Rab6蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

王 芳，楊俊俊，徐興祥

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州 225001)

Rab蛋白是一類(lèi)小分子鳥(niǎo)苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)結(jié)合蛋白，由200個(gè)左右的氨基酸組成，相對(duì)分子量為20 000～30 000。Rab蛋白具有一些共同的結(jié)構(gòu)特征，即由保守的G結(jié)構(gòu)域和高度可變的N端和C端組成。G結(jié)構(gòu)域有5個(gè)α螺旋(A1～A5)、6個(gè)β片層(B1～B6)和5個(gè)多肽環(huán)(G1～G5)，5個(gè)多肽環(huán)具有高度保守的氨基酸序列，能連接α螺旋和β片層[1-2]。目前為止,在人類(lèi)中已發(fā)現(xiàn)70多種Rab蛋白，酵母中發(fā)現(xiàn)約11種。Rab蛋白普遍存在于所有真核生物中，作為各細(xì)胞器之間囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_(kāi)關(guān)，在真核細(xì)胞中Rab蛋白參與幾乎所有的細(xì)胞膜運(yùn)輸過(guò)程，并且通過(guò)與各種效應(yīng)器的結(jié)合，進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，進(jìn)而決定細(xì)胞的生命進(jìn)程[3-4]。Rab家族成員之間的氨基酸序列有75%～95%的相似性，其中包括Rab6。Rab6是一個(gè)與高爾基體相關(guān)聯(lián)的GTP酶，是Rab成員之一，具有Rab中最低的GTP酶活性，其水解活性為5×10-6/s[5-6]。Rab6能通過(guò)與各種效應(yīng)因子相互作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)不僅起調(diào)控作用，而且也發(fā)現(xiàn)與病原體吞噬、神經(jīng)元的功能、有絲分裂等有關(guān)[7-9]。此外也發(fā)現(xiàn)Rab6與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10-11]?，F(xiàn)從Rab6的結(jié)構(gòu)、效應(yīng)因子以及在不同疾病中的發(fā)揮的功能方面，闡述Rab6蛋白。

1 Rab6的亞型

Rab6與Ras、Rho和Ran亞家族屬于Ras超家族,是Ras超家族的一個(gè)分支，與Ras保持 30%～60%的同源性[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，Rab6含有豐富的與高爾基體相關(guān)聯(lián)的Rab蛋白，主要定位于反式高爾基體腔和管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膜上[12-14]。目前Rab6蛋白在高爾基體膜上定位的具體機(jī)制尚不十分明確?，F(xiàn)有研究表明，Rab6的定位主要取決于N端的71種氨基酸，而C端的多態(tài)性也可能有一定作用[15]。目前在人類(lèi)中已發(fā)現(xiàn)4種Rab6的亞型：Rab6A、Rab6A′、Rab6B和Rab6C(也稱(chēng)為WTH3)，而大多數(shù)生物體，如果蠅，僅有1種Rab蛋白[3]。

Rab6A和Rab6A′是最早發(fā)現(xiàn)的Rab6異構(gòu)體亞型，由同一基因選擇性剪切而來(lái)。有研究發(fā)現(xiàn)Rab6A′和Rab6A的差異僅存在于PM3保守結(jié)構(gòu)域(GTP-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)兩側(cè)的3個(gè)氨基酸之間，即Val62→lle和Thr87/Val88→Ala/Ala。Rab6A′和Rab6A定位于第11號(hào)染色體。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rab6A′和Rab6A在組織中廣泛表達(dá)，并且無(wú)明顯表達(dá)差異，但在膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中行使功能不同，具體功能尚不明確[16-17]。Rab6B亞型是一個(gè)由Rab6A′和Rab6A非剪接的復(fù)制基因，氨基酸序列與Rab6A′和Rab6A有91%的相似，只在C端存在差異。Rab6B定位于第3號(hào)染色體，在高爾基體上大量表達(dá)。有研究表明，Rab6B在神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達(dá)，但其余的Rab6亞型在神經(jīng)元中也有表達(dá)[10-19]。Rab6C作為Rab6的新亞型被發(fā)現(xiàn)，擁有單一的外顯子結(jié)構(gòu)，是一種靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物特定的逆基因。因Rab6C由RAB6A′mRNA反轉(zhuǎn)錄而來(lái)，曾被命名為RAB6A′[20]。Rab6C定位在第2號(hào)染色體上，在哺乳動(dòng)物多種組織中均有表達(dá)，現(xiàn)已在乳腺、大腦、睪丸、前列腺組織中發(fā)現(xiàn)，但由于其轉(zhuǎn)錄數(shù)量有限，所以內(nèi)源性Rab6C含量較低，呈現(xiàn)低表達(dá)。并且研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的Rab6C會(huì)使細(xì)胞在有絲分裂第一間隙期即G1期發(fā)生停滯[21]。

2 Rab6蛋白的效應(yīng)因子

與其他GTP酶一樣，Rab6蛋白具有兩種形式，鳥(niǎo)苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)為失活形式，GTP為活性形式，在發(fā)揮功能時(shí)不斷進(jìn)行GTP/GDP循環(huán)。當(dāng)Rab6蛋白結(jié)構(gòu)域上的GDP被GTP替代時(shí)，Rab6蛋白激活，活化后的Rab6-GTP通過(guò)激活和招募細(xì)胞內(nèi)Rab6的多種效應(yīng)因子，對(duì)早期內(nèi)涵體的再循環(huán)、胞吞和早期內(nèi)涵體融合等起調(diào)節(jié)作用[18]。目前多種Rab6蛋白效應(yīng)因子經(jīng)酵母雙雜交和免疫共沉淀等方法發(fā)現(xiàn)，例如Rab驅(qū)動(dòng)蛋白-6(Rabkinesin-6)、肌凝蛋白Ⅱ、動(dòng)力蛋白-動(dòng)力蛋白激活蛋白(dynein-dynactin)復(fù)合體、GTP酶激活蛋白、Rab6相互作用蛋白1(Rab6-interacting protein 1,Rab6IP1)、Rab6相互作用蛋白2(Rab6-interacting protein 2,Rab6IP2)、β淀粉樣前體蛋白結(jié)合蛋白3等[22]。

Rabkinesin-6定位在高爾基體上，與Rab6A相互作用，能夠參與高爾基體沿微管到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的反向運(yùn)輸。雖然Rabkinesin-6不能與Rab6A′相互作用，但沉默Rab6A′或Rab6A后，高爾基體形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，從而影響高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)循環(huán)[18]。一種特殊的肌凝蛋白Ⅱ，作為Rab6效應(yīng)蛋白，能參與囊泡在高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。Miserey-Lenkei等[24]發(fā)現(xiàn)Rab6A′/A在活性狀態(tài)下能直接將肌凝蛋白Ⅱ招募到高爾基體上，在肌動(dòng)蛋白(actin)的協(xié)助下完成囊泡的分裂。

Bicaudal-D(BICD)和dynein-dynactin復(fù)合體同作為Rab6的效應(yīng)蛋白，當(dāng)BICD被位于高爾基體上的Rab6識(shí)別后，通過(guò)與pl50Glued互相作用，招募dynein-dynactin復(fù)合體到高爾基體上，從而介導(dǎo)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的運(yùn)輸。pl50Glued作為dynactin復(fù)合體的一個(gè)亞基，與Rab6A′/A作用后和微管相連，使囊泡能夠在微管上移動(dòng)，最后通過(guò)效應(yīng)蛋白R(shí)ab6IP2協(xié)助囊泡與細(xì)胞膜錨定融合。雖然Rab6A′/A參與到高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的運(yùn)輸，但Rab6A并不是必需的[18]。

3 Rab6蛋白的功能

3.1Rab6調(diào)控細(xì)胞吞噬 細(xì)胞吞噬是生物體最基本的防衛(wèi)機(jī)制之一，是宿主消化病原的直接途徑。細(xì)胞吞噬是單細(xì)胞動(dòng)物攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要途徑，但是在多細(xì)胞動(dòng)物中，部分細(xì)胞特化為吞噬細(xì)胞，能利用吞噬作用來(lái)殺死和消除病原體以及損傷組織，來(lái)保持自身的穩(wěn)定和對(duì)外防御[25]。吞噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，主要由于actin的聚集導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變引起。而actin的聚集是由于小G蛋白的磷酸化傳導(dǎo)信號(hào)介導(dǎo)的[26]。由此可以看出，小G蛋白家族在細(xì)胞吞噬中起到了重要的作用。在對(duì)蝦抗病毒免疫研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Rab6蛋白優(yōu)先與對(duì)蝦白斑綜合征病毒的膜蛋白VP466(對(duì)蝦白斑綜合征病毒的膜蛋白)結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致actin聚集，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞吞噬活性，抑制病毒感染；但是當(dāng)原肌球蛋白優(yōu)先和VP66蛋白結(jié)合時(shí)，actin構(gòu)象朝利于病毒感染的方向變化，進(jìn)而促進(jìn)病毒感染[27-29]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞和果蠅S2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，Rab6通過(guò)與actin相互作用影響actin骨架的構(gòu)象來(lái)調(diào)控吞噬[28]。由此推測(cè)Rab6蛋白在無(wú)脊椎動(dòng)物吞噬過(guò)程中起作用。為探究Rab6蛋白是否在哺乳動(dòng)物吞噬過(guò)程中起作用，Chen等[9]用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用小干擾RNA沉默基因，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Rab6被敲低時(shí)，巨噬細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌消化率下降，而Rab6過(guò)表達(dá)時(shí)使消化率提高20%。由此說(shuō)明Rab6調(diào)控巨噬細(xì)胞`殺死和消化金黃色葡萄球菌過(guò)程中起積極作用。此研究還證實(shí)，BICD1在作為BICD的同源異構(gòu)體的同時(shí)，也作為Rab6的效應(yīng)蛋白，與Rab6行使相同的功能，參與物質(zhì)在細(xì)胞膜之間的轉(zhuǎn)運(yùn)，且在吞噬小體的成熟過(guò)程中起作用。

3.2Rab6與神經(jīng)元功能 神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位，能夠接受、整合和傳遞信息。兩個(gè)神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與效應(yīng)器細(xì)胞之間通過(guò)突觸相互聯(lián)系。為了識(shí)別影響突觸特異性的新成分，Tong等[8]通過(guò)在果蠅眼睛中進(jìn)行正向基因篩選，發(fā)現(xiàn)rich蛋白在突觸形成識(shí)別過(guò)程中起作用。當(dāng)rich蛋白缺失后，受體細(xì)胞中神經(jīng)鈣黏素會(huì)隨之減少，此時(shí)神經(jīng)元突觸形成就缺乏了特異性。而Rab6蛋白能調(diào)節(jié)神經(jīng)鈣黏素的運(yùn)輸，當(dāng)rich蛋白激活Rab6蛋白時(shí)，對(duì)突觸正常的形成有影響。由此說(shuō)明Rab6與果蠅視覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程有關(guān)。

Schlager等[30]發(fā)現(xiàn)BICD相關(guān)蛋白1(BICD-related protein 1, BICD-R1)也是Rab6的效應(yīng)蛋白，同時(shí)是一個(gè)序列與BICD同源的蛋白，與神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。在神經(jīng)元分化早期，BICD-R1表達(dá)量很高，將Rab6分泌小泡聚集在中心體周?chē)?，既能阻止Rab6分泌小泡運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)突，又能防止神經(jīng)元過(guò)早成熟。在神經(jīng)元分化后期，BICD-R1表達(dá)量明顯減少，允許Rab6分泌小泡順行運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)突，促進(jìn)神經(jīng)元成熟。

科恩綜合征相關(guān)蛋白-1(Cohen syndrome-associate protein 1, COH1)作為骨架蛋白在高爾基體功能及形態(tài)的維持中起重要作用。Seifert等[10]用小干擾RNA干擾Rab6A和Rab6A′表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)干擾Rab6A和Rab6A′表達(dá)會(huì)阻止COH1定位到高爾基體上，說(shuō)明COH1可能是Rab6的效應(yīng)蛋白之一。此實(shí)驗(yàn)還證實(shí)單獨(dú)降低COH1或Rab6的表達(dá)會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，說(shuō)明在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中Rab6 和CHO1起到了一定的作用。

3.3Rab6調(diào)控有絲分裂 細(xì)胞分裂有多種不同分裂方式，而有絲分裂是其中一種。真核細(xì)胞能通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生體細(xì)胞。細(xì)胞有絲分裂是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，且具有周期性并受到嚴(yán)格的調(diào)控，整個(gè)分裂過(guò)程分為前期、中期、后期和末期。當(dāng)敲除細(xì)胞中Rab6A′時(shí)，有絲分裂中期出現(xiàn)阻滯，說(shuō)明有絲分裂的正常運(yùn)行需要Rab6A′的參與。當(dāng)Rab6A′功能異常時(shí)，Mad2作為紡錘體檢查點(diǎn)蛋白被激活，導(dǎo)致有絲分裂在細(xì)胞中期停滯，說(shuō)明Rab6A′能運(yùn)輸Mad2蛋白脫離著絲粒，使細(xì)胞分裂進(jìn)程繼續(xù)[7]。

Rab6 GAP CenA作為Rab6的效應(yīng)蛋白，多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)位于中心小體上，在細(xì)胞間期起作用，與胞質(zhì)γ-微管蛋白形成復(fù)合體后，對(duì)微管的成核起到一定作用。Rab6A′能通過(guò)GTP酶激活蛋白互相作用參與細(xì)胞分裂中期到后期的轉(zhuǎn)換[7,31]。

Rabkinesin6作為Rab6的驅(qū)動(dòng)蛋白，分裂后期在紡錘體中部聚集，分裂末期聚集在溢裂溝和中間體上，在細(xì)胞分裂期表達(dá)量增多，與Rab6A相互作用參與細(xì)胞有絲分裂。Rabkinesin6過(guò)表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞分裂缺陷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[32]。

有研究顯示，Rab6不僅影響果蠅卵母細(xì)胞的極性，而且參與果蠅卵母細(xì)胞的發(fā)生，介導(dǎo)mRNA與細(xì)胞骨架的運(yùn)輸。Hou等[33]和Ma等[34]敲低小鼠卵母細(xì)胞中的Rab6A時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞第一極體(pb1)排出率較對(duì)照組明顯下降；激光共聚焦結(jié)果顯示，Rab6A影響染色體的中板排列。由此推測(cè)Rab6A與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂有關(guān)。此外，這些研究還證實(shí)Rab6A能夠顯著影響減數(shù)分裂過(guò)程中皮質(zhì)顆粒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布。由此推測(cè)，Rab6A的敲低可能通過(guò)影響囊泡向膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸，從而造成皮質(zhì)顆粒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常。

4 Rab6與相關(guān)疾病

微RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤近年的研究中受到了較多關(guān)注。miRNA發(fā)揮著類(lèi)似癌基因和抑癌基因的作用，能調(diào)控個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞分化等各項(xiàng)生命活動(dòng)。通過(guò)改變miR-5100 和miR-218的下游靶基因Rab6的表達(dá)，其能發(fā)揮抑癌基因的作用。Huang等[11]在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299中發(fā)現(xiàn)miR-5100表達(dá)明顯增加，體外實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)miR-5100會(huì)導(dǎo)致Rab6表達(dá)下降，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖與克隆的形成。該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)miR-5100與Rab6的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致Rab6表達(dá)下降，從而發(fā)揮致癌基因的作用。何龍等[35]在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498和769-P荷瘤裸鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，在裸鼠中過(guò)表達(dá)miR-218時(shí)，荷瘤后腫瘤的生長(zhǎng)較慢，體重降低速度減慢。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，Rab6C的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，說(shuō)明miR-218能通過(guò)Rab6C調(diào)控腎癌細(xì)胞，且Rab6C與miR-218的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

化療耐藥是目前惡性腫瘤臨床治療失敗的主要原因之一。Rab6蛋白與腫瘤耐藥相關(guān)。Shan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在多重耐藥子宮肉瘤細(xì)胞株中，降低Rab6的表達(dá)，會(huì)增加對(duì)阿霉素的敏感性。但對(duì)HEK293細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，降低Rab6表達(dá)時(shí)，其對(duì)阿霉素的耐藥性比野生型增高3～7倍，然而增加Rab6表達(dá)時(shí)卻會(huì)促進(jìn)HEK293細(xì)胞凋亡[36]。Tian等[37]從乳腺癌患者胸腔積液中分離的耐藥細(xì)胞株及原代腫瘤細(xì)胞，在體外對(duì)Rab6C進(jìn)行甲基化修飾，發(fā)現(xiàn)耐藥的細(xì)胞株轉(zhuǎn)為對(duì)化療藥物敏感的細(xì)胞系。近來(lái)在肺癌干細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299研究中發(fā)現(xiàn)，miR-5100可以抑制Rab6的表達(dá)，從而降低對(duì)順鉑的敏感性[38]。

上述研究提示，在多種腫瘤研究中，Rab6的表達(dá)各有不同，但目前多數(shù)結(jié)果提示在腫瘤細(xì)胞中降低Rab6表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和克隆[11,36,38]。但陳玉磊[39]為了探索Rab6蛋白是否對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響腫瘤的形成和發(fā)展，將巨噬細(xì)胞中的Rab6敲低后與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞中的Rab6蛋白對(duì)腫瘤的遷移等過(guò)程無(wú)顯著影響。由此，猜測(cè)Rab6蛋白可能對(duì)于腫瘤的形成與發(fā)展并沒(méi)有直接關(guān)系。

阿爾茨海默病是累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元變性疾病，病理特征為神經(jīng)元數(shù)目減少、β淀粉樣蛋白沉積形成老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬錐體細(xì)胞顆粒空泡變性等[40]。McConlogue等[41]發(fā)現(xiàn)降低Rab6的表達(dá)會(huì)抑制β淀粉樣蛋白的形成，說(shuō)明Rab6與阿爾茨海默病之間存在某種聯(lián)系。并且目前有研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病患者腦中Rab6的表達(dá)量是正常人的5倍，Rab6與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在一定關(guān)聯(lián)，當(dāng)阿爾茨海默病患者腦中Rab6表達(dá)下降時(shí)會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，但過(guò)表達(dá)會(huì)減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[42-43]。上述研究提示Rab6可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過(guò)程導(dǎo)致阿爾茨海默病的發(fā)生，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

5 展 望

Rab蛋白通過(guò)與效應(yīng)子結(jié)合完成囊泡在各細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)運(yùn)，但這些效應(yīng)蛋白如何在不同的細(xì)胞器上被識(shí)別，是否還有未發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)蛋白，Rab6除了在調(diào)控細(xì)胞自噬、影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、調(diào)節(jié)有絲分裂方面起作用外，還有哪些功能仍有待進(jìn)一步的探究。此外，Rab6蛋白不僅參與了多種腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖、凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及藥物耐受，并且在阿爾茨海默病患者中也起一定的作用，但Rab6蛋白在疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制尚不清楚。因此，Rab6蛋白新的功能及作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探索。