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    重組腈水解酶催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸

    2019-02-15 08:31:34李恩杰湯曉玲吳哲明鄭仁朝
    生物加工過(guò)程 2019年1期
    關(guān)鍵詞:普瑞水解酶底物

    李恩杰,湯曉玲,吳哲明,鄭仁朝

    (浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

    腈水解酶(nitrilase,EC 3.5.5.1)是一類(lèi)重要的生物催化劑,能一步催化腈類(lèi)化合物合成相應(yīng)的羧酸和氨[1-3]。腈水解酶在自然界中廣泛存在于真菌、細(xì)菌和植物體中[4],具有反應(yīng)條件溫和、特異性高和立體選擇性嚴(yán)格等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。腈水解酶的高立體選擇性、高催化活力等特點(diǎn)使其在制備手性羧酸中具有明顯優(yōu)勢(shì)[7-9],廣泛應(yīng)用于維生素、有機(jī)酸、氨基酸等化工產(chǎn)品和醫(yī)藥中間體的生物合成[10-12]。

    普瑞巴林(Pregabalin)化學(xué)名為(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸,是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。普瑞巴林為受體激動(dòng)調(diào)節(jié)劑,能有效降低電壓對(duì)鈣離子通道的依賴(lài)性,從而減少神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,對(duì)治療神經(jīng)痛以及抗癲癇效果良好[13]。由于普瑞巴林良好的治療效果和適應(yīng)證的擴(kuò)大[14-15],自2005年批準(zhǔn)上市以來(lái),其銷(xiāo)售額逐年遞增,2017年全球銷(xiāo)售額達(dá)到50.65億美元,列全球最暢銷(xiāo)藥物榜第13位,已成為“重磅炸彈藥物”。

    普瑞巴林S型異構(gòu)體的藥理活性是R型異構(gòu)體的10倍[16]。因此,手性中心的高效構(gòu)筑是普瑞巴林合成的關(guān)鍵[17]。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了大量普瑞巴林及其中間體的化學(xué)合成方法,但存在工藝步驟復(fù)雜、拆分試劑昂貴和“三廢”排放高等缺陷,限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。如第一代普瑞巴林合成工藝以等濃度的(S)-扁桃酸為拆分試劑,總收率僅為20%,75%原材料變廢棄物[18]。生物催化法因其高立體選擇性、高催化效率和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),在手性藥物合成中的潛力巨大。如Xie等[19]篩選獲得Arabidopsisthaliana腈水解酶AtNit1,能夠高選擇性水解外消旋異丁基丁二腈(IBSN)合成普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸,轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%,產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值(e.e.值)可達(dá)97%。但是AtNit1底物耐受性差,且活力較低[20]。Chaudhari等[21]利用腈水解酶水解外消旋3-氨甲基-5-甲基已腈制備普瑞巴林,但該合成路線(xiàn)的底物獲得困難,難以規(guī)?;瘧?yīng)用。因此,挖掘高立體選擇性、高活力的生物催化劑對(duì)于實(shí)現(xiàn)普瑞巴林的生物不對(duì)稱(chēng)合成具有重要意義。

    本研究以來(lái)源于Brassicarapasubsp.的重組腈水解酶BrNit為催化劑,優(yōu)化其水解IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的反應(yīng)條件,以期為普瑞巴林的高效合成奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種與培養(yǎng)基

    腈水解酶基因NIT6,由生工生物工程(上海)有限公司合成;pET28b(+)表達(dá)載體,Novagen公司;大腸桿菌BL21(DE3),Invitrogen公司。實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。

    1.2 試劑

    蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉,Oxoid公司;卡那霉素(Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),上海生工生物工程股份有限公司。其他試劑均為市售分析純。

    1.3 重組腈水解酶工程菌BrNit的構(gòu)建

    將表達(dá)載體pET28b(+)和合成的腈水解酶基因(源于B.rapasubsp.,登錄號(hào):BAG72074.1)分別用XbaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物用T4連接酶在16 ℃下連接16 h,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b(+)-NIT6。將表達(dá)載體pET28b(+)-NIT6轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)獲得基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-NIT6。

    1.4 重組腈水解酶靜息細(xì)胞的制備

    從活化平板上挑取單菌落至裝有50 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)的250 mL搖瓶中,在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)7 h。按2.0%的接種量接種至100 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)中,在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)2 h至OD600為0.6左右,加入0.1 mmol/L的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),在28 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集菌體(8 000 r/min離心10 min,4 ℃),經(jīng)0.9%的生理鹽水洗滌后,收集菌體存放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 pH對(duì)水解反應(yīng)的影響及pH穩(wěn)定性

    研究不同pH對(duì)BrNit水解反應(yīng)的影響,分別為磷酸鈉緩沖液(pH 6.0~7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5~9.0)和Gly-NaOH緩沖液(pH 9.0~10.0),濃度都為100 mmol/L。反應(yīng)體系:10 mL各緩沖液,150 mmol/L IBSN,10 g/L濕菌體,在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min,氣相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)化率和e.e.值。以最高酶活為100%計(jì)算。

    分別考察在pH 8.0和9.0條件下BrNit的穩(wěn)定性,取濕菌體重懸于pH 8.0和pH 9.0的Tris-HCl緩沖液中(質(zhì)量濃度30 g/L),于4 ℃下保存,每隔一定時(shí)間取出菌懸液加入到Tris-HCl緩沖液中,使菌體終質(zhì)量濃度為10 g/L,并調(diào)節(jié)pH至8.0,加入IBSN至終濃度150 mmol/L,在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min,取樣進(jìn)行氣相檢測(cè)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、ln(殘留酶活)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性擬合,計(jì)算不同pH下BrNit的失活速率常數(shù)(Kd)和半衰期(t1/2),計(jì)算見(jiàn)式(1)~(2)。

    (1)

    (2)

    式中:[E]為t時(shí)刻的酶活,[E0]為初始酶活,Kd為一級(jí)反應(yīng)失活常數(shù),Xt為時(shí)間。

    1.6 溫度對(duì)水解反應(yīng)的影響及溫度穩(wěn)定性

    考察不同溫度對(duì)BrNit水解反應(yīng)的影響,反應(yīng)體系:10 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0),濕菌體10 g/L,IBSN濃度150 mmol/L,150 r/min下反應(yīng)30 min,氣相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)化率和e.e.值。以最高酶活為100%計(jì)算。

    分別考察30和35 ℃下BrNit的溫度穩(wěn)定性,取濕菌體懸于Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中(終質(zhì)量濃度10 g/L),置于30和35 ℃下保溫,每隔一定時(shí)間取出10 mL菌懸液,加入IBSN至終濃度150 mmol/L,在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min,取樣進(jìn)行氣相檢測(cè)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、ln(殘留酶活)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性擬合,計(jì)算不同溫度下BrNit的失活速率常數(shù)(Kd)和半衰期(t1/2)。

    1.7 金屬離子對(duì)水解反應(yīng)的影響

    考察金屬離子對(duì)BrNit催化IBSN水解的影響。反應(yīng)體系:10 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0),濕菌體10 g/L,IBSN濃度150 mmol/L,加入金屬離子至終濃度5 mmol/L,在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)3 h,氣相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)化率和e.e.值。以不添加任何金屬離子為參比。

    1.8 底物濃度對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化速率的影響

    考察底物濃度對(duì)BrNit轉(zhuǎn)化速率的影響,反應(yīng)體系:10 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0),濕菌體10 g/L,加入不同濃度的底物至反應(yīng)體系底物的終濃度為20~200 mmol/L,在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min,氣相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)化率和e.e.值。

    1.9 底物、產(chǎn)物分析方法

    反應(yīng)液中底物、產(chǎn)物的光學(xué)純度由氣相色譜法測(cè)定。氣相色譜儀為6890N(Agilent公司),色譜柱為毛細(xì)管柱BGB-174(BGB Analytik公司)。載氣為高純He,載氣流量1.6 mL/min,分流比為30∶ 1,檢測(cè)器、進(jìn)樣口的溫度為220 ℃。柱溫初始溫度為120 ℃,保持14 min,再以10 ℃/min升溫至170 ℃保持9 min。根據(jù)e.e.值計(jì)算底物、產(chǎn)物濃度及轉(zhuǎn)化率(c)[22]。

    取反應(yīng)液200 μL,加入50 μL 2 mol/L HCl終止反應(yīng),加入800 μL乙酸乙酯萃取,12 000 r/min振蕩1 min后離心,取上清液至1.5 mL離心管中,加無(wú)水Na2SO4干燥。取有機(jī)相,再加入15 μL純甲醇和30 μL重氮甲烷,進(jìn)行氣相色譜分析。

    酶活定義:在30 ℃、pH 8.0條件下,每分鐘產(chǎn)生1 μmol 的3-氰基-5-甲基己酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 pH對(duì)水解反應(yīng)的影響及pH穩(wěn)定性

    pH的改變可能會(huì)使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而影響酶分子的催化部位和結(jié)合部位,另外,pH的改變還會(huì)影響底物分子的解離狀態(tài),進(jìn)而影響底物與酶的結(jié)合[23]。在不同緩沖體系下pH對(duì)BrNit水解IBSN的影響結(jié)果如圖1所示。

    由圖1可知:pH 8.0時(shí)活力最高,e.e.值達(dá)到98.2%。在pH為7.0~9.0弱堿性環(huán)境下,活力變化不明顯,表明BrNit比較適合在中性以及弱堿性環(huán)境下反應(yīng)。

    圖1 pH對(duì)BrNit酶活和立體選擇性的影響Fig.1 Effects of pH on activity and enantioselectivityof BrNit

    進(jìn)一步對(duì)BrNit在pH 8.0和9.0條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,結(jié)果如圖2所示。

    由圖2可知:BrNit在pH 8.0和9.0條件下的半衰期分別是24.8 h和17.1 h。因此選擇pH 8.0為最適pH。

    圖2 BrNit的pH穩(wěn)定性Fig.2 pH stability of BrNit

    2.2 溫度對(duì)水解反應(yīng)的影響及溫度穩(wěn)定性

    在一定溫度范圍內(nèi),酶的活力會(huì)隨著溫度的升高而增高,但是當(dāng)溫度高于最適溫度時(shí),酶的結(jié)構(gòu)可能會(huì)被破壞而使酶的活力下降[24]。因此,筆者研究溫度(20~50 ℃)對(duì)BrNit水解IBSN的影響,結(jié)果如圖3所示。

    由圖3可知:溫度對(duì)e.e.值幾乎沒(méi)有影響,BrNit在30 ℃時(shí)酶活最高,且30 ℃時(shí)產(chǎn)物的e.e.值達(dá)到98.3%,而35 ℃時(shí)的酶活僅為30 ℃時(shí)的71%,表明該腈水解酶對(duì)溫度較為敏感。

    進(jìn)一步對(duì)不同溫度下BrNit的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,結(jié)果如圖4所示。

    由圖4可知:BrNit在30和35 ℃下的半衰期分別為17.4和13.1 h。由此可知,BrNit在30 ℃下的穩(wěn)定性較好,30 ℃為最適反應(yīng)溫度。

    圖3 溫度對(duì)BrNit酶活和立體選擇性的影響Fig.3 Effects of temperature on activity andenantioselectivity of BrNit

    圖4 BrNit的溫度穩(wěn)定性Fig.4 The thermal stability of BrNit

    圖5 金屬離子對(duì)BrNit轉(zhuǎn)化率和立體選擇性的影響Fig.5 Effects of metal ions on conversion rate andenantioselectivity of BrNit

    2.3 金屬離子對(duì)細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

    有些金屬離子可以起到穩(wěn)定酶的構(gòu)象的作用,可參與電子傳遞從而對(duì)催化反應(yīng)產(chǎn)生影響[25]。筆者考察不同金屬離子對(duì)BrNit水解IBSN的影響,結(jié)果如圖5所示。

    由圖5可知:幾乎沒(méi)有金屬離子對(duì)BrNit的催化反應(yīng)有促進(jìn)作用,F(xiàn)e3+、Ni2+、Zn2+、Fe2+和Cu2+對(duì)其活力有明顯抑制作用,其中Zn2+、Fe2+和Cu2+抑制更為嚴(yán)重;Zn2+、Cu2+為巰基結(jié)合型金屬離子[26],其嚴(yán)重的抑制作用說(shuō)明巰基對(duì)該腈水解酶的水解反應(yīng)至關(guān)重要,所以在后續(xù)反應(yīng)中沒(méi)添加任何金屬離子。

    2.4 底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響

    底物耐受性是工業(yè)生物催化過(guò)程中的重要指標(biāo)之一。在一定催化劑濃度下,反應(yīng)速率隨著底物濃度的增加而增加,但是底物濃度過(guò)高則會(huì)使酶的活力下降,甚至對(duì)其選擇性也會(huì)產(chǎn)生影響[27]。筆者考察底物濃度對(duì)反應(yīng)速率(v)的影響,結(jié)果如圖6所示。

    由圖6可知,底物濃度的變化對(duì)該酶選擇性幾乎沒(méi)有影響。當(dāng)?shù)孜飶?0 mmol/L增至180 mmol/L時(shí),初始反應(yīng)速率顯著增加,從0.3 mmol/(L·h)增加到2.98 mmol/(L·h)。當(dāng)?shù)孜餅?00 mmol/L時(shí),反應(yīng)速率下降為2.7 mmol/(L·h),表明高底物濃度對(duì)酶活力產(chǎn)生抑制。因此,選擇180 mmol/L為最適底物濃度。

    圖6 底物濃度對(duì)BrNit反應(yīng)初速率和立體選擇性的影響Fig.6 Effects of concentration of IBSN on initial reactionrate and enantioselectivity of BrNit

    圖7 BrNit水解IBSN反應(yīng)進(jìn)程Fig.7 Progress of hydrolysis of IBSN by BrNit

    2.5 全細(xì)胞生物催化選擇性水解IBSN反應(yīng)進(jìn)程

    考察在最適反應(yīng)條件下,全細(xì)胞生物催化選擇性水解IBSN的反應(yīng)進(jìn)程,結(jié)果如圖7所示。

    由圖7可知:隨著反應(yīng)的進(jìn)行,產(chǎn)物的e.e.值基本保持不變,始終保持在97%以上,反應(yīng)到6 h時(shí),轉(zhuǎn)化率達(dá)到45.1%,e.e.值達(dá)到97.9%。

    3 結(jié)論

    利用重組腈水解酶工程菌催化IBSN水解合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸,對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。BrNit菌體最適溫度為30 ℃,最適pH為8.0,最適底物濃度為180 mmol/L。在此條件下,利用10 g/L濕菌體催化水解180 mmol/L IBSN,反應(yīng)6 h 轉(zhuǎn)化率可達(dá)45.1%,產(chǎn)物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的e.e.值達(dá)到97.9%。結(jié)果表明,重組腈水解酶工程菌BrNit具有較高的立體選擇性和催化活性,顯示出較好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。但是,該腈水解酶的穩(wěn)定性較差,活力也有進(jìn)一步提高的空間。因此,后期可以對(duì)該腈水解酶進(jìn)行分子改造,提高其酶活和穩(wěn)定性。

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