化濁抗纖保肝湯對肝炎后肝纖維化大鼠肝纖維化的影響及機制

李瑞東 王力軍

(邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院內(nèi)科，河北 邢臺 054000)

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示，每年肝病患者死亡的人數(shù)約100萬，其中有3%～6%的人會發(fā)展成為肝癌〔1,2〕。肝纖維化是一種發(fā)生于肝臟的炎癥反應(yīng)，主要由肝炎病毒、血吸蟲病、酒精、藥物及毒物等長期持續(xù)損害肝臟，引起肝臟結(jié)締組織過度增生及異常沉積，最終引起肝臟正常結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化和肝功能障礙〔3〕。肝纖維化的病理變化過程是可以預(yù)防和阻斷的。因此，如何預(yù)防、治療及逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程是肝病研究領(lǐng)域的熱點之一。目前，肝纖維化常用西藥和中藥進行治療，但西藥特異性較差，中藥的治療效果較好，具有較好的應(yīng)用前景，但其作用機制尚不完全清楚〔4,5〕?；瘽峥估w保肝湯具有解毒化濁、清熱利濕、益氣扶正、養(yǎng)血生血的功效，對肝纖維化的發(fā)展具有重要作用。本研究通過制備肝纖維化大鼠模型，分析化濁抗纖保肝湯對其肝功能和肝纖維化指標的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD雄性大鼠購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，體重110～130 g，單獨飼喂于室溫20～22℃、相對濕度60%的環(huán)境中，自由采食和飲水。

1.2實驗試劑 化濁抗纖保肝湯由黃芪、黃連、紅景天、三棱、田基黃、茵陳、絞股藍、鱉甲、虎杖等組成。方劑水煎將生藥濃縮至1.5 g/ml。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR mix 購自北京康為世紀有限公司，Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體、Bax兔抗鼠單克隆抗體、增殖細胞核抗原Ki-67兔抗鼠單克隆抗體購自美國Sigma公司；二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；透明質(zhì)酸酶(HA)放射免疫試劑盒、層黏連蛋白(LN)放射免疫試劑盒購自北京海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組 健康SD大鼠隨機分為對照組、模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組，每組10只。

1.3.2造模及給藥處理 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組大鼠給予未經(jīng)滅活的豬血清按0.5 ml/kg經(jīng)腹腔注射，每周2次，連續(xù)6 w。同時模型組、保肝湯1組按0.5 ml·kg-1·d-1給予蒸餾水、化濁抗纖保肝湯濃縮劑灌胃，持續(xù)給藥至第9周；保肝湯2組、保肝湯3組分別在造模第3周和第6周按0.5 ml·kg-1·d-1給予化濁抗纖保肝湯濃縮劑持續(xù)給藥至第9周。對照組按0.5 ml/只經(jīng)腹腔注射生理鹽水，每周2次，連續(xù)6 w，同時經(jīng)灌胃給予蒸餾水至第9周。

1.3.3肝功能指標的檢測 實驗結(jié)束前24 h，各組大鼠禁食24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，剖腹經(jīng)下腔靜脈采血，分離血清，全自動生化分析儀分析肝功能指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。

1.3.4肝纖維化的檢測 實驗結(jié)束前24 h，各組大鼠禁食24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，剖腹經(jīng)下腔靜脈采血，放射法檢測HA、LN指標。

1.3.5細胞增殖與凋亡相關(guān)基因的檢測 采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測肝組織中Bcl-2、Bax、Ki-67 mRNA的水平。利用Primer5.0軟件設(shè)計Bcl-2、Bax、Ki-67引物序列，由上海生物工程有限公司合成，Bcl-2上游序列為5′-CCGAGAGGTCTTCTTCCGTGTG-3′，下游序列為5′-GCCTCAGCCCATCTTCTTCCA-3′，Bax上游序列為5′-CAAGCCGGGAGAACAGGGTA-3′，下游序列為5′-CCCACCGAACTCAAAGAAGGC-3′。Ki-67上游序列為5′-GGACTCGCAGTTTGAGAAGG-3′，下游序列為5′-TGCAAATGTCC TCGTTTCTG-3′。100 mg肝組織加入1 ml TRIzol裂解液提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，GAPDH為參照，進行擴增。反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 90 s，變性94℃ 30 s，退火58℃/57℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，終延伸72℃ 5 min，35個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，結(jié)果經(jīng)凝膠成像分析儀進行分析，與GAPDH產(chǎn)物掃描量的比值為目的基因的相對表達量。

1.3.6細胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白的檢測 Western印跡法檢測肝組織中Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平。取出肝組織100 mg，加入500 μl預(yù)冷的蛋白裂解液，冰浴中超聲震碎，12 000 r/min離心1 h，收集上清。調(diào)整蛋白濃度，取100 μl樣本蛋白按1∶1的比例加入2倍樣品緩沖液，100℃加熱5 min。清洗玻璃板，配置10%的分離膠和4%的濃縮膠，將分離膠加入玻璃板，加入去離子水，靜置至完全聚合，加入濃縮膠，插入樣品梳。加樣，濃縮膠75 V電泳，分離膠120 V電泳。200 mA將蛋白轉(zhuǎn)至大小適中的硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜放入5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入5%脫脂牛奶稀釋的一抗溶液，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次×5 min，加入TBST稀釋二抗，37℃孵育30 min，TBST漂洗3次×5 min，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)液，曝光，顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)記錄蛋白質(zhì)的灰度值，并進行分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組肝功能指標比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組大鼠血清ALT、AST的水平均顯著高于對照組；保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組血清ALT、AST的水平均顯著低于模型組；保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組血清ALT、AST水平顯著升高；保肝湯3組較保肝湯2組血清ALT、AST水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2各組肝纖維化指標比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組血清肝纖維化指標HA、LN水平均顯著高于對照組；保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組血清HA、LN的水平均顯著低于模型組；保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組血清HA、LN水平顯著升高；保肝湯3組較保肝湯2組血清HA、LN水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表1 各組肝功能指標水平比較

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與保肝湯1組比較：3)P<0.01；與保肝湯2組比較：4)P<0.01，下表同

表2 各組肝纖維化指標水平比較

2.3各組細胞增殖與凋亡相關(guān)基因mRNA水平比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Bax、Ki-67 mRNA水平均顯著高于對照組；保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Ki-67 mRNA水平均顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，Bax mRNA水平與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組血清Bcl-2、Ki-67mRNA水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，Bax mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；保肝湯3組較保肝湯2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組細胞增殖與凋亡相關(guān)基因mRNA水平比較

2.4各組細胞增殖與凋亡相關(guān)基因蛋白水平比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平均顯著高于對照組；保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Ki-67蛋白水平均顯著高于模型組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，Bax蛋白水平與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組肝組織Bcl-2、Ki-67蛋白水平顯著降低差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，Bax水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；保肝湯3組較保肝湯2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見圖1和表4。

圖1 各組肝組織Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平比較

組別Bcl-2/GAPDHBax/GAPDHKi-67/GAPDH對照組0.351±0.0450.343±0.0420.532±0.067模型組0.463±0.0251)0.722±0.0581)0.863±0.0691)保肝湯1組0.859±0.0331)2)0.718±0.0851)1.863±0.2591)2)保肝湯2組0.693±0.0711)2)3)0.698±0.0911)1.332±0.1751)2)3)保肝湯3組0.688±0.0971)2)3)0.713±0.0851)1.247±0.2631)2)3)F值112.47249.22271.943P值0.0000.0000.000

3 討 論

肝纖維化是由多種因素引起的慢性肝炎反應(yīng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種慢性肝病，也是肝硬化的必經(jīng)途徑〔6〕。豬血誘導(dǎo)制備大鼠肝纖維化模型，其肝臟病理改變與人臨床肝纖維化癥狀相似，是研究肝纖維化常用的動物模型。目前，ALT、AST是國內(nèi)外肝功能損害的常用檢測標準〔7〕。ALT主要存在于細胞質(zhì)，AST在肝細胞線粒體內(nèi)的含量較高，在急性肝損傷中常用ALT為指標，但AST的含量反映肝細胞的損傷程度〔8〕。當發(fā)生慢性肝炎等疾病時，肝細胞膜的損傷較為嚴重，線粒體則基本完整，ALT穿過細胞質(zhì)進入血液；肝細胞線粒體受損嚴重時，則導(dǎo)致大量AST進入血液〔9〕。因此，在肝功能異常時，血清中ALT、AST的水平反映肝功能的受損程度。肝纖維化發(fā)生時，HA隨著肝纖維化的程度而逐漸升高；當肝纖維化程度減弱時，HA的水平之間下降〔10〕。因此常用血清中HA的含量作為肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的指標。LN是基底膜透明層的主要成分，與肝組織的病理變化有顯著相關(guān)性，其血清中的含量常被用來檢測肝纖維增生的敏感指標〔11〕。本研究結(jié)果提示化濁抗纖保肝湯具有緩解肝纖維化的作用，且作用越早效果越佳，與前期的研究結(jié)果一致〔12〕。肝纖維化由多種原因產(chǎn)生，人們認為細胞的增殖與凋亡是預(yù)防和治療肝纖維化的重要因素之一〔13，14〕。細胞的凋亡過程由多種基因進行調(diào)控，是一個復(fù)雜的過程。其中Bcl-2家族被認為與細胞的凋亡過程密切相關(guān)。Bcl-2通過調(diào)控細胞色素C與凋亡相關(guān)因子的分泌，調(diào)節(jié)細胞的凋亡過程。Bax可與Bcl-2形成異源二聚體參與細胞的凋亡過程。研究表明，當Bax的表達量增加可促進細胞凋亡的發(fā)生〔15〕。當Bcl-2過表達，形成異源二聚體的反應(yīng)增加，降低游離狀態(tài)Bax的水平，抑制細胞的凋亡；當Bax過表達，形成同源二聚體的反應(yīng)增加，發(fā)揮促凋亡的作用。Ki-67分布于細胞周期除G0期以外的其他任何時期，具有半衰期短的特點，在細胞完成有絲分裂后快速降解和失去抗原決定簇，因此常被用來反映細胞增殖活性的敏感指標〔16〕。本研究結(jié)果表明化濁抗纖保肝湯參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，主要通過促進肝細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。