• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    多孔整體柱固定化酶研究進(jìn)展

    2019-02-15 08:31:30陳佩佩龔林軍呂永琴
    生物加工過(guò)程 2019年1期
    關(guān)鍵詞:甲基丙烯酸雜化硅烷

    陳佩佩,龔林軍,呂永琴

    (北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100029)

    酶作為一種生物催化劑,與無(wú)機(jī)催化劑相比具有高效性、專一性和溫和性等優(yōu)點(diǎn),在工業(yè)催化中具有廣泛的應(yīng)用。但游離酶穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用,通常需要對(duì)其進(jìn)行固定化。與游離酶相比,固定化酶具有穩(wěn)定性高、易于分離回收、可重復(fù)使用以及操作工藝簡(jiǎn)便且可控等一系列優(yōu)點(diǎn)。

    固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料,二者能直接影響固定化酶的催化活性。理想的固定化酶載體需要具有以下特點(diǎn):較高的穩(wěn)定性、良好的生物相容性、大的比表面積、傳質(zhì)性能好、易于功能化修飾和成本較低等[1-2]。近年來(lái),研究者開發(fā)了很多新的固定化酶載體,但大多停留在實(shí)驗(yàn)室的小試階段,難以應(yīng)用于工業(yè)催化放大應(yīng)用。

    整體柱(monolithic column),又稱為連續(xù)床,是由單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑的混合溶液在色譜柱內(nèi)通過(guò)原位熱引發(fā)或光引發(fā)聚合得到的整體、連續(xù)的柱體。相對(duì)于常規(guī)填充柱,具有制備簡(jiǎn)單、易于改性、滲透性好、柱壓低和傳質(zhì)速度快等優(yōu)點(diǎn)。20世紀(jì)50年代,諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Synge課題組首次提出了類似整體柱結(jié)構(gòu)的介質(zhì)[3]。1967年,Kubín等[4]用高度溶脹的聚2-羥乙基甲基丙烯酸制備了整體柱并用于蛋白質(zhì)的分離,但由于柱體溶脹、耐受壓力低,一直沒(méi)有引起人們的注意。直到1989年,Hjertén等[5]用高度交聯(lián)的丙烯酰胺成功制備了軟膠整體柱并應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離,整體柱技術(shù)才日益受到人們的重視。其后Svec等[6]和Ishizuka等[7]用聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯制備了高硬度有機(jī)聚合物整體柱。整體柱技術(shù)越來(lái)越受到人們的關(guān)注,并被譽(yù)為第四代生物色譜固定相,廣泛應(yīng)用于色譜分離、固相萃取、分析檢測(cè)、氣體儲(chǔ)存和生物催化等領(lǐng)域。

    多孔整體柱作為固定化酶的載體,其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在于大的貫穿孔道和良好的通透性,區(qū)別于傳統(tǒng)固定化酶載體的擴(kuò)散傳質(zhì),整體柱可以為底物和產(chǎn)物提供快速的對(duì)流傳質(zhì)性能,從而大大提高酶催化的速率和效率。同時(shí),整體柱的“柱體”形式可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)可控酶催化反應(yīng),產(chǎn)物易于分離,有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)放大。

    根據(jù)整體柱骨架結(jié)構(gòu)的材質(zhì)不同,可將整體柱分成無(wú)機(jī)整體柱、有機(jī)聚合物整體柱、雜化整體柱(有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱)和納米材料整體柱。本文中,筆者將主要從硅膠整體柱、有機(jī)高聚物整體柱、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱和納米材料整體柱4個(gè)方面介紹近年來(lái)整體柱在固定化酶方向的研究進(jìn)展。

    1 硅膠整體柱固定化酶

    硅膠整體柱是以硅膠為基質(zhì)的無(wú)機(jī)整體柱,與有機(jī)聚合物整體柱相比,具有理想的力學(xué)強(qiáng)度和比表面積大的優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是化學(xué)穩(wěn)定性不高、適用的pH范圍較小。

    硅膠整體柱除了以毛細(xì)管和不銹鋼柱為模具外,也可在微流控芯片的微通道內(nèi)合成。He等[12]在微流控芯片里制備了聚乙烯亞胺修飾的硅膠整體柱(圖1),通過(guò)靜電吸附作用對(duì)乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶進(jìn)行共固定化,利用電化學(xué)方法檢測(cè)了馬拉氧磷、毒扁豆堿和滅多蟲,檢測(cè)限分別達(dá)到0.5、0.2和1.0 μmol/L。在微流控芯片微通道內(nèi)制備硅膠整體柱的難點(diǎn)之一是整體柱材料與通道表面的結(jié)合力差,這會(huì)引起整體柱的收縮和脫落。為解決這一問(wèn)題,Yesil-Celiktas等[13]選用四乙氧基硅烷(TEOS)和乙二醇改性硅烷(EGMS)為前體,同時(shí)加入聚氧化乙烯(PEO),大大降低了硅膠整體柱的收縮,保證了整體柱的多孔結(jié)構(gòu),以此對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和纖維素酶進(jìn)行固載,最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)28.8%。Pirozzi等[14]通過(guò)對(duì)四甲氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷和N-丙基三甲氧基硅烷3種硅烷偶聯(lián)劑前體的配比進(jìn)行優(yōu)化,成功解決了整體柱材料與芯片通道表面結(jié)合力差的問(wèn)題,同時(shí)通過(guò)增加整體柱的疏水性提高了酶的活性。

    (a)整體柱通道(寬600 μm,深50 μm,長(zhǎng)20 mm);(b)電化學(xué)檢測(cè)通道(寬1.5 mm,深50 μm,長(zhǎng)20 mm);(c)連接通道(寬100 μm,深50 μm,長(zhǎng)5 mm);(d)入口(直徑1.5 mm,連接塑料管的直徑0.5 mm);(e)出口(直徑1.5 mm);(f)工作電極(WE,鉑圓盤,直徑0.5 mm);(g)鉑電極CE(直徑1 mm);(h)參考電極RE(Ag/AgCl,直徑1 mm)圖1 微流控裝置示意[12]Fig.1 Schematic of the micro-fluidic device[12]

    多酶的共固定化是酶工程領(lǐng)域的重要研究課題,底物通道效應(yīng)[15]是多酶催化需要解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,即前一個(gè)酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物直接進(jìn)入到下一個(gè)酶的活性中心作為底物進(jìn)行催化反應(yīng),而不是擴(kuò)散進(jìn)入反應(yīng)微環(huán)境中[2]。因此,多酶共固定化需要實(shí)現(xiàn)每個(gè)酶的定向有序固定化。Yin等[16]利用硅膠整體柱成功實(shí)現(xiàn)了苯甲酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸酶的有序固定化,設(shè)計(jì)了三酶酶聯(lián)微反應(yīng)器(圖2),在10 min內(nèi)可將99.5%的基因組DNA酶解成單核苷酸。與HPLC-MS聯(lián)用,從膀胱癌細(xì)胞(T24)的基因組DNA中成功檢測(cè)到表觀遺傳5-甲基胞嘧啶的主要氧化產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶。

    圖2 硅膠整體柱有序固載苯甲酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸酶的三酶酶聯(lián)微反應(yīng)器的設(shè)計(jì)合成[16]Fig.2 Schematic diagram of design and synthesis of athree-enzyme-linked microreactor with orderlyimmobilized formate,snake venom phospho-diesterase and alkaline phosphatase[16]

    在基于鳥槍法的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,蛋白質(zhì)酶解非常重要,整體柱固載酶在保證高效酶催化的同時(shí),有利于減少酶的自身降解和交叉感染,并可以實(shí)現(xiàn)和分離鑒定系統(tǒng)的聯(lián)用。Rivera等[17]合成了硅膠和鈦整體柱,通過(guò)包覆一層生物仿生聚多巴胺膜,實(shí)現(xiàn)對(duì)胰蛋白酶的固定化,并與質(zhì)譜聯(lián)用,對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析。Stanley課題組的Foo等[18]利用該類型的胰蛋白酶微反應(yīng)器結(jié)合高效液相-電噴霧-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析了馬血漿中重組人紅細(xì)胞生成素的酶解和去糖基化反應(yīng)過(guò)程。

    除以上應(yīng)用外,硅膠整體柱還被用于蛇毒磷酸二酯酶、大豆過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)氨酶和青霉素G?;傅榷喾N酶的固定化,并將固定化酶應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域。

    2 有機(jī)聚合物整體柱固定化酶

    有機(jī)聚合物整體柱的制備是將單體、致孔劑和引發(fā)劑的混合溶液注入空模具內(nèi),經(jīng)熱、光或γ線引發(fā),在模具內(nèi)發(fā)生聚合形成整體柱,聚合完成后用合適的溶劑除去柱體內(nèi)的致孔劑和殘留的單體,其主要特點(diǎn)是制備過(guò)程簡(jiǎn)單,滲透性和孔徑可通過(guò)調(diào)整致孔劑的配比來(lái)改變,pH使用范圍寬。此外,可供選擇的單體類型非常豐富,種類上基本不受限制,可根據(jù)不同的需要選用相應(yīng)的有機(jī)功能單體,還可在基質(zhì)的表面進(jìn)一步修飾或衍生,以滿足不同的需求[19]。

    Xie等[20]首先將有機(jī)聚合物整體柱應(yīng)用于酶的固定化,他們利用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)作為功能單體合成有機(jī)聚合物整體柱,通過(guò)環(huán)氧基團(tuán)與乙二胺反應(yīng)鍵合氨基,進(jìn)一步利用戊二醛交聯(lián)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的共價(jià)固定化。由于整體柱快速的對(duì)流傳質(zhì)性能,胰蛋白酶生物微反應(yīng)器的催化反應(yīng)速率是游離酶的300倍,在88 s內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解[21]。Ozoner等[22]也利用戊二醛交聯(lián)的方法實(shí)現(xiàn)了辣根過(guò)氧化物酶的固載,對(duì)酚類物質(zhì)的檢測(cè)限為1~250 μmol/L。除戊二醛交聯(lián)外,也可通過(guò)靜電吸附作用或金屬螯合作用實(shí)現(xiàn)酶的固定化,例如,可選用帶氨基的功能單體(如甲基丙烯酸氨基乙酯)合成整體柱,通過(guò)氨基對(duì)酶的靜電吸附作用實(shí)現(xiàn)酶的固載[23]。同時(shí),可利用聚乙烯亞胺(PEI)修飾聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱,之后吸附Cu2+,通過(guò)金屬離子對(duì)酶的配位作用固定化酶[24]。后來(lái)很多課題組也將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱用于脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、核糖核酸酶A、糖基肽酶和乙酰膽堿酯酶的固載,成功實(shí)現(xiàn)了藥物的手性拆分、核苷酸降解、糖基化分析和抑制劑的篩選。

    乙烯基吖內(nèi)酯是另一種易衍生的功能單體,其吖內(nèi)酯基團(tuán)在常溫下可與酶的氨基反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)酶在溫和條件下的共價(jià)固載。Xie等[20]首次提出利用乙烯基吖內(nèi)酯和丙烯酰胺作為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)作為交聯(lián)劑合成整體柱,通過(guò)吖內(nèi)酯基團(tuán)的開環(huán)反應(yīng)對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固定化。結(jié)合甲基丙烯酸縮水甘油酯和乙烯基吖內(nèi)酯2種功能單體,該課題組同時(shí)開發(fā)了新的固定化酶工藝[25],首先合成聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱,在堿性條件下與甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)反應(yīng),再通過(guò)光引發(fā)接枝乙烯基吖內(nèi)酯。該工藝一方面在整體柱上引入了HEMA,增加了聚合物的親水性,降低了酶解過(guò)程中底物蛋白質(zhì)和產(chǎn)物多肽的非特異性吸附;另一方面,光引發(fā)接枝改性大大提高了吖內(nèi)酯的鍵合量,從而增大了酶的固載量。也可利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺為功能單體制備整體柱,通過(guò)琥珀酰亞胺與酶的氨基的共價(jià)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)酶的固載[23]。

    除通過(guò)自由基聚合反應(yīng)外,有機(jī)聚合物整體柱也可通過(guò)相分離技術(shù)合成。Sun等[26]利用非溶劑致相分離法制備了聚乙烯醇整體柱,比表面積高達(dá)102 m2/g,通過(guò)鍵合聚乙烯亞胺(PEI)和戊二醛,分別通過(guò)靜電吸附和共價(jià)結(jié)合對(duì)脂肪酶和辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行了固載。Uyama等[27]通過(guò)熱致相分離合成了聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱,通過(guò)EDC/NHS共價(jià)偶聯(lián)或醛基交聯(lián)實(shí)現(xiàn)了胃蛋白酶的固載。

    尋求高效的化學(xué)反應(yīng)是提高酶固載率的有效手段。Kolb等[28]提出的點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)具有產(chǎn)率高、副產(chǎn)物無(wú)害、反應(yīng)立體選擇性高、反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、原料和反應(yīng)試劑易得、合成反應(yīng)快速、可在水相合成、產(chǎn)物對(duì)氧氣和水不敏感、符合原子經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點(diǎn)。目前常用的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)主要包括銅催化疊氮化炔環(huán)加成(CuAAC)反應(yīng)和硫醇-烯(thiol-ene)點(diǎn)擊反應(yīng)。?elebi等[29]將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱與疊氮化鈉反應(yīng)鍵合疊氮基團(tuán),對(duì)α-胰凝乳蛋白酶修飾鍵合炔鍵,利用CuAAC點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了α-胰凝乳蛋白酶的固載。Wu等[30]分別合成了疊氮配基和炔鍵配基的整體柱,分別對(duì)鍵合炔鍵合疊氮基團(tuán)的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行了固載。與Cu(I)催化點(diǎn)擊化學(xué)法相比,硫醇-烯(thiol-ene)點(diǎn)擊反應(yīng)無(wú)需使用金屬銅作催化劑,具有良好的應(yīng)用前景。Lafleur等[31]首次利用硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)在微流控芯片微通道內(nèi)合成了乳液模板化的整體柱,成功實(shí)現(xiàn)了半乳糖氧化酶和糖基肽酶的固載(圖3)。同時(shí),其他研究者利用相同的方法構(gòu)建整體柱,對(duì)胃蛋白酶進(jìn)行固定化,與超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)聯(lián)用,對(duì)酶解后的多肽進(jìn)行了高效肽譜分析[32]。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)反應(yīng)是以有機(jī)鹵化物為引發(fā)劑、過(guò)渡金屬配合物為鹵原子載體,通過(guò)氧化還原反應(yīng),在活性種與休眠種之間建立可逆的動(dòng)態(tài)平衡,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合物的可控合成。Li等[33]利用ATRP反應(yīng)合成了聚乙二醇二甲基丙烯酸整體柱,同時(shí)利用ATRP反應(yīng)在整體柱上接枝了聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯,大大增加了環(huán)氧基團(tuán)的含量,提高了胰蛋白酶的固載量,在50 s內(nèi)可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解,反應(yīng)速率是游離酶的900倍。

    圖3 硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)和ASA連接構(gòu)建肽-N-糖苷酶F固載酶生物微反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)核糖核酸酶B的去糖基化[31]Fig.3 Deglycosylation of RNase B on the enzymaticmicroreactor featuring PNG ase F immobilizedvia thiol-ene click chemistry and ASA linkage[31]

    固定化酶在反復(fù)多次使用后會(huì)失活,為降低成本,載體的再生利用至關(guān)重要。對(duì)此,Xiong等[34]通過(guò)光引發(fā)自由基聚合反應(yīng)在玻璃微芯片內(nèi)合成了多孔的溫度敏感性聚(N-異丙基丙烯酰胺)整體柱,當(dāng)溫度高于該聚合物的低臨界溶液溫度(LCST),聚合物發(fā)生收縮并呈疏水性,葡萄糖氧化酶(GOx)通過(guò)疏水作用被吸附固載到整體柱上;相反,當(dāng)溫度小于LCST,聚合物發(fā)生溶脹并呈親水性,固載的GOx被釋放。因此,通過(guò)對(duì)外界溫度的控制可實(shí)現(xiàn)酶的可控固載和釋放,從而實(shí)現(xiàn)載體的再生利用。研究者將整體柱固載酶芯片與碳纖維微電極聯(lián)用,通過(guò)電化學(xué)法檢測(cè)葡萄糖濃度,檢測(cè)限為0.05~5 mmol/L。

    3 有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱固定化酶

    有機(jī)聚合物整體柱的優(yōu)點(diǎn)是具有大的貫穿孔道,在酶催化過(guò)程中有利于為底物和產(chǎn)物提供快速的對(duì)流傳質(zhì)性能,同時(shí)具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,但缺點(diǎn)是比表面積較小、酶的負(fù)載量低。無(wú)機(jī)整體柱的優(yōu)點(diǎn)是比表面積大,酶的負(fù)載量高,缺點(diǎn)是化學(xué)穩(wěn)定性差。為充分結(jié)合二者的優(yōu)點(diǎn),研究者提出了有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱的合成。

    中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的張麗華和鄒漢法課題組對(duì)有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱固載酶微反應(yīng)器的設(shè)計(jì)進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究,其主要的應(yīng)用是固載胰蛋白酶實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。例如,Wu等[35]采用3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷為功能單體(GLYMO)、硅酸乙酯(TEOS)為交聯(lián)劑制備整體柱,對(duì)環(huán)氧基團(tuán)水解后獲得鄰二醇,通過(guò)鄰二醇與氨基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的固載,該固載酶微反應(yīng)器在47 s內(nèi)完成對(duì)牛血清蛋白的酶解,多肽片段覆蓋率為35%。Ma等[36]選用四乙氧基硅烷水解溶膠、亞氨基二乙酸、3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷合成雜化整體柱,Cu2+活化整體柱后,通過(guò)金屬螯合作用對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固載,在150 s內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)5 μg小鼠肝臟提取物的高效酶解,同時(shí)利用金屬螯合作用的可逆性實(shí)現(xiàn)了整體柱載體的再生利用。Yuan等[37]通過(guò)四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷的縮聚反應(yīng)合成硅膠整體柱,再以甲基丙烯酸為功能單體、過(guò)硫酸銨為交聯(lián)劑在硅膠整體柱上原位聚合制備雜化整體柱,利用碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)反應(yīng)對(duì)整體柱修飾鍵合聚乙烯亞胺,再進(jìn)一步共價(jià)固載胰蛋白酶。該固載酶反應(yīng)器與二維HPLC-MS/MS聯(lián)用對(duì)低轉(zhuǎn)移率的肝癌細(xì)胞蛋白萃取物進(jìn)行酶解和蛋白組學(xué)分析,可識(shí)別檢測(cè)3 000種蛋白質(zhì)。Chen等[38]采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和正硅酸甲酯合成整體柱,將胰蛋白酶的二硫鍵還原為巰基,利用整體柱表面雙鍵和巰基的“thiol-ene”點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)酶的固載,反復(fù)使用100次后,殘余酶活仍為87.5%。

    除對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固載外,Zhou等[39]利用雙[3-(三乙氧基硅烷)丙基]硫代氨基甲酸為功能單體,與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)合成了層狀有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱,對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的固載量為126 mg/g,催化活性是游離酶的3倍。

    4 納米材料與整體柱相結(jié)合固定化酶

    多孔整體柱雖然能為酶和底物提供良好的對(duì)流傳質(zhì)性能,提高酶解反應(yīng)速率,但是使用過(guò)程中仍然存在兩個(gè)問(wèn)題:一是整體柱由于具有連續(xù)的貫穿大孔,其比表面積較小,因此酶的固載量較低;二是傳統(tǒng)的固載酶方法存在一定的弊端,不利于提高酶的穩(wěn)定性和使用壽命。納米材料由于其獨(dú)特的小粒徑效應(yīng)、表面效應(yīng)和界面效應(yīng),作為載體用于酶的固定化有利于保持酶的活性和穩(wěn)定性,大大提高酶的固載量和催化效率[40]。然而,納米顆粒尺寸太小、吸附性太強(qiáng)、極易團(tuán)聚,單獨(dú)作為載體固定化酶時(shí),不利用后續(xù)與產(chǎn)物的分離。若將整體柱與納米材料相結(jié)合,可以解決傳統(tǒng)固載酶生物反應(yīng)器傳質(zhì)速度慢、固載量低和催化效率差等問(wèn)題,大大提高固載酶的穩(wěn)定性、使用壽命、催化速率和效率。

    由于納米金具有良好的分子識(shí)別特性和生物相容性,筆者在毛細(xì)管內(nèi)成功構(gòu)建了高密度納米金多孔聚合物整體柱[41]。合成聚甲基丙烯酸縮水甘油酯毛細(xì)管整體柱骨架材料,其環(huán)氧基團(tuán)與胱胺反應(yīng),再通過(guò)三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP)打開二硫鍵獲得巰基,利用巰基與納米金的親和作用,在整體柱上成功地鍵合了一層排列規(guī)則、致密、連續(xù)的納米金(圖4),鍵合40 nm納米金的鍵合量高達(dá)60%,為目前所有文獻(xiàn)報(bào)道中的最大值。以納米金作為中間配體,通過(guò)Au-S可逆親和作用固載脂肪酶(圖5),成功催化了玉米油和大豆油的酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油。對(duì)催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究表明,該納米金整體柱固載酶微反應(yīng)器的最大反應(yīng)速率是游離酶催化的1 000倍。該固載酶微反應(yīng)器具有良好的使用壽命,連續(xù)催化1 760個(gè)反應(yīng)器體積后,固載酶的殘余酶活仍為80%。同時(shí),納米金與酶的親和作用力可逆,作用條件溫和,固載酶連續(xù)多次使用后失活,利用巰基乙醇破壞納米金與酶的親和作用,可以洗脫失活酶,重新固載新酶后可以再生利用,再生后的固定酶催化性能與新合成的催化性能相當(dāng)。

    圖4 納米金整體柱的掃描電子顯微鏡照片[41]Fig.4 Scanning electron micrograph of a nanogoldmonolithic column[41]

    圖5 納米金整體柱固載酶微反應(yīng)器的設(shè)計(jì)過(guò)程[41]Fig.5 Design process for a nanogold monolithiccolumn-loaded enzyme microreactor[41]

    除納米金外,Shangguan等[42]在合成有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱時(shí)加入了SBA-15納米顆粒,增大了整體柱的比表面積,分別通過(guò)戊二醛交聯(lián)和金屬螯合作用對(duì)酶進(jìn)行固載,構(gòu)建了胰蛋白酶微反應(yīng)器和胰蛋白酶/糜蛋白酶雙酶反應(yīng)器,與單酶反應(yīng)器相比,雙酶反應(yīng)器可鑒定的多肽片段數(shù)目增加1倍,提高了大鼠肝臟膜蛋白的總體功能分析。Xu等[43]研發(fā)了一種新的介孔二氧化硅納米顆粒,與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)原位共聚制備整體柱,對(duì)胃蛋白酶進(jìn)行固載,實(shí)現(xiàn)了藥物的手性拆分,研究發(fā)現(xiàn),硅納米顆粒的引入大大增加了結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量,增大了酶的固載量,提高了手性拆分的效率。Hong等[44]提出了氧化石墨烯硅膠整體柱固載胃蛋白酶,研究了氨水、乙二胺和聚乙烯亞胺等不同修飾方法和間臂分子對(duì)氧化石墨烯負(fù)載量的影響。

    5 結(jié)論與展望

    整體柱具有制備簡(jiǎn)單、力學(xué)強(qiáng)度高和通透性好等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于酶的固定化。本文中,筆者總結(jié)了硅膠整體柱、有機(jī)聚合物整體柱、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱和納米材料整體柱固載酶的構(gòu)建方法、應(yīng)用及各自的優(yōu)缺點(diǎn),為提高酶催化的性能提供了新的思路和方法。在今后的研究中,仍然需要開發(fā)簡(jiǎn)單易控的整體柱制備技術(shù),或?qū)ΜF(xiàn)有制備技術(shù)的工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化,改善整體柱形貌和孔道的均勻性,提高整體柱的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,繼續(xù)發(fā)展新型高效的固定化酶方法,實(shí)現(xiàn)整體柱固載酶的工業(yè)化應(yīng)用。

    猜你喜歡
    甲基丙烯酸雜化硅烷
    超支化聚碳硅烷結(jié)構(gòu)、交聯(lián)方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展
    高效液相色譜法測(cè)定聚甲基丙烯酸酯食品材料中甲基丙烯酸酯及甲基丙烯酸向模擬食品液的遷移量
    硅烷包覆膨脹型阻燃劑共混改性粘膠纖維的研究
    α-細(xì)辛腦脂質(zhì)聚合物雜化納米粒的制備及表征
    甲基丙烯酸鈰補(bǔ)強(qiáng)天然橡膠的性能研究
    乙烯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯三元共聚物增韌PBT的研究
    元素雜化阻燃丙烯酸樹脂的研究進(jìn)展
    化學(xué)教學(xué)中的分子雜化軌道學(xué)習(xí)
    元素雜化阻燃聚苯乙烯的研究進(jìn)展
    LncRNA PCA3在甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯誘導(dǎo)16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)及意義
    久久中文看片网| 俄罗斯特黄特色一大片| 九色国产91popny在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲国产精品sss在线观看| 中文在线观看免费www的网站 | 超碰成人久久| 最近最新免费中文字幕在线| www.自偷自拍.com| www.精华液| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产男靠女视频免费网站| 日本在线视频免费播放| 香蕉国产在线看| 免费高清在线观看日韩| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲成人免费电影在线观看| 成人精品一区二区免费| 老司机福利观看| 日韩高清综合在线| 99re在线观看精品视频| 久久精品91蜜桃| 色播在线永久视频| www.精华液| 后天国语完整版免费观看| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜福利18| 在线观看66精品国产| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜久久久在线观看| 国产av又大| 男女之事视频高清在线观看| 免费av毛片视频| 成人国产一区最新在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩欧美国产在线观看| x7x7x7水蜜桃| 国产精品 国内视频| 色综合站精品国产| 两个人免费观看高清视频| 12—13女人毛片做爰片一| 搞女人的毛片| 欧美久久黑人一区二区| 国产亚洲欧美98| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天天添夜夜摸| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 日韩精品中文字幕看吧| 窝窝影院91人妻| 午夜成年电影在线免费观看| 禁无遮挡网站| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久久久久久黄片| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产99久久九九免费精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 99热6这里只有精品| 一级片免费观看大全| or卡值多少钱| 午夜免费观看网址| 色在线成人网| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费无遮挡裸体视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲 欧美一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 免费观看人在逋| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一级毛片高清免费大全| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 1024手机看黄色片| 满18在线观看网站| 久久香蕉国产精品| 国产免费av片在线观看野外av| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久久国产成人免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 免费av毛片视频| 精品久久久久久,| 午夜视频精品福利| 激情在线观看视频在线高清| 精品高清国产在线一区| 亚洲第一av免费看| 午夜福利高清视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 9191精品国产免费久久| 日韩欧美国产在线观看| 中出人妻视频一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 丝袜人妻中文字幕| tocl精华| 婷婷丁香在线五月| 99久久综合精品五月天人人| 俺也久久电影网| 久久国产乱子伦精品免费另类| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| cao死你这个sao货| 久久中文字幕人妻熟女| 长腿黑丝高跟| 99热只有精品国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成人av一区二区三区在线看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 中出人妻视频一区二区| 精品欧美国产一区二区三| 国产高清有码在线观看视频 | 国产av一区在线观看免费| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产成人精品久久二区二区免费| 伦理电影免费视频| 成人亚洲精品av一区二区| 很黄的视频免费| 美女 人体艺术 gogo| a在线观看视频网站| 日本免费a在线| 国产午夜精品久久久久久| 草草在线视频免费看| 成人国产一区最新在线观看| 日本成人三级电影网站| 欧美性长视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 成人欧美大片| 中文字幕久久专区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 麻豆国产av国片精品| 国产成人精品久久二区二区91| 国产午夜精品久久久久久| 久久久久久久久久黄片| 午夜福利欧美成人| 亚洲全国av大片| 免费在线观看影片大全网站| 国产一区二区三区视频了| 亚洲电影在线观看av| 在线观看66精品国产| 女性被躁到高潮视频| 色综合婷婷激情| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕最新亚洲高清| 日本三级黄在线观看| 精品久久蜜臀av无| 成人国语在线视频| 婷婷丁香在线五月| www国产在线视频色| x7x7x7水蜜桃| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久精品91无色码中文字幕| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 男女午夜视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 国产成人欧美| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 丝袜在线中文字幕| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天堂影院成人在线观看| 日韩欧美在线二视频| 99热这里只有精品一区 | 国产成人精品久久二区二区免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 宅男免费午夜| 国产精品久久久久久精品电影 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| e午夜精品久久久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产激情欧美一区二区| 丁香六月欧美| 久久久久久久久中文| 国产伦在线观看视频一区| netflix在线观看网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费在线观看日本一区| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久久久久久久中文| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一本综合久久免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一区二区三区激情视频| 亚洲 国产 在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 午夜福利欧美成人| av在线播放免费不卡| av在线播放免费不卡| 99re在线观看精品视频| 美女免费视频网站| 国产一区在线观看成人免费| 国产在线观看jvid| 亚洲片人在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 露出奶头的视频| 久久久精品欧美日韩精品| 天天添夜夜摸| 黑丝袜美女国产一区| 久久中文字幕人妻熟女| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品免费久久久久久久清纯| 人成视频在线观看免费观看| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲免费av在线视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产单亲对白刺激| 特大巨黑吊av在线直播 | 亚洲全国av大片| 无遮挡黄片免费观看| 草草在线视频免费看| 精品乱码久久久久久99久播| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 正在播放国产对白刺激| 欧美大码av| 麻豆一二三区av精品| 搞女人的毛片| 婷婷精品国产亚洲av| 黄色 视频免费看| 国产男靠女视频免费网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 黄色女人牲交| 在线天堂中文资源库| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久国内视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 特大巨黑吊av在线直播 | 美女午夜性视频免费| 免费电影在线观看免费观看| videosex国产| 免费搜索国产男女视频| 制服诱惑二区| 国内精品久久久久久久电影| 国产97色在线日韩免费| 婷婷丁香在线五月| 我的亚洲天堂| 在线观看舔阴道视频| 国产精品免费视频内射| 午夜福利高清视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 母亲3免费完整高清在线观看| 国产真实乱freesex| 成人国语在线视频| 日本三级黄在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美精品亚洲一区二区| 自线自在国产av| 美女大奶头视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 91av网站免费观看| 一区二区三区精品91| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 中文字幕久久专区| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 婷婷精品国产亚洲av在线| 宅男免费午夜| 男女之事视频高清在线观看| 国产色视频综合| 免费在线观看成人毛片| 亚洲avbb在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 色老头精品视频在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| av有码第一页| 亚洲国产精品成人综合色| 制服诱惑二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 可以在线观看毛片的网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费av毛片视频| 90打野战视频偷拍视频| 欧美zozozo另类| 一进一出抽搐动态| 国产精品永久免费网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲成人久久爱视频| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美日韩精品网址| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 三级毛片av免费| 日本在线视频免费播放| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 中文亚洲av片在线观看爽| 波多野结衣av一区二区av| 天堂动漫精品| 麻豆av在线久日| 老司机福利观看| 在线观看舔阴道视频| 一区二区三区激情视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 搡老熟女国产l中国老女人| 999精品在线视频| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 午夜免费激情av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久精品国产综合久久久| 一区二区三区高清视频在线| 香蕉av资源在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产日本99.免费观看| 久久 成人 亚洲| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品久久久久久久毛片微露脸| 最近在线观看免费完整版| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 精品国产美女av久久久久小说| 日本a在线网址| 欧美黄色淫秽网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久精品人妻少妇| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 免费在线观看影片大全网站| 1024香蕉在线观看| 精品久久久久久久末码| 亚洲精品国产一区二区精华液| 91九色精品人成在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 又大又爽又粗| 99热这里只有精品一区 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品久久久久久精品电影 | 99精品在免费线老司机午夜| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品一区二区三区四区久久 | 女人被狂操c到高潮| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一a级毛片在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 88av欧美| 日韩大码丰满熟妇| 最新美女视频免费是黄的| 久久香蕉精品热| 欧美午夜高清在线| 亚洲精华国产精华精| 桃色一区二区三区在线观看| 国产1区2区3区精品| 大型黄色视频在线免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 久久精品人妻少妇| 国产午夜精品久久久久久| 两性夫妻黄色片| 国内精品久久久久精免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产一卡二卡三卡精品| 桃红色精品国产亚洲av| 级片在线观看| 国产黄片美女视频| 午夜福利欧美成人| 男女视频在线观看网站免费 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品电影一区二区三区| 一区二区三区高清视频在线| 变态另类丝袜制服| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 一进一出抽搐gif免费好疼| www日本黄色视频网| 久久亚洲真实| 伦理电影免费视频| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 国产人伦9x9x在线观看| 在线观看www视频免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲在线自拍视频| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产一区在线观看成人免费| 久久久久久久精品吃奶| 国产久久久一区二区三区| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲久久久国产精品| 麻豆国产av国片精品| 国产99久久九九免费精品| 午夜福利高清视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产单亲对白刺激| 成年版毛片免费区| 国产精品久久久人人做人人爽| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美大码av| 国产成人欧美| 嫩草影院精品99| 中出人妻视频一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产不卡一卡二| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 中出人妻视频一区二区| 淫秽高清视频在线观看| 欧美日韩乱码在线| 欧美中文综合在线视频| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜激情福利司机影院| 91九色精品人成在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 中国美女看黄片| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品影院久久| 欧美日韩乱码在线| 国产激情久久老熟女| 国语自产精品视频在线第100页| 黄色女人牲交| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 9191精品国产免费久久| 精品久久久久久,| 日韩大码丰满熟妇| 成人一区二区视频在线观看| 午夜免费成人在线视频| 欧美zozozo另类| 正在播放国产对白刺激| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲性夜色夜夜综合| 99热这里只有精品一区 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久香蕉国产精品| 欧美黄色淫秽网站| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品美女久久av网站| 狂野欧美激情性xxxx| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产成人欧美在线观看| 黄色成人免费大全| 一二三四社区在线视频社区8| 桃色一区二区三区在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 哪里可以看免费的av片| 中出人妻视频一区二区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久水蜜桃国产精品网| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 91av网站免费观看| 一本精品99久久精品77| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 此物有八面人人有两片| 母亲3免费完整高清在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品 国内视频| 亚洲午夜理论影院| 1024香蕉在线观看| 久久久久国内视频| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜福利一区二区在线看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产乱人伦免费视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲精品在线美女| 成人午夜高清在线视频 | 在线观看一区二区三区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产av不卡久久| 成人三级做爰电影| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美黑人巨大hd| 99国产精品99久久久久| 婷婷六月久久综合丁香| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 久久中文字幕一级| 九色国产91popny在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 青草久久国产| 国产精品1区2区在线观看.| a级毛片a级免费在线| 午夜久久久久精精品| 日本五十路高清| 麻豆国产av国片精品| 免费无遮挡裸体视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品久久久久久久久久久久久 | 国产精品免费一区二区三区在线| 国产日本99.免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 99热这里只有精品一区 | 亚洲中文av在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 免费看a级黄色片| 最近在线观看免费完整版| 亚洲一区中文字幕在线| av在线天堂中文字幕| 黄色a级毛片大全视频| 久久狼人影院| 操出白浆在线播放| 一级黄色大片毛片| 成人午夜高清在线视频 | 一进一出好大好爽视频| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品国产区一区二| 久久精品成人免费网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 在线天堂中文资源库| 国产精品永久免费网站| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 国产精品99久久99久久久不卡| 久久中文字幕一级| 我的亚洲天堂| 国产av一区二区精品久久| 久久这里只有精品19| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久久久久久久久黄片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久精品人妻少妇| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久精品91蜜桃| 欧美在线一区亚洲| 搡老熟女国产l中国老女人| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 最好的美女福利视频网| 人人妻人人澡人人看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产99久久九九免费精品| 午夜福利一区二区在线看| 老司机午夜福利在线观看视频| 男人舔女人的私密视频| 香蕉国产在线看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产黄色小视频在线观看| 美国免费a级毛片| 久久香蕉国产精品| 两个人看的免费小视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 成人国语在线视频| 国产精品影院久久| 人人妻人人澡人人看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| a在线观看视频网站| 国产黄片美女视频| 日本 欧美在线| 国产黄片美女视频| 大型av网站在线播放| 亚洲最大成人中文| 国产高清有码在线观看视频 | 国产色视频综合| 国产精品免费视频内射| 欧美在线一区亚洲| 国产乱人伦免费视频| 亚洲av熟女| 日本熟妇午夜| 黄频高清免费视频| 搞女人的毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产免费男女视频| 香蕉丝袜av| 亚洲专区字幕在线| 两个人视频免费观看高清| 天天一区二区日本电影三级| 91成年电影在线观看| 中文资源天堂在线| 满18在线观看网站| 日本成人三级电影网站| 午夜精品在线福利| 韩国精品一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 美女午夜性视频免费| 级片在线观看| 黄色视频不卡|