生成。MSCs在雙相支架中殼聚糖-明膠層具有良好的軟骨向分化能力，在羥基碳酸鹽磷灰石層具有良好的骨向分化能力。

3 小 結

理論上，骨軟骨支架需要多相結構去仿生天然的骨軟骨分層結構，但多相結構太過復雜，不易控制各相的釋放速度。雙相支架分為軟骨相和骨相，較多相支架簡單，是界定界面組織的最佳骨軟骨支架之一。盡管如此，雙相支架的兩相間仍存在機械穩(wěn)定性的問題。采用一步法制備雙相支架可以有效消除支架內(nèi)部兩相間的剪切力。但雙相支架各相內(nèi)骨及軟骨生成的能力仍然不盡如人意，這也許是各相內(nèi)細胞不能充分向骨或軟骨分化生長，不能充分釋放信號分子的原因。為克服這一問題，需要建立一個時空定位遞送系統(tǒng)。利用這個系統(tǒng)，體外培養(yǎng)每個相內(nèi)各自的細胞，以便充分識別特異的信號分子，有益于各個組織的再生。因此，在不久的將來充分利用雙相支架時空靶向遞送系統(tǒng)可以有效抵消兩相間的剪切力，解決支架生物降解的難題。