黔產(chǎn)辣蓼的顯微鑒別與金屬元素的檢測研究

王東艷，唐 超，廖彬汛，羅 俊，潘年松

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理教研室，貴州 貴陽 550004；2. 遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州 遵義 563002；3. 黔西南州人民醫(yī)院，貴州 興義 562400）

辣蓼（Polygonum flaccidumMeissn.），又稱水蓼、柳蓼、蓼牙菜[1]，為蓼科植物伏毛蓼Polygonum pubescensBlume 的干燥全草。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為其性味辛，溫?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗微生物、殺蟲、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[2-3]。辣蓼作為常用的中草藥，也廣泛應(yīng)用于小曲酒和黃酒的釀造[4]。貴州屬于喀斯特地貌，重金屬含量較高，其地形對(duì)辣蓼的根、莖、葉和種子的形態(tài)特征是否有影響需進(jìn)一步探討，辣蓼的重金屬含量是否符合標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)乎黔產(chǎn)辣蓼的用藥安全性問題。故本實(shí)驗(yàn)將考察黔產(chǎn)辣蓼的形態(tài)特征，并檢測金屬元素含量，為黔產(chǎn)辣蓼的藥用安全性評(píng)價(jià)及綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

數(shù)碼顯微鏡BA31ODigital（麥克奧迪）；WX- 8000 微波快速消解儀（上海屹堯）；iCAP-7000電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（美國Thermo Fisher Scientifc）；SAGA超純水處理機(jī)（南京易普易達(dá)）；搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械）；萬分之一電子天平，十萬分之一電子分析天平（梅特勒托利多）。水合氯醛，丙三醇，硝酸和過氧化氫（優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家有色金屬及電子材料分析測定中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材

黔產(chǎn)辣蓼，采于遵義市湄潭縣復(fù)興鎮(zhèn)遵義綠普森農(nóng)業(yè)有限公司種植基地。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

選取新鮮辣蓼的根、莖、葉，徒手切片法制片，置載玻片上滴加水合氯醛試液在酒精燈上加熱透化后，滴加甘油乙醇試液，制成臨時(shí)切片，于顯微鏡下觀察顯微特征。

2.1.1 莖橫切面 辣蓼莖橫切面：表皮細(xì)胞1列，外被角質(zhì)層，皮層由薄壁細(xì)胞構(gòu)成，多呈厚角組織狀。韌皮部較窄，韌皮纖維束月牙形，位于維管束上方排列呈環(huán)狀，維管束呈環(huán)狀排列。由單個(gè)或數(shù)個(gè)導(dǎo)管聚集的木質(zhì)部，呈放射狀排列。木射線較寬，髓由薄壁細(xì)胞組成，為類圓形，髓中細(xì)胞逐漸消失形成空洞，見圖1。

圖1 辣蓼莖橫切面（40×）

2.1.2 辣蓼葉表面觀 辣蓼上表皮細(xì)胞不規(guī)則多角形，垂周壁較平直，其下有類圓形的分泌細(xì)胞；下表皮細(xì)胞垂周壁波狀彎曲；上下表皮均有氣孔、腺毛及非腺毛，以下表皮較多。氣孔為平軸式橢圓形，少數(shù)不定式或不等式，副保衛(wèi)細(xì)胞常為2～4個(gè)。見圖2。

圖2 辣蓼葉表面觀（100×）

2.1.3 葉橫切面 辣蓼葉橫切面：上下表皮細(xì)胞呈類方形，上表皮一層，具有較厚的角質(zhì)層，下表皮氣孔較上表皮多。柵欄組織位于上表皮之下，細(xì)胞呈圓柱型，葉肉細(xì)胞內(nèi)含草酸鈣簇晶，維管束外韌型，木質(zhì)部發(fā)達(dá)，導(dǎo)管單個(gè)徑向排列。韌皮部細(xì)胞多角形，木質(zhì)部上方及韌皮部下方均有纖維。見圖3。

圖3 辣蓼葉橫切面（100×）

圖4 辣蓼根橫切面（100×）

2.1.4 根橫切面 辣蓼根橫切面：木栓層為數(shù)列棕色的木栓細(xì)胞，其皮層較寬，細(xì)胞排列疏松，有明顯的細(xì)胞間隙，韌皮部由數(shù)列類橢圓形的薄壁細(xì)胞組成。木質(zhì)部寬廣，導(dǎo)管較大，射線細(xì)胞2～3列，木纖維緊密排列，見圖4。

2.2 重金屬含量檢測

2.2.1 樣品前處理及微波消解 將不同月份的辣蓼分別用自來水、雙蒸水、去離子水清洗干凈，烘干，粉碎，過藥典3號(hào)篩，備用。精密稱取0.2100 g待測樣品于50 ml密閉式聚四氟乙烯的微波消解罐中，加入3 ml硝酸在智能控溫電加熱器中預(yù)消解3 h后，再加入1 ml過氧化氫，置于設(shè)定的微波消解條件下進(jìn)行消解。消解完畢后，冷卻至室溫，打開消解罐，用少量超純水沖洗上蓋內(nèi)壁，合并至罐中。置消解罐中于140～160 ℃智能控溫電加熱器中趕酸，待趕酸完全后，再用超純水洗滌消解罐3～5次，洗液合并置入50 ml塑料量瓶，用水定容至25 ml，同法制備空白溶液備用，待測。微波消解程序見表1 。

表1 微波消解程序

2.2.2 ICP-OES儀器工作參數(shù) ICP 射頻功率1200 W，等離子體氣(氬氣)流速15 L/min，霧化氣流速0.6 L/min，低波范圍10，高波范圍7，輔助氣流速0.5 L/min，樣品沖洗30 s，重復(fù)測定次數(shù)為3次，分析泵速為50 r/min，霧化器壓力0.2 MPa，等離子觀測方式：水平觀測。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取2 ml含有多元素標(biāo)準(zhǔn)溶（100 μg/ml），用10 %的硝酸定容至200 ml，制成1 μg/ml多元素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密量取多元素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，用2 %硝酸溶液稀釋制成每1 ml含銀(Ag)、鋁(Al)、砷(As)、鋇(Ba)，鈣(Ca)、鎘(Cd)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鎵(Ga)、鍺(Ge)、汞(Hg)、鉀(K)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鉬(Mo)、鋰(Ni)、鉛(Pb)、銻(Sb)、錫(Sn)、鋅(Zn) 0，50，100，200，500 ng/ml系列濃度的混合溶液。待ICPOES儀器在最佳條件下穩(wěn)定30 min后，先以配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液建立工作曲線進(jìn)行校正，再測定樣品溶液。在各元素的最佳分析波長下，對(duì)空白試液溶液連續(xù)測定10次，將標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作為各元素的檢出限，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X（ng/ml）為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定其相關(guān)系數(shù)（r）及RSD，結(jié)果見表2。

表2 元素線性關(guān)系考察結(jié)果（n=10）

2.2.4 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 取消化好的辣蓼樣品，分別加入一定已知濃度待測元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各元素加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 各元素加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.2.5 含量檢測 稱取不同月份辣蓼的中草藥粉末（過3號(hào)篩）約0.2 g，精密稱取，按2.2.1方法制備供試品溶液，按2.2.2的ICP-OES測定條件進(jìn)行測定，在測定過程中，每測完一個(gè)樣品，用5 %硝酸霧化沖洗后再進(jìn)行下一個(gè)樣品的測定。在同樣的分析條件下進(jìn)行空白扣減試驗(yàn)，根據(jù)儀器要求扣除空白干擾，得到各元素的含量。結(jié)果見表4。

3 討論

不同品種、不同基源的中藥材在顯微結(jié)構(gòu)上會(huì)有明顯差異，可作為中藥材種屬鑒定的重要依據(jù)。全國各地有將下列五種同屬植物作為辣蓼用：叢枝蓼、長鬃蓼、酸模葉蓼、多穗蓼、蠶蟲草[5]。本實(shí)驗(yàn)采用了顯微鑒別法對(duì)基地辣蓼的根、莖、葉等顯微特征進(jìn)行了系統(tǒng)研究，辣蓼的莖部結(jié)節(jié)膨大，根的維管束寬廣，可見中柱鞘纖維成束；莖的橫切面中木質(zhì)部導(dǎo)管呈放射狀排列，髓部細(xì)胞大，中心部分常呈空隙；葉的上下表皮均有多列性非腺毛、腺毛及氣孔，以下表皮較多，氣孔平軸式，少數(shù)不定式或不等式。可用于基地產(chǎn)辣蓼根、莖、葉的顯微鑒別。

表4 不同月份辣蓼中22種痕量元素含量/mg·kg-1

根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]方法，本實(shí)驗(yàn)采用硝酸和過氧化氫3:1的組合對(duì)樣品進(jìn)行微波消解的前處理方法，可完全消解樣品至澄清的液體，所用試劑及微波消解方法較安全、有效、不易造成消解損等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用微波消解-電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-OES）直接測定樣品中的元素含量，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，工作曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.995，該方法快速簡便，穩(wěn)定性好，可滿足大部分元素的檢測要求。由表3可見，辣蓼中微量元素含量豐富，不同月份的辣蓼樣品中Ca、K、Mg、Ag、Mn、Fe、Al、Zn元素含量較高，各元素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0. 244 %～2.681 %之間。重金屬的含量超標(biāo)是中藥不良反應(yīng)中最突出的問題之一[8-9]。參照2015年版《中國藥典》[10]和我國對(duì)外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部頒布的《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[11]重金屬及砷鹽限量指標(biāo)，As≤2.0 mg/kg，Pb≤5.0 mg/kg，Hg≤0.2 mg/kg，Cu≤20.0 mg/kg，Cd≤0.3 mg/kg，由表3可見，不同月份辣蓼中的As、Cu、Hg、Cd、Pb含量均符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》。本研究通過測定不同月份辣蓼中的重金屬及痕量元素含量，為基地產(chǎn)辣蓼的質(zhì)量控制及檢測提供參考依據(jù)。