• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    多孔整體柱固定化酶研究進(jìn)展

    2019-02-15 08:31:30陳佩佩龔林軍呂永琴
    生物加工過(guò)程 2019年1期
    關(guān)鍵詞:甲基丙烯酸雜化硅烷

    陳佩佩,龔林軍,呂永琴

    (北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100029)

    酶作為一種生物催化劑,與無(wú)機(jī)催化劑相比具有高效性、專一性和溫和性等優(yōu)點(diǎn),在工業(yè)催化中具有廣泛的應(yīng)用。但游離酶穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用,通常需要對(duì)其進(jìn)行固定化。與游離酶相比,固定化酶具有穩(wěn)定性高、易于分離回收、可重復(fù)使用以及操作工藝簡(jiǎn)便且可控等一系列優(yōu)點(diǎn)。

    固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料,二者能直接影響固定化酶的催化活性。理想的固定化酶載體需要具有以下特點(diǎn):較高的穩(wěn)定性、良好的生物相容性、大的比表面積、傳質(zhì)性能好、易于功能化修飾和成本較低等[1-2]。近年來(lái),研究者開發(fā)了很多新的固定化酶載體,但大多停留在實(shí)驗(yàn)室的小試階段,難以應(yīng)用于工業(yè)催化放大應(yīng)用。

    整體柱(monolithic column),又稱為連續(xù)床,是由單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑的混合溶液在色譜柱內(nèi)通過(guò)原位熱引發(fā)或光引發(fā)聚合得到的整體、連續(xù)的柱體。相對(duì)于常規(guī)填充柱,具有制備簡(jiǎn)單、易于改性、滲透性好、柱壓低和傳質(zhì)速度快等優(yōu)點(diǎn)。20世紀(jì)50年代,諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Synge課題組首次提出了類似整體柱結(jié)構(gòu)的介質(zhì)[3]。1967年,Kubín等[4]用高度溶脹的聚2-羥乙基甲基丙烯酸制備了整體柱并用于蛋白質(zhì)的分離,但由于柱體溶脹、耐受壓力低,一直沒(méi)有引起人們的注意。直到1989年,Hjertén等[5]用高度交聯(lián)的丙烯酰胺成功制備了軟膠整體柱并應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離,整體柱技術(shù)才日益受到人們的重視。其后Svec等[6]和Ishizuka等[7]用聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯制備了高硬度有機(jī)聚合物整體柱。整體柱技術(shù)越來(lái)越受到人們的關(guān)注,并被譽(yù)為第四代生物色譜固定相,廣泛應(yīng)用于色譜分離、固相萃取、分析檢測(cè)、氣體儲(chǔ)存和生物催化等領(lǐng)域。

    多孔整體柱作為固定化酶的載體,其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在于大的貫穿孔道和良好的通透性,區(qū)別于傳統(tǒng)固定化酶載體的擴(kuò)散傳質(zhì),整體柱可以為底物和產(chǎn)物提供快速的對(duì)流傳質(zhì)性能,從而大大提高酶催化的速率和效率。同時(shí),整體柱的“柱體”形式可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)可控酶催化反應(yīng),產(chǎn)物易于分離,有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)放大。

    根據(jù)整體柱骨架結(jié)構(gòu)的材質(zhì)不同,可將整體柱分成無(wú)機(jī)整體柱、有機(jī)聚合物整體柱、雜化整體柱(有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱)和納米材料整體柱。本文中,筆者將主要從硅膠整體柱、有機(jī)高聚物整體柱、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱和納米材料整體柱4個(gè)方面介紹近年來(lái)整體柱在固定化酶方向的研究進(jìn)展。

    1 硅膠整體柱固定化酶

    硅膠整體柱是以硅膠為基質(zhì)的無(wú)機(jī)整體柱,與有機(jī)聚合物整體柱相比,具有理想的力學(xué)強(qiáng)度和比表面積大的優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是化學(xué)穩(wěn)定性不高、適用的pH范圍較小。

    硅膠整體柱除了以毛細(xì)管和不銹鋼柱為模具外,也可在微流控芯片的微通道內(nèi)合成。He等[12]在微流控芯片里制備了聚乙烯亞胺修飾的硅膠整體柱(圖1),通過(guò)靜電吸附作用對(duì)乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶進(jìn)行共固定化,利用電化學(xué)方法檢測(cè)了馬拉氧磷、毒扁豆堿和滅多蟲,檢測(cè)限分別達(dá)到0.5、0.2和1.0 μmol/L。在微流控芯片微通道內(nèi)制備硅膠整體柱的難點(diǎn)之一是整體柱材料與通道表面的結(jié)合力差,這會(huì)引起整體柱的收縮和脫落。為解決這一問(wèn)題,Yesil-Celiktas等[13]選用四乙氧基硅烷(TEOS)和乙二醇改性硅烷(EGMS)為前體,同時(shí)加入聚氧化乙烯(PEO),大大降低了硅膠整體柱的收縮,保證了整體柱的多孔結(jié)構(gòu),以此對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和纖維素酶進(jìn)行固載,最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)28.8%。Pirozzi等[14]通過(guò)對(duì)四甲氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷和N-丙基三甲氧基硅烷3種硅烷偶聯(lián)劑前體的配比進(jìn)行優(yōu)化,成功解決了整體柱材料與芯片通道表面結(jié)合力差的問(wèn)題,同時(shí)通過(guò)增加整體柱的疏水性提高了酶的活性。

    (a)整體柱通道(寬600 μm,深50 μm,長(zhǎng)20 mm);(b)電化學(xué)檢測(cè)通道(寬1.5 mm,深50 μm,長(zhǎng)20 mm);(c)連接通道(寬100 μm,深50 μm,長(zhǎng)5 mm);(d)入口(直徑1.5 mm,連接塑料管的直徑0.5 mm);(e)出口(直徑1.5 mm);(f)工作電極(WE,鉑圓盤,直徑0.5 mm);(g)鉑電極CE(直徑1 mm);(h)參考電極RE(Ag/AgCl,直徑1 mm)圖1 微流控裝置示意[12]Fig.1 Schematic of the micro-fluidic device[12]

    多酶的共固定化是酶工程領(lǐng)域的重要研究課題,底物通道效應(yīng)[15]是多酶催化需要解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,即前一個(gè)酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物直接進(jìn)入到下一個(gè)酶的活性中心作為底物進(jìn)行催化反應(yīng),而不是擴(kuò)散進(jìn)入反應(yīng)微環(huán)境中[2]。因此,多酶共固定化需要實(shí)現(xiàn)每個(gè)酶的定向有序固定化。Yin等[16]利用硅膠整體柱成功實(shí)現(xiàn)了苯甲酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸酶的有序固定化,設(shè)計(jì)了三酶酶聯(lián)微反應(yīng)器(圖2),在10 min內(nèi)可將99.5%的基因組DNA酶解成單核苷酸。與HPLC-MS聯(lián)用,從膀胱癌細(xì)胞(T24)的基因組DNA中成功檢測(cè)到表觀遺傳5-甲基胞嘧啶的主要氧化產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶。

    圖2 硅膠整體柱有序固載苯甲酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸酶的三酶酶聯(lián)微反應(yīng)器的設(shè)計(jì)合成[16]Fig.2 Schematic diagram of design and synthesis of athree-enzyme-linked microreactor with orderlyimmobilized formate,snake venom phospho-diesterase and alkaline phosphatase[16]

    在基于鳥槍法的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,蛋白質(zhì)酶解非常重要,整體柱固載酶在保證高效酶催化的同時(shí),有利于減少酶的自身降解和交叉感染,并可以實(shí)現(xiàn)和分離鑒定系統(tǒng)的聯(lián)用。Rivera等[17]合成了硅膠和鈦整體柱,通過(guò)包覆一層生物仿生聚多巴胺膜,實(shí)現(xiàn)對(duì)胰蛋白酶的固定化,并與質(zhì)譜聯(lián)用,對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析。Stanley課題組的Foo等[18]利用該類型的胰蛋白酶微反應(yīng)器結(jié)合高效液相-電噴霧-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析了馬血漿中重組人紅細(xì)胞生成素的酶解和去糖基化反應(yīng)過(guò)程。

    除以上應(yīng)用外,硅膠整體柱還被用于蛇毒磷酸二酯酶、大豆過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)氨酶和青霉素G?;傅榷喾N酶的固定化,并將固定化酶應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域。

    2 有機(jī)聚合物整體柱固定化酶

    有機(jī)聚合物整體柱的制備是將單體、致孔劑和引發(fā)劑的混合溶液注入空模具內(nèi),經(jīng)熱、光或γ線引發(fā),在模具內(nèi)發(fā)生聚合形成整體柱,聚合完成后用合適的溶劑除去柱體內(nèi)的致孔劑和殘留的單體,其主要特點(diǎn)是制備過(guò)程簡(jiǎn)單,滲透性和孔徑可通過(guò)調(diào)整致孔劑的配比來(lái)改變,pH使用范圍寬。此外,可供選擇的單體類型非常豐富,種類上基本不受限制,可根據(jù)不同的需要選用相應(yīng)的有機(jī)功能單體,還可在基質(zhì)的表面進(jìn)一步修飾或衍生,以滿足不同的需求[19]。

    Xie等[20]首先將有機(jī)聚合物整體柱應(yīng)用于酶的固定化,他們利用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)作為功能單體合成有機(jī)聚合物整體柱,通過(guò)環(huán)氧基團(tuán)與乙二胺反應(yīng)鍵合氨基,進(jìn)一步利用戊二醛交聯(lián)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的共價(jià)固定化。由于整體柱快速的對(duì)流傳質(zhì)性能,胰蛋白酶生物微反應(yīng)器的催化反應(yīng)速率是游離酶的300倍,在88 s內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解[21]。Ozoner等[22]也利用戊二醛交聯(lián)的方法實(shí)現(xiàn)了辣根過(guò)氧化物酶的固載,對(duì)酚類物質(zhì)的檢測(cè)限為1~250 μmol/L。除戊二醛交聯(lián)外,也可通過(guò)靜電吸附作用或金屬螯合作用實(shí)現(xiàn)酶的固定化,例如,可選用帶氨基的功能單體(如甲基丙烯酸氨基乙酯)合成整體柱,通過(guò)氨基對(duì)酶的靜電吸附作用實(shí)現(xiàn)酶的固載[23]。同時(shí),可利用聚乙烯亞胺(PEI)修飾聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱,之后吸附Cu2+,通過(guò)金屬離子對(duì)酶的配位作用固定化酶[24]。后來(lái)很多課題組也將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱用于脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、核糖核酸酶A、糖基肽酶和乙酰膽堿酯酶的固載,成功實(shí)現(xiàn)了藥物的手性拆分、核苷酸降解、糖基化分析和抑制劑的篩選。

    乙烯基吖內(nèi)酯是另一種易衍生的功能單體,其吖內(nèi)酯基團(tuán)在常溫下可與酶的氨基反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)酶在溫和條件下的共價(jià)固載。Xie等[20]首次提出利用乙烯基吖內(nèi)酯和丙烯酰胺作為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)作為交聯(lián)劑合成整體柱,通過(guò)吖內(nèi)酯基團(tuán)的開環(huán)反應(yīng)對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固定化。結(jié)合甲基丙烯酸縮水甘油酯和乙烯基吖內(nèi)酯2種功能單體,該課題組同時(shí)開發(fā)了新的固定化酶工藝[25],首先合成聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱,在堿性條件下與甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)反應(yīng),再通過(guò)光引發(fā)接枝乙烯基吖內(nèi)酯。該工藝一方面在整體柱上引入了HEMA,增加了聚合物的親水性,降低了酶解過(guò)程中底物蛋白質(zhì)和產(chǎn)物多肽的非特異性吸附;另一方面,光引發(fā)接枝改性大大提高了吖內(nèi)酯的鍵合量,從而增大了酶的固載量。也可利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺為功能單體制備整體柱,通過(guò)琥珀酰亞胺與酶的氨基的共價(jià)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)酶的固載[23]。

    除通過(guò)自由基聚合反應(yīng)外,有機(jī)聚合物整體柱也可通過(guò)相分離技術(shù)合成。Sun等[26]利用非溶劑致相分離法制備了聚乙烯醇整體柱,比表面積高達(dá)102 m2/g,通過(guò)鍵合聚乙烯亞胺(PEI)和戊二醛,分別通過(guò)靜電吸附和共價(jià)結(jié)合對(duì)脂肪酶和辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行了固載。Uyama等[27]通過(guò)熱致相分離合成了聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱,通過(guò)EDC/NHS共價(jià)偶聯(lián)或醛基交聯(lián)實(shí)現(xiàn)了胃蛋白酶的固載。

    尋求高效的化學(xué)反應(yīng)是提高酶固載率的有效手段。Kolb等[28]提出的點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)具有產(chǎn)率高、副產(chǎn)物無(wú)害、反應(yīng)立體選擇性高、反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、原料和反應(yīng)試劑易得、合成反應(yīng)快速、可在水相合成、產(chǎn)物對(duì)氧氣和水不敏感、符合原子經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點(diǎn)。目前常用的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)主要包括銅催化疊氮化炔環(huán)加成(CuAAC)反應(yīng)和硫醇-烯(thiol-ene)點(diǎn)擊反應(yīng)。?elebi等[29]將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱與疊氮化鈉反應(yīng)鍵合疊氮基團(tuán),對(duì)α-胰凝乳蛋白酶修飾鍵合炔鍵,利用CuAAC點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了α-胰凝乳蛋白酶的固載。Wu等[30]分別合成了疊氮配基和炔鍵配基的整體柱,分別對(duì)鍵合炔鍵合疊氮基團(tuán)的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行了固載。與Cu(I)催化點(diǎn)擊化學(xué)法相比,硫醇-烯(thiol-ene)點(diǎn)擊反應(yīng)無(wú)需使用金屬銅作催化劑,具有良好的應(yīng)用前景。Lafleur等[31]首次利用硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)在微流控芯片微通道內(nèi)合成了乳液模板化的整體柱,成功實(shí)現(xiàn)了半乳糖氧化酶和糖基肽酶的固載(圖3)。同時(shí),其他研究者利用相同的方法構(gòu)建整體柱,對(duì)胃蛋白酶進(jìn)行固定化,與超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)聯(lián)用,對(duì)酶解后的多肽進(jìn)行了高效肽譜分析[32]。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)反應(yīng)是以有機(jī)鹵化物為引發(fā)劑、過(guò)渡金屬配合物為鹵原子載體,通過(guò)氧化還原反應(yīng),在活性種與休眠種之間建立可逆的動(dòng)態(tài)平衡,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合物的可控合成。Li等[33]利用ATRP反應(yīng)合成了聚乙二醇二甲基丙烯酸整體柱,同時(shí)利用ATRP反應(yīng)在整體柱上接枝了聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯,大大增加了環(huán)氧基團(tuán)的含量,提高了胰蛋白酶的固載量,在50 s內(nèi)可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解,反應(yīng)速率是游離酶的900倍。

    圖3 硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)和ASA連接構(gòu)建肽-N-糖苷酶F固載酶生物微反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)核糖核酸酶B的去糖基化[31]Fig.3 Deglycosylation of RNase B on the enzymaticmicroreactor featuring PNG ase F immobilizedvia thiol-ene click chemistry and ASA linkage[31]

    固定化酶在反復(fù)多次使用后會(huì)失活,為降低成本,載體的再生利用至關(guān)重要。對(duì)此,Xiong等[34]通過(guò)光引發(fā)自由基聚合反應(yīng)在玻璃微芯片內(nèi)合成了多孔的溫度敏感性聚(N-異丙基丙烯酰胺)整體柱,當(dāng)溫度高于該聚合物的低臨界溶液溫度(LCST),聚合物發(fā)生收縮并呈疏水性,葡萄糖氧化酶(GOx)通過(guò)疏水作用被吸附固載到整體柱上;相反,當(dāng)溫度小于LCST,聚合物發(fā)生溶脹并呈親水性,固載的GOx被釋放。因此,通過(guò)對(duì)外界溫度的控制可實(shí)現(xiàn)酶的可控固載和釋放,從而實(shí)現(xiàn)載體的再生利用。研究者將整體柱固載酶芯片與碳纖維微電極聯(lián)用,通過(guò)電化學(xué)法檢測(cè)葡萄糖濃度,檢測(cè)限為0.05~5 mmol/L。

    3 有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱固定化酶

    有機(jī)聚合物整體柱的優(yōu)點(diǎn)是具有大的貫穿孔道,在酶催化過(guò)程中有利于為底物和產(chǎn)物提供快速的對(duì)流傳質(zhì)性能,同時(shí)具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,但缺點(diǎn)是比表面積較小、酶的負(fù)載量低。無(wú)機(jī)整體柱的優(yōu)點(diǎn)是比表面積大,酶的負(fù)載量高,缺點(diǎn)是化學(xué)穩(wěn)定性差。為充分結(jié)合二者的優(yōu)點(diǎn),研究者提出了有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱的合成。

    中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的張麗華和鄒漢法課題組對(duì)有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱固載酶微反應(yīng)器的設(shè)計(jì)進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究,其主要的應(yīng)用是固載胰蛋白酶實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。例如,Wu等[35]采用3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷為功能單體(GLYMO)、硅酸乙酯(TEOS)為交聯(lián)劑制備整體柱,對(duì)環(huán)氧基團(tuán)水解后獲得鄰二醇,通過(guò)鄰二醇與氨基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的固載,該固載酶微反應(yīng)器在47 s內(nèi)完成對(duì)牛血清蛋白的酶解,多肽片段覆蓋率為35%。Ma等[36]選用四乙氧基硅烷水解溶膠、亞氨基二乙酸、3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷合成雜化整體柱,Cu2+活化整體柱后,通過(guò)金屬螯合作用對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固載,在150 s內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)5 μg小鼠肝臟提取物的高效酶解,同時(shí)利用金屬螯合作用的可逆性實(shí)現(xiàn)了整體柱載體的再生利用。Yuan等[37]通過(guò)四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷的縮聚反應(yīng)合成硅膠整體柱,再以甲基丙烯酸為功能單體、過(guò)硫酸銨為交聯(lián)劑在硅膠整體柱上原位聚合制備雜化整體柱,利用碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)反應(yīng)對(duì)整體柱修飾鍵合聚乙烯亞胺,再進(jìn)一步共價(jià)固載胰蛋白酶。該固載酶反應(yīng)器與二維HPLC-MS/MS聯(lián)用對(duì)低轉(zhuǎn)移率的肝癌細(xì)胞蛋白萃取物進(jìn)行酶解和蛋白組學(xué)分析,可識(shí)別檢測(cè)3 000種蛋白質(zhì)。Chen等[38]采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和正硅酸甲酯合成整體柱,將胰蛋白酶的二硫鍵還原為巰基,利用整體柱表面雙鍵和巰基的“thiol-ene”點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)酶的固載,反復(fù)使用100次后,殘余酶活仍為87.5%。

    除對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固載外,Zhou等[39]利用雙[3-(三乙氧基硅烷)丙基]硫代氨基甲酸為功能單體,與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)合成了層狀有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱,對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的固載量為126 mg/g,催化活性是游離酶的3倍。

    4 納米材料與整體柱相結(jié)合固定化酶

    多孔整體柱雖然能為酶和底物提供良好的對(duì)流傳質(zhì)性能,提高酶解反應(yīng)速率,但是使用過(guò)程中仍然存在兩個(gè)問(wèn)題:一是整體柱由于具有連續(xù)的貫穿大孔,其比表面積較小,因此酶的固載量較低;二是傳統(tǒng)的固載酶方法存在一定的弊端,不利于提高酶的穩(wěn)定性和使用壽命。納米材料由于其獨(dú)特的小粒徑效應(yīng)、表面效應(yīng)和界面效應(yīng),作為載體用于酶的固定化有利于保持酶的活性和穩(wěn)定性,大大提高酶的固載量和催化效率[40]。然而,納米顆粒尺寸太小、吸附性太強(qiáng)、極易團(tuán)聚,單獨(dú)作為載體固定化酶時(shí),不利用后續(xù)與產(chǎn)物的分離。若將整體柱與納米材料相結(jié)合,可以解決傳統(tǒng)固載酶生物反應(yīng)器傳質(zhì)速度慢、固載量低和催化效率差等問(wèn)題,大大提高固載酶的穩(wěn)定性、使用壽命、催化速率和效率。

    由于納米金具有良好的分子識(shí)別特性和生物相容性,筆者在毛細(xì)管內(nèi)成功構(gòu)建了高密度納米金多孔聚合物整體柱[41]。合成聚甲基丙烯酸縮水甘油酯毛細(xì)管整體柱骨架材料,其環(huán)氧基團(tuán)與胱胺反應(yīng),再通過(guò)三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP)打開二硫鍵獲得巰基,利用巰基與納米金的親和作用,在整體柱上成功地鍵合了一層排列規(guī)則、致密、連續(xù)的納米金(圖4),鍵合40 nm納米金的鍵合量高達(dá)60%,為目前所有文獻(xiàn)報(bào)道中的最大值。以納米金作為中間配體,通過(guò)Au-S可逆親和作用固載脂肪酶(圖5),成功催化了玉米油和大豆油的酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油。對(duì)催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究表明,該納米金整體柱固載酶微反應(yīng)器的最大反應(yīng)速率是游離酶催化的1 000倍。該固載酶微反應(yīng)器具有良好的使用壽命,連續(xù)催化1 760個(gè)反應(yīng)器體積后,固載酶的殘余酶活仍為80%。同時(shí),納米金與酶的親和作用力可逆,作用條件溫和,固載酶連續(xù)多次使用后失活,利用巰基乙醇破壞納米金與酶的親和作用,可以洗脫失活酶,重新固載新酶后可以再生利用,再生后的固定酶催化性能與新合成的催化性能相當(dāng)。

    圖4 納米金整體柱的掃描電子顯微鏡照片[41]Fig.4 Scanning electron micrograph of a nanogoldmonolithic column[41]

    圖5 納米金整體柱固載酶微反應(yīng)器的設(shè)計(jì)過(guò)程[41]Fig.5 Design process for a nanogold monolithiccolumn-loaded enzyme microreactor[41]

    除納米金外,Shangguan等[42]在合成有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱時(shí)加入了SBA-15納米顆粒,增大了整體柱的比表面積,分別通過(guò)戊二醛交聯(lián)和金屬螯合作用對(duì)酶進(jìn)行固載,構(gòu)建了胰蛋白酶微反應(yīng)器和胰蛋白酶/糜蛋白酶雙酶反應(yīng)器,與單酶反應(yīng)器相比,雙酶反應(yīng)器可鑒定的多肽片段數(shù)目增加1倍,提高了大鼠肝臟膜蛋白的總體功能分析。Xu等[43]研發(fā)了一種新的介孔二氧化硅納米顆粒,與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)原位共聚制備整體柱,對(duì)胃蛋白酶進(jìn)行固載,實(shí)現(xiàn)了藥物的手性拆分,研究發(fā)現(xiàn),硅納米顆粒的引入大大增加了結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量,增大了酶的固載量,提高了手性拆分的效率。Hong等[44]提出了氧化石墨烯硅膠整體柱固載胃蛋白酶,研究了氨水、乙二胺和聚乙烯亞胺等不同修飾方法和間臂分子對(duì)氧化石墨烯負(fù)載量的影響。

    5 結(jié)論與展望

    整體柱具有制備簡(jiǎn)單、力學(xué)強(qiáng)度高和通透性好等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于酶的固定化。本文中,筆者總結(jié)了硅膠整體柱、有機(jī)聚合物整體柱、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱和納米材料整體柱固載酶的構(gòu)建方法、應(yīng)用及各自的優(yōu)缺點(diǎn),為提高酶催化的性能提供了新的思路和方法。在今后的研究中,仍然需要開發(fā)簡(jiǎn)單易控的整體柱制備技術(shù),或?qū)ΜF(xiàn)有制備技術(shù)的工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化,改善整體柱形貌和孔道的均勻性,提高整體柱的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,繼續(xù)發(fā)展新型高效的固定化酶方法,實(shí)現(xiàn)整體柱固載酶的工業(yè)化應(yīng)用。

    猜你喜歡
    甲基丙烯酸雜化硅烷
    超支化聚碳硅烷結(jié)構(gòu)、交聯(lián)方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展
    高效液相色譜法測(cè)定聚甲基丙烯酸酯食品材料中甲基丙烯酸酯及甲基丙烯酸向模擬食品液的遷移量
    硅烷包覆膨脹型阻燃劑共混改性粘膠纖維的研究
    α-細(xì)辛腦脂質(zhì)聚合物雜化納米粒的制備及表征
    甲基丙烯酸鈰補(bǔ)強(qiáng)天然橡膠的性能研究
    乙烯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯三元共聚物增韌PBT的研究
    元素雜化阻燃丙烯酸樹脂的研究進(jìn)展
    化學(xué)教學(xué)中的分子雜化軌道學(xué)習(xí)
    元素雜化阻燃聚苯乙烯的研究進(jìn)展
    LncRNA PCA3在甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯誘導(dǎo)16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)及意義
    搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲自拍偷在线| 精品国产三级普通话版| 嫩草影院新地址| 在线免费观看不下载黄p国产| 别揉我奶头 嗯啊视频| 伦精品一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美精品国产亚洲| 国产亚洲av嫩草精品影院| 内地一区二区视频在线| 婷婷亚洲欧美| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美激情在线99| 嫩草影院入口| 亚洲成人久久爱视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 看非洲黑人一级黄片| 永久网站在线| .国产精品久久| 1000部很黄的大片| 精品人妻视频免费看| 国产乱人视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产欧美日韩一区二区精品| 天堂网av新在线| 日本成人三级电影网站| 我的女老师完整版在线观看| 一级毛片我不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久国产网址| 在线观看一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 亚洲图色成人| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一a级毛片在线观看| 免费观看人在逋| 韩国av在线不卡| 国产激情偷乱视频一区二区| av天堂在线播放| 变态另类丝袜制服| 国产美女午夜福利| 97超碰精品成人国产| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲最大成人av| 国产美女午夜福利| 欧美+日韩+精品| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美一区二区亚洲| 成熟少妇高潮喷水视频| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费看美女性在线毛片视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久久久久大av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 校园春色视频在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 草草在线视频免费看| 亚洲国产精品成人综合色| 91精品国产九色| 久久久久久久久久成人| 午夜a级毛片| 国产成人a∨麻豆精品| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲最大成人中文| 日本色播在线视频| 亚洲七黄色美女视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 成年免费大片在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 色在线成人网| 91久久精品国产一区二区成人| 俺也久久电影网| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久久久免费精品人妻一区二区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久久久午夜电影| 女人被狂操c到高潮| 特级一级黄色大片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 成人午夜高清在线视频| 日韩欧美国产在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 丰满乱子伦码专区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 中文资源天堂在线| 午夜福利18| 亚洲七黄色美女视频| 九九爱精品视频在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 成人性生交大片免费视频hd| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产成年人精品一区二区| 一本一本综合久久| 人人妻人人看人人澡| 日日啪夜夜撸| 欧美成人a在线观看| 直男gayav资源| 欧美三级亚洲精品| av在线天堂中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 婷婷亚洲欧美| 国产欧美日韩精品亚洲av| 麻豆国产av国片精品| 成人欧美大片| 国产精品无大码| 亚洲七黄色美女视频| 直男gayav资源| 国产午夜福利久久久久久| 黑人高潮一二区| 国产真实乱freesex| 久久久欧美国产精品| 国产三级在线视频| 99riav亚洲国产免费| 亚洲av成人精品一区久久| 三级国产精品欧美在线观看| 乱人视频在线观看| 国产av一区在线观看免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久精品综合一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 亚洲av五月六月丁香网| 国产黄a三级三级三级人| 午夜激情欧美在线| 网址你懂的国产日韩在线| 高清日韩中文字幕在线| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久久久久成人| 国产成年人精品一区二区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩成人伦理影院| 亚洲av美国av| 免费看av在线观看网站| 日本成人三级电影网站| 国产精品精品国产色婷婷| 久久草成人影院| 欧美日韩综合久久久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产69精品久久久久777片| 亚洲最大成人中文| 97超视频在线观看视频| 成年免费大片在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 哪里可以看免费的av片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费观看在线日韩| 日韩强制内射视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产三级中文精品| 一夜夜www| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 97超视频在线观看视频| 国产日本99.免费观看| 黄色配什么色好看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲人与动物交配视频| 免费看光身美女| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久久伊人网av| 毛片女人毛片| 内射极品少妇av片p| 99久久中文字幕三级久久日本| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美日韩精品成人综合77777| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 国产真实伦视频高清在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产av麻豆久久久久久久| 久久精品人妻少妇| 亚洲av免费在线观看| 俺也久久电影网| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 婷婷色综合大香蕉| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲专区国产一区二区| 丰满的人妻完整版| 97热精品久久久久久| 老女人水多毛片| 身体一侧抽搐| 亚洲自偷自拍三级| 日本欧美国产在线视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲中文字幕日韩| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品免费久久久久久久清纯| 干丝袜人妻中文字幕| 中文字幕av在线有码专区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 男女边吃奶边做爰视频| 国产人妻一区二区三区在| 精品久久久噜噜| 精品熟女少妇av免费看| 在线免费观看的www视频| 亚洲五月天丁香| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| av在线播放精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费看a级黄色片| 亚洲精品国产av成人精品 | 观看美女的网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 简卡轻食公司| 日本黄色视频三级网站网址| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久噜噜| eeuss影院久久| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 天美传媒精品一区二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 黄片wwwwww| 能在线免费观看的黄片| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久久大精品| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 日本黄大片高清| 嫩草影院新地址| 成人欧美大片| 久久久久久伊人网av| 国产69精品久久久久777片| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av天堂在线播放| 高清毛片免费观看视频网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一级毛片我不卡| 亚洲性久久影院| 亚洲av成人av| 观看免费一级毛片| 最新中文字幕久久久久| 干丝袜人妻中文字幕| 两个人的视频大全免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲内射少妇av| 亚洲国产精品国产精品| 一区福利在线观看| 性欧美人与动物交配| 身体一侧抽搐| 久久国内精品自在自线图片| 女同久久另类99精品国产91| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产 一区 欧美 日韩| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 丝袜喷水一区| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美3d第一页| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人影院久久av| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 一级毛片aaaaaa免费看小| www.色视频.com| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲成人久久性| 久久午夜福利片| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线播放国产精品三级| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产69精品久久久久777片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 高清毛片免费观看视频网站| 在线a可以看的网站| 免费大片18禁| 亚洲成av人片在线播放无| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产高清三级在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 国产麻豆成人av免费视频| 插逼视频在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 欧美bdsm另类| 国产精品久久久久久久久免| 久久国产乱子免费精品| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 国产成人aa在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 欧美一区二区亚洲| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产一区二区激情短视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精华霜和精华液先用哪个| 99热全是精品| 男人舔奶头视频| 久久久色成人| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久国内精品自在自线图片| 永久网站在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产免费一级a男人的天堂| 插阴视频在线观看视频| 全区人妻精品视频| 国产成人影院久久av| 精品福利观看| 午夜福利在线观看吧| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲三级黄色毛片| 精品午夜福利在线看| 99久国产av精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美zozozo另类| 午夜激情福利司机影院| 99热全是精品| 精品熟女少妇av免费看| 69av精品久久久久久| 中国美女看黄片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久久久久久久久黄片| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 性欧美人与动物交配| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲av一区综合| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久久伊人网av| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品一区二区三区人妻视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 99久久成人亚洲精品观看| ponron亚洲| 日本免费a在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 综合色av麻豆| 日韩欧美在线乱码| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜日韩欧美国产| 激情 狠狠 欧美| 国产精品人妻久久久久久| 九九热线精品视视频播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黄色欧美视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 国产精品野战在线观看| 丰满乱子伦码专区| 欧美日本视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产欧美日韩精品一区二区| 波多野结衣高清作品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av.av天堂| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久性生活片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 人妻久久中文字幕网| 91av网一区二区| 晚上一个人看的免费电影| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚州av有码| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲av美国av| 99久久精品一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 精品国内亚洲2022精品成人| 九九热线精品视视频播放| 午夜日韩欧美国产| 一个人免费在线观看电影| 亚洲最大成人中文| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 日韩精品中文字幕看吧| 97热精品久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲四区av| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品无大码| 特大巨黑吊av在线直播| 国产成人91sexporn| 亚洲第一电影网av| 亚洲av免费在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 全区人妻精品视频| 熟女人妻精品中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美中文日本在线观看视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩欧美三级三区| 国产在线男女| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲av五月六月丁香网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 成人av一区二区三区在线看| 桃色一区二区三区在线观看| av国产免费在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久成人免费电影| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 成年av动漫网址| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产 一区 欧美 日韩| 长腿黑丝高跟| 亚洲无线观看免费| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产熟女欧美一区二区| 国产淫片久久久久久久久| 日韩人妻高清精品专区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 最新中文字幕久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频| a级毛片a级免费在线| 国产伦在线观看视频一区| 69人妻影院| 日本成人三级电影网站| 久99久视频精品免费| av天堂在线播放| 成熟少妇高潮喷水视频| 黑人高潮一二区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 啦啦啦啦在线视频资源| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 麻豆av噜噜一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 国产一区二区在线av高清观看| 中文字幕av在线有码专区| 日本爱情动作片www.在线观看 | 51国产日韩欧美| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久国产a免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 69av精品久久久久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片| av女优亚洲男人天堂| 国产精品福利在线免费观看| 国产91av在线免费观看| 美女内射精品一级片tv| 国产免费一级a男人的天堂| 国产日本99.免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜| av在线老鸭窝| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产伦一二天堂av在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 两个人的视频大全免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产色婷婷99| 一个人免费在线观看电影| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品一区www在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 丝袜喷水一区| av在线天堂中文字幕| 国产精品1区2区在线观看.| 久久国内精品自在自线图片| 国产男靠女视频免费网站| 午夜精品国产一区二区电影 | 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产视频内射| 亚洲综合色惰| 国产精品野战在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 免费观看在线日韩| 美女高潮的动态| 久久久久久伊人网av| 少妇的逼水好多| 日韩av在线大香蕉| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产男人的电影天堂91| av在线亚洲专区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产成人精品久久久久久| 久久久久性生活片| 久久久久久伊人网av| 看黄色毛片网站| av卡一久久| 久久热精品热| 色av中文字幕| 免费高清视频大片| 国产免费男女视频| 在现免费观看毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 99热这里只有是精品50| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲成人av在线免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产av不卡久久| 亚洲,欧美,日韩| 春色校园在线视频观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久久久久久久久丰满| 精品久久久久久久久av| 99久久九九国产精品国产免费| 久久午夜亚洲精品久久| 一级a爱片免费观看的视频| 久久人妻av系列| 中文字幕熟女人妻在线| av天堂中文字幕网| 在线看三级毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 91狼人影院| 禁无遮挡网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 天堂网av新在线| av在线播放精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品久久久久久成人av| a级毛片免费高清观看在线播放| 黄色日韩在线| aaaaa片日本免费| 我的女老师完整版在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久久色成人| 在线观看一区二区三区| 国产在线男女| 最后的刺客免费高清国语| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品伦人一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 又爽又黄a免费视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品福利在线免费观看| 精品日产1卡2卡| 日韩制服骚丝袜av| 别揉我奶头 嗯啊视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品一区二区免费欧美| 九色成人免费人妻av| 看黄色毛片网站| 日本免费a在线| av福利片在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 中国国产av一级| 可以在线观看毛片的网站| 精品午夜福利在线看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩精品有码人妻一区| 高清毛片免费看| 丰满的人妻完整版| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品无大码| 老司机福利观看| 99久久精品热视频| 国产 一区 欧美 日韩| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 超碰av人人做人人爽久久| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产高清有码在线观看视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产成人a∨麻豆精品| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久九九精品影院| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产免费一级a男人的天堂| 能在线免费观看的黄片| 国产精品无大码| 内地一区二区视频在线| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲人成网站在线观看播放| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲精品国产av成人精品 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久午夜欧美精品| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品免费一区二区三区在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美性感艳星| av福利片在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 午夜a级毛片| 成人美女网站在线观看视频| 精品久久国产蜜桃| 天天一区二区日本电影三级| 久久久久九九精品影院| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲av不卡在线观看| 少妇丰满av| 国产精品野战在线观看|