大DNA體內(nèi)組裝技術(shù)進(jìn)展

王培霞，馬 淵，吳 毅

(1. 天津大學(xué) 化工學(xué)院 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2. 天津大學(xué) 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心 合成生物學(xué)研究平臺，天津 300072)

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，人類對遺傳信息的讀取認(rèn)知呈爆炸式增長，與此同時(shí)，編寫DNA的尺度也不斷延伸，逐漸由單個(gè)基因、某一代謝通路向完整基因組拓展。研究對象復(fù)雜性的提升對大尺度DNA的合成與組裝提出了更高的需求。由于大尺度DNA在體外操作時(shí)極易斷裂，因此，組裝100 kb以上的DNA分子一般選擇在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行[1]?；卺劸平湍浮⒋竽c桿菌和枯草芽孢桿菌這些模式生物自身的高效重組機(jī)制，研究者開發(fā)了一系列的大尺度DNA的體內(nèi)組裝技術(shù)，已經(jīng)用于合成與組裝外源代謝途徑、病毒基因組、細(xì)菌基因組、酵母基因組和高等生物某些基因或染色體區(qū)域。本文中，筆者綜述基于大腸桿菌、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的體內(nèi)大DNA組裝技術(shù)的研究進(jìn)展，為研究者提供參考和借鑒。

1 基于大腸桿菌重組機(jī)制的組裝技術(shù)

大腸桿菌存在天然的重組系統(tǒng)——RecA重組系統(tǒng)[2]。RecA重組系統(tǒng)由RecA和RecBCD組成，RecA蛋白促進(jìn)2個(gè)DNA分子之間的同源聯(lián)合和置換，RecBCD是RecB、RecC和RecD組成的復(fù)合體，依賴于ATP發(fā)揮核酸外切酶和解旋酶作用。RecBCD與雙鏈DNA分子末端結(jié)合，使DNA雙鏈解鏈形成單鏈，然后由RecA蛋白催化進(jìn)行同源重組。在實(shí)際應(yīng)用中，RecA重組系統(tǒng)效率較低，因此其應(yīng)用有限。1998年，Zhang等[3]報(bào)道了一種更高效的大腸桿菌體內(nèi)重組系統(tǒng)——λRed/ET重組系統(tǒng)，其中，λRed重組系統(tǒng)由λ噬菌體中的3個(gè)基因exo(Redα)、bet(Redβ)和gam(Redγ)組成[4]，Redα具有5′→3′方向的核酸外切酶活性，從5′端切割雙鏈DNA分子，產(chǎn)生3′端突出末端。然后單鏈DNA結(jié)合蛋白Redβ和RecT結(jié)合到3′突出末端，一方面保護(hù)單鏈DNA末端不被細(xì)胞內(nèi)的單鏈核酸酶降解，另一方面能介導(dǎo)外源單鏈DNA退火，導(dǎo)致DNA分子同源區(qū)域的復(fù)制和交換，從而發(fā)生重組。Redγ蛋白結(jié)合大腸桿菌自身的RecBCD復(fù)合蛋白，抑制RecBCD的核酸外切酶活性，防止宿主對外源線性DNA的降解[5]。λRed/ET重組系統(tǒng)的同源序列只要達(dá)到50 bp，就能實(shí)現(xiàn)片段與片段、片段與載體以及片段與基因組之間的同源重組。此外，將λRed/ET重組系統(tǒng)和Cre/loxP、FLP/FRT等位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)DNA元件的組裝、克隆、置換、敲除和突變[6-7]。

2005年，Wenzel等[8]利用RecET重組系統(tǒng)在大腸桿菌中重建了來自枳實(shí)(Stigmatellaaurantiaca)的黏液色素S生物合成的基因簇(長度為43 kb)，其中包含了在異源宿主假單胞菌中表達(dá)所需的基因元件。2007年，Smailus等[9]利用λRed重組系統(tǒng)開發(fā)了一種載體系統(tǒng)，利用細(xì)菌F-質(zhì)粒載體在大腸桿菌體內(nèi)迭代組裝大DNA分子，構(gòu)建2種F-質(zhì)粒載體實(shí)現(xiàn)抗生素轉(zhuǎn)換。利用λRed重組系統(tǒng)介導(dǎo)的迭代組裝，成功重建了流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)基因組的2個(gè)非連續(xù)區(qū)域，總長度190 kb，占流感嗜血桿菌基因組的10.4%。該方法原則上可用于構(gòu)建完整的流感嗜血桿菌基因組。2012年，Stewart研究團(tuán)隊(duì)的Fu等[10]利用RecET重組系統(tǒng)介導(dǎo)的高效同源重組機(jī)制，將發(fā)光腸桿菌(Photorhabdusluminescens)的所有巨型合成酶基因(每個(gè)長度為10～52 kb)直接克隆到大腸桿菌的載體上，并在異源宿主中表達(dá)了其中的2個(gè)基因。由此可見，λRed/ET重組系統(tǒng)操作簡單，是在大腸桿菌中組裝長片段DNA的有力工具，由于宿主易培養(yǎng)、易擴(kuò)增、易分子操作，使得λRed/ET大腸桿菌重組系統(tǒng)具有組裝周期短、方便轉(zhuǎn)移到其他表達(dá)宿主等優(yōu)點(diǎn)。

2 基于釀酒酵母同源重組機(jī)制的組裝技術(shù)

釀酒酵母具有從體外吸收并在體內(nèi)組裝DNA片段的能力，并且其同源重組效率非常高，常常用于體內(nèi)多片段DNA的組裝[11-13]。編碼整個(gè)異源的代謝通路通常需要組裝多個(gè)基因片段，利用酵母體內(nèi)同源重組可以一步組裝整個(gè)代謝通路[14]，組裝效率高達(dá)70%～100%。2015年，Guo等[15]開發(fā)了YeastFab組裝方法，利用該方法可以一步將標(biāo)準(zhǔn)化的生物元件組裝為轉(zhuǎn)錄單元，并且利用多種啟動(dòng)子元件的組合組裝來優(yōu)化代謝通路。染色體和基因組的合成也廣泛使用了酵母組裝技術(shù)。2006年，美國科學(xué)院院士Jef.Boeke發(fā)起人工合成酵母基因組計(jì)劃(Sc2.0)，旨在化學(xué)合成世界上首個(gè)真核生物基因組。釀酒酵母16條染色體的合成正是依賴于自身高效的同源重組機(jī)制。酵母長染色體的合成是一個(gè)多層次逐級組裝的過程，首先由化學(xué)合成的單鏈DNA體外組裝為750 bp的雙鏈DNA磚塊(building blocks)，并且在體外進(jìn)一步組裝成2～3 kb的小模塊(minichunks)，或者繼續(xù)組裝成8～10 kb的大模塊(megachunks)，然后一次將6～12個(gè)模塊導(dǎo)入酵母體內(nèi)，利用同源重組完成大片段DNA組裝以及對應(yīng)野生型染色體序列的替換。通過多輪的順序組裝與替換，最終實(shí)現(xiàn)完整合成型染色體的組裝，并且替換掉原有的野生型染色體[16]。

3 基于枯草芽孢桿菌重組機(jī)制的組裝技術(shù)

枯草芽孢桿菌具有吸收外源DNA的能力，外源質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌內(nèi)復(fù)制時(shí)會出現(xiàn)不穩(wěn)定的單鏈DNA形式，導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失，一般通過RecA介導(dǎo)的同源重組將外源DNA整合到宿主染色體上以實(shí)現(xiàn)外源DNA的穩(wěn)定[22]。1995年，Itaya[23]采用枯草芽孢桿菌基因組(BGM)作為DNA克隆的載體，組裝了長達(dá)48.5 kb的大腸桿菌原噬菌體的λDNA。2000年，為了測試枯草芽孢桿菌載體系統(tǒng)構(gòu)建大尺度DNA的能力，Itaya等[24]和Iwata等[25]將長度約120 kb的小鼠基因組DNA克隆到枯草芽孢桿菌的基因座中，并且可以維持小鼠DNA的穩(wěn)定性?；贐GM載體系統(tǒng)，通過兩段小DNA序列(LPS)的定位和定向結(jié)合發(fā)展了長片段DNA克隆方法——尺度延伸法(inchworm elongation method)。研究者利用這種組裝方法組裝了光合細(xì)菌藍(lán)藻PCC6803的基因組，成功把3.5 Mb的藍(lán)藻PCC6803基因組整合到4.2 Mb的枯草芽孢桿菌BGM載體上形成一個(gè)7.7 Mb的雜合基因組[26]。由于尺度延伸法需要高純度的長片段(超過100 kb)的DNA模板，一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。除此之外，BGM載體系統(tǒng)還存在載體同源序列之間非理性重組的問題。

為了提高尺度延伸法的組裝效率以及可操作性，Itaya等[27]開發(fā)了多米諾骨牌法(domino method)組裝技術(shù)。多米諾骨牌法通過兩種抗生素標(biāo)記基因的交替使用，在BGM載體中進(jìn)行多輪多米諾片段延伸來組裝超大DNA片段。Itaya等[27]利用多米諾骨牌法成功將16.3 kb的小鼠線粒體基因組和134.5 kb的水稻葉綠體基因組整合到BGM載體上。為減少組裝大片段所需步驟，需要增加多米諾骨牌DNA的長度，可以利用大腸桿菌來源的細(xì)菌人工染色體(BAC)提供長度約為100 kb的DNA片段用于多米諾骨牌法[28]。以枯草芽孢桿菌為宿主開發(fā)的組裝技術(shù)僅能穩(wěn)定維持GC含量在44%以下的外源大DNA片段(長度大于200 kb)[28]。此外，為了避免非理性重組問題，Ogawa等[29]開發(fā)了RecA誘導(dǎo)型BGM載體(iREX)，使RecA的表達(dá)受到培養(yǎng)基中木糖的控制，在缺乏木糖的條件下，RecA在iREX系統(tǒng)中不表達(dá)，相反，存在木糖的條件下則誘導(dǎo)RecA表達(dá)，使iREX能夠發(fā)揮與BGM載體相同的組裝能力，提高了BGM載體系統(tǒng)的嚴(yán)謹(jǐn)性。

4 體內(nèi)組裝技術(shù)用于合成基因組學(xué)

基因組學(xué)研究由“讀”到“寫”的轉(zhuǎn)變造就了合成基因組學(xué)領(lǐng)域的萌發(fā)和快速發(fā)展。合成基因組學(xué)通過對基因組進(jìn)行理性設(shè)計(jì)與化學(xué)合成，實(shí)現(xiàn)改造生命形式和重塑生命功能。縱觀合成基因組學(xué)的發(fā)展歷程，合成基因組學(xué)的研究對象實(shí)現(xiàn)了由病毒到原核生物再到真核生物的發(fā)展，設(shè)計(jì)的復(fù)雜度也由簡單的復(fù)制序列發(fā)展為多元化甚至顛覆性的基因組重塑。

4.1 病毒基因組合成

2002年，Cello等[30]在沒有天然模板的情況下化學(xué)合成了脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA。脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組是合成基因組研究的開端[31]。從長度約為69 nt的寡核苷酸出發(fā)，利用其末端具有重疊的互補(bǔ)序列來合成400～600 bp的短片段，然后將片段連接到質(zhì)粒載體中，再進(jìn)一步酶切連接成長片段。最后通過酶切連接3個(gè)長片段，得到全長的脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA。通過此方法化學(xué)合成的病毒cDNA成功轉(zhuǎn)錄成病毒RNA，產(chǎn)生具有感染性的病毒。盡管脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA大小僅為7 740 bp，科學(xué)家卻花費(fèi)了數(shù)個(gè)月的時(shí)間來化學(xué)合成其基因組。J.Craig Venter實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)了之前的方法，開發(fā)了自動(dòng)化的數(shù)字生物轉(zhuǎn)換器，明顯縮短了從合成寡核苷酸到組裝5～6 kb片段所需的時(shí)間，采用該方法，Venter實(shí)驗(yàn)室的Smith等[32]僅用兩周時(shí)間組裝了長度5 386 bp的完整噬菌體φX174基因組[32]。

上述病毒基因組合成均是對野生型基因組序列的嚴(yán)格合成，為了實(shí)現(xiàn)不同的研究目標(biāo)，可能需要對基因組進(jìn)行人工設(shè)計(jì)。2005年，Chan等[33]為了實(shí)現(xiàn)基因組的物理分離并實(shí)現(xiàn)對某些遺傳元件的單獨(dú)操縱，重新設(shè)計(jì)了T7噬菌體的基因組，并且將基因組的左邊11 515 bp的序列替換為12 179 bp的設(shè)計(jì)序列，由此產(chǎn)生的半合成型噬菌體能夠存活且和野生型噬菌體無異，該研究表明了重新設(shè)計(jì)和構(gòu)建天然生物體基因組的可行性。

4.2 細(xì)菌全基因組合成

2008年，F(xiàn)raser等[34]完成了生殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)基因組的人工合成，命名為JCVI-1.0。這個(gè)人工合成的基因組全長582 970 bp，含有野生型生殖道支原體G37的所有基因(除MG408外)。生殖道支原體是能在自然條件下生長的最小的生物體，其基因組大小是φX174的100倍。合成JCVI-1.0基因組以5～7 kb的基因片段為原材料，體外重組法逐步組裝長度更大的中間體，將中間體組裝在大腸桿菌的BAC上。最后，通過釀酒酵母組裝成完整的合成型基因組[35]。此方法成功構(gòu)建了正確的全基因組序列，但是組裝過程更多地依賴于體外酶促反應(yīng)，操作繁瑣，而且從酵母中提取組裝的大片段DNA效率較低。2010年，Lartique等[36]利用酵母同源重組完成了長度為1.08 Mb的蕈狀支原體(Mycoplasmamycoides)JCVI-syn1.0基因組的設(shè)計(jì)與合成，并將其成功移植到受體細(xì)胞山羊支原體(Mycoplasmacapricolum)中，產(chǎn)生新的支原體細(xì)胞，細(xì)胞中含有的DNA全部為合成型DNA序列，新細(xì)胞具有預(yù)期的表型特性，并且能夠連續(xù)自我復(fù)制[37]。2016年，在JCVI-syn1.0的基礎(chǔ)上，Hutchison等[38]通過不斷再設(shè)計(jì)、合成和測試，產(chǎn)生了更加精簡的合成型基因組JCVI-syn3.0(長度531 kb，包含473個(gè)基因)，這對于研究生命的核心功能和探索全基因組設(shè)計(jì)合成有重大意義。JCVI-syn3.0的組裝過程與JCVI-syn1.0基本相同，都是借助了釀酒酵母高效的同源重組系統(tǒng)，但是在酵母中提取大DNA片段用于下一步組裝時(shí)，兩者采用了不同的技術(shù)。JCVI-syn3.0利用了滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification)的方法取代了在JCVI-syn1.0中低效的脈沖場凝膠片段回收方法。

已經(jīng)組裝成功的蕈狀支原體基因組具有不采用通用遺傳編碼的特點(diǎn)，其UGA編碼色氨酸而非終止密碼子，該特性避免了對組裝宿主酵母產(chǎn)生細(xì)胞毒性。在另一項(xiàng)工作中，Karas等[39]合成1.5 Mb的無膽甾原體(Acholeplasmalaylawii)PG-8A的基因組，該基因組使用通用遺傳密碼，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)基因的克隆對酵母具有毒性，導(dǎo)致無法組裝出全長的無膽甾原體基因組。通過滅活該基因，可以維持無膽甾原體基因組在酵母細(xì)胞中的穩(wěn)定遺傳[39]。此外，海洋藍(lán)細(xì)菌原綠球藻(Prochlorococcusmarinus)MED4基因組也在酵母中實(shí)現(xiàn)組裝，該基因組長度1.66 Mb，GC含量和釀酒酵母相似，且基因組上均勻分布了酵母復(fù)制起始位點(diǎn)序列(ARS)，研究發(fā)現(xiàn)該基因組能夠穩(wěn)定遺傳[40]。Heuer等[41]克隆GC含量為66%的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)染色體，成功克隆的DNA片段大小均小于120 kb。構(gòu)建GC含量為69%的黃色黏球菌(Myxococcusxanthus)線性酵母人工染色體(YAC)文庫，成功插入的DNA片段大小為40～180 kb。組裝基因組GC含量為55%的細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcuselongatus)PCC 7942，發(fā)現(xiàn)在酵母中不能穩(wěn)定維持超過約200 kb的DNA片段，通過添加酵母復(fù)制起點(diǎn)序列，使得組裝長度達(dá)到454 kb以上。由此可見，酵母可以組裝并穩(wěn)定維持GC含量在32%～38%之間的細(xì)菌基因組序列[37,39-40]，但是高GC含量可能會限制酵母克隆DNA的長度，利用酵母組裝高GC含量的長片段DNA序列時(shí)，應(yīng)在合成序列中額外添加酵母復(fù)制起始位點(diǎn)作為維持外源DNA穩(wěn)定的元件[42]。

4.3 真核全基因組合成

在人工合成酵母基因組計(jì)劃中，Gibson[13]提出了三項(xiàng)設(shè)計(jì)原則：1)包含合成型染色體的細(xì)胞應(yīng)與野生型細(xì)胞有相似的表型和適應(yīng)性；2)通過刪除一些不穩(wěn)定的序列和元件，增加合成型基因組的穩(wěn)定性；3)通過引入合成生物學(xué)元件增加合成型基因組的遺傳操作靈活性。在此設(shè)計(jì)原則基礎(chǔ)上，合成型酵母的基因組與野生型基因組相比縮減了約8%，有約1.1 Mb的序列被刪除、插入或者修改。2011年，研究者率先合成了一部分的真核生物染色體——釀酒酵母Ⅸ號染色體右臂(synIXR)和Ⅵ號染色體左臂(synVIL)[13]。2014年，Annaluru等[43]報(bào)道了首條完整的合成型真核生物染色體——合成型三號染色體(synIII)，從野生型長度為316 617 bp釀酒酵母三號染色體出發(fā)，最終合成1條有功能的長度縮短為272 871 bp的synIII。

2017年，Sc2.0團(tuán)隊(duì)完成了釀酒酵母synII、synV、synVI、synX和synXII共5條合成型染色體的從頭設(shè)計(jì)與合成[44-48]，宣布合成型酵母基因組1/3的工作完成。Shen等[44]報(bào)道了完成長度為770 035 bp的釀酒酵母二號染色體的合成，并且使用多組學(xué)的手段(表型組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組)綜合表征了synII。Xie等[45]報(bào)道了精確匹配設(shè)計(jì)序列的長度為536 024 bp的釀酒酵母五號染色體的合成，并且構(gòu)建了一個(gè)環(huán)形synV的衍生形式，研究人員使用共轉(zhuǎn)化和CRISPR/Cas9修復(fù)了22處堿基突變，構(gòu)建的synV菌株在各種檢測條件下與野生型菌株相比都沒有顯著差異。Mitchell等[46]報(bào)道了設(shè)計(jì)、組裝和表征長度為242 745 bp合成型六號酵母染色體synVI，研究人員還首次將3條合成型的染色體(synIII、synVI和synIXR)組合在一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)，雖然包含3條合成型染色體的酵母有輕微的長勢問題，但是極大地推動(dòng)了全合成酵母基因組的進(jìn)程。Wu等[47]報(bào)道了化學(xué)合成了設(shè)計(jì)長度為707 459 bp的釀酒酵母十號染色體(synX)，并且開發(fā)了一種命名為混菌PCR標(biāo)簽定位(pooled PCR Tag mapping[PoPM])的高通量定位策略用于高效識別合成型染色體組裝過程中出現(xiàn)的生長缺陷靶點(diǎn)(bug)，排除缺陷靶點(diǎn)之后的合成型酵母十號染色體菌株在測試的各種培養(yǎng)條件包括高靈敏度的競爭生長實(shí)驗(yàn)中都展示了與野生型很相似的生長狀態(tài)。Zhang等[48]報(bào)道了設(shè)計(jì)合成長度為976 067 bp的合成型十二號染色體synXII，使用合成型DNA片段迭代替換和減數(shù)分裂同源重組2種策略結(jié)合的方式，組裝了全長的synXII，研究人員還將釀酒酵母十二號染色體上的核糖體基因簇(rDNA)區(qū)域刪除并且在染色體其他3處位置引入貝酵母(Saccharomycesbayanus)的rDNA序列。Sc2.0項(xiàng)目的階段成果奠定了對更大尺度、更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的基因組進(jìn)行設(shè)計(jì)與編寫的基礎(chǔ)。表1總結(jié)了大DNA組裝的應(yīng)用實(shí)例。

表1 大DNA組裝匯總

此外，Karas等[49]還在酵母中進(jìn)行了其他真核生物染色體的組裝工作。以TAR(transformation associated recombination)克隆技術(shù)得到的約100 kb DNA片段出發(fā)，三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的25和26號染色體(長度分別為497和441 kb)在酵母體內(nèi)完成組裝，研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母復(fù)制起點(diǎn)序列能夠改善酵母中大DNA的穩(wěn)定維持，且純化待組裝的DNA片段可以提高組裝效率。此外，超過1 Mb的人類淋巴母細(xì)胞DNA以及長達(dá)2.3 Mb的大尺度DNA已經(jīng)在YAC上成功組裝，并且實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染[50-51]。

盡管DNA的測序以及編輯技術(shù)在快速發(fā)展，但是在細(xì)胞中構(gòu)建和表達(dá)大尺度DNA的過程卻受到了不少限制，這阻礙了對生物系統(tǒng)的全面理解和改造能力。2016年6月，Boeke等[52]宣布合成基因組學(xué)的旗艦項(xiàng)目——基因組編寫計(jì)劃(Genome Project-Write(GP-Write))正式啟動(dòng)。基因組編寫計(jì)劃是一個(gè)開放的、國際合作項(xiàng)目，由多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域的科學(xué)家共同參與，包括生物學(xué)、化學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、工程、社會科學(xué)和生物倫理學(xué)?；蚪M編寫計(jì)劃的主要目標(biāo)是在10年內(nèi)，在細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)大基因組的工程改造和檢測，并且降低成本1 000倍以上。人類基因組編寫計(jì)劃(HGP-Write)還致力于為挑戰(zhàn)人類健康的疾病提供解決方法，其潛在應(yīng)用包括：培育可供移植的人體器官，細(xì)胞系全基因組重編碼獲得對病毒的免疫作用，將癌癥抗性引入細(xì)胞系中用于癌癥治療，加速實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、效益均衡的疫苗生產(chǎn)等。

5 結(jié)論與展望

目前，大尺度DNA分子組裝仍然主要依賴微生物宿主細(xì)胞的同源重組系統(tǒng)在胞內(nèi)進(jìn)行。不同的宿主細(xì)胞的同源重組各有其特點(diǎn)，根據(jù)不同的組裝需求選擇合適的組裝技術(shù)。基于常用宿主細(xì)胞大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的體內(nèi)重組機(jī)制發(fā)展了一系列體內(nèi)組裝技術(shù)，推動(dòng)全基因組合成的研究。大腸桿菌中的噬菌體重組系統(tǒng)具有組裝周期短、方便轉(zhuǎn)移到其他表達(dá)宿主的優(yōu)點(diǎn)，但是組裝長度一般較小，很少用于全基因組合成?？莶菅挎邨U菌重組系統(tǒng)組裝量大，相對于傳統(tǒng)的載體來說，BGM載體和iREX可操作性好，但是也存在著錯(cuò)誤整合外源基因片段的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)利用BGM作為載體也增加了大尺度DNA轉(zhuǎn)移的難度。依賴于釀酒酵母高效的同源重組系統(tǒng)和便捷的分子操作手段，使之成為目前最受歡迎的大DNA組裝技術(shù)。但是酵母組裝也存在限制因素，比如DNA的GC含量、異源基因的細(xì)胞毒性和缺少原宿主的轉(zhuǎn)錄后修飾都可能影響大DNA組裝效果。

隨著合成基因組學(xué)的發(fā)展，對染色體規(guī)模的大DNA組裝技術(shù)的開發(fā)將變得越來越重要，大DNA組裝技術(shù)還需要在提升組裝效率、降低組裝成本、拓展組裝能力和開發(fā)轉(zhuǎn)移技術(shù)等方面不斷發(fā)展。比如在相關(guān)機(jī)制深入揭示的基礎(chǔ)上，開發(fā)新的分子生物學(xué)工具，突破更大、更復(fù)雜的大DNA組裝技術(shù)，開發(fā)新的宿主用于構(gòu)建含有特殊結(jié)構(gòu)(例如具有高GC含量或高度重復(fù)序列)的大DNA。此外，開發(fā)通用型組裝宿主，便于超大DNA向其他細(xì)胞體系轉(zhuǎn)移也有迫切需要。