豬尿中氟喹諾酮類藥物殘留的ELISA檢測(cè)

陳浩 洪體玉

摘要：利用氟喹諾酮類殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，測(cè)定豬尿中氟喹諾酮類藥物的殘留量。研究了豬尿樣品本底顏色，蛋白含量以及樣品離心對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，獲得豬尿樣品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)的前處理方法，并通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及豬尿樣品特異性實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了確定。

關(guān)鍵詞：氟喹諾酮類藥物;殘留;酶聯(lián)免疫;豬尿

氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)QNS）藥物是近二十年來快速發(fā)展起來的一類高效抗菌藥。具有抗菌譜廣，高藥效，低毒性，穿透組織能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能有效抑制細(xì)菌DNA螺旋酶的合成^[1]，因此近年來在獸醫(yī)臨床診療和水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為一種不可多得的高效抗感染類藥物得到廣泛應(yīng)用。在大量用于預(yù)防、治療和促進(jìn)個(gè)體生長(zhǎng)的同時(shí)，這類藥物的殘留問題也引起了國(guó)內(nèi)外有關(guān)方面的高度關(guān)注，其殘留的危害性除了對(duì)人類的直接毒副作用和潛在致癌作用外主要報(bào)道為該類藥物容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而不利于該類藥物對(duì)人類相關(guān)疾病的治療作用^[2]。在美國(guó)目前FQNS在食品動(dòng)物中是禁止使用的，為保障食品安全，我國(guó)FQNS殘留也已經(jīng)列為動(dòng)物性食品的一個(gè)重點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，并制定了嚴(yán)格的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。廣西檢驗(yàn)檢疫局按照國(guó)家質(zhì)檢總局的部署，針對(duì)供港澳活豬的獸藥殘留監(jiān)管做了大量卓有成效的工作，制定了詳細(xì)的工作方案，并將供港豬豬尿獸藥殘留作為日常監(jiān)測(cè)的主要內(nèi)容，其中FQNS是主要監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一。

目前，F(xiàn)QNS殘留主要的檢測(cè)方法有：微生物法、液相色譜法（LC）、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、免疫分析法、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）等^[3-5]。這些方法雖各有優(yōu)點(diǎn)，但也存在樣品前處理比較復(fù)雜，操作過程繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，所需儀器要求高等不足，對(duì)于畜牧部門的大批量檢測(cè)并不適用，而間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法具有較高的靈敏度，較強(qiáng)的特異性，樣品測(cè)定前處理簡(jiǎn)單，操作過程只需50分鐘，簡(jiǎn)單快速，能最大程度減少工作量，適合大批量樣品的篩選，尤其便于基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。目前市場(chǎng)上銷售的氟喹諾酮類ELISA試劑盒主要針對(duì)組織樣本如雞肉、豬肉、魚、蝦等和牛奶、奶粉、雞蛋等，沒有明確標(biāo)示豬尿中氟喹諾酮類殘留的檢測(cè)。因此我們通過實(shí)驗(yàn)對(duì)豬尿樣品前處理的影響因素進(jìn)行了分析，得到了豬尿中氟喹諾酮類殘留的檢測(cè)方法。

1 ??材料和方法

1.1 ?材料與儀器

1.1.1 ?材料

豬尿（采自轄區(qū)內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)）;氟喹諾酮類殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（北京勤邦生物技術(shù)有限公司）;氟喹諾酮類藥物、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（RANDOX.公司）;其余試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純（AR）試劑。

1.1.2 ?實(shí)驗(yàn)儀器

Thermo Multiskan MK3 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó);貝克曼Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)，美國(guó);VORTEX-GENIE2 漩渦混合器，美國(guó);dragonlab移液器（10—100μL）;Finnpipette精密8道可調(diào)移液器（30—300μL）;日本三洋MIR-254低溫恒溫箱。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法：將所需試劑回溫至室溫（20—25℃），取出所需數(shù)量的微孔板，將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行。加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本50μL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中。隨即加抗體工作液和酶標(biāo)二抗?jié)饪s液的混合液50μL/孔到所有微孔中（將抗體工作液和酶標(biāo)二抗?jié)饪s液按10：1體積比混合，此混合液不能保存，混勻后立刻進(jìn)行加樣），用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境反應(yīng)30min。洗板：將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4—5次，每次間隔10s，將板孔拍干。顯色：加入底物A液50μL/孔，再加入底物B液50μL/孔，混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。測(cè)定：加入終止液50μL/孔，混勻，于雙波長(zhǎng)450/630nm處測(cè)定每孔OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟喹諾酮類藥物的實(shí)際濃度。

1.2.1 ?豬尿樣品本底顏色對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

取豬尿樣品兩份，一份直接測(cè)定，另一份樣品以相同體積純水代替顯色液底物液B液，其余按照相同步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2、豬尿中蛋白含量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

取5份尿液，其中4份分別加入亞鐵氰化鉀（106g/L）+乙酸鋅溶液（220g/L）、磺基水楊酸（4%）溶液、三氯乙酸（5%）溶液、高氯酸溶液（5%）、無水乙醇沉淀樣品中的蛋白，混勻后靜置10min，離心，取上清液進(jìn)行測(cè)定，另一份樣品加入同體積純水代替蛋白沉淀劑同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。每份尿液做四個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.2.3、豬尿樣品離心對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

取豬尿樣品兩份，一份樣品不進(jìn)行離心，另一份離心，其余按照相同步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4、加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取4份已知FQNS殘留含量的豬尿樣品，分別加入1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，按照相同步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5、豬尿樣品氟喹諾酮類殘留特異性實(shí)驗(yàn)

取8份豬尿樣品，分別加入氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，按照相同步驟進(jìn)行測(cè)定。

2 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1豬尿樣品本底顏色對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

通過在實(shí)驗(yàn)過程中以相同體積純水代替顯色液底物液B液，研究豬尿樣品本底顏色對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響（如表1所示），結(jié)果表明豬尿本底顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響甚微。

2.1.2豬尿中蛋白含量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

通過在豬尿前處理環(huán)節(jié)中添加不同的蛋白沉淀劑，研究豬尿樣品中蛋白對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響（如表2所示），結(jié)果表明加入蛋白沉淀劑均會(huì)不同程度影響樣品含量，其中加入無水乙醇對(duì)結(jié)果影響較大，加入沉淀劑高氯酸溶液、三氯乙酸溶液對(duì)結(jié)果影響較小。

2.1.3豬尿樣品離心對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

通過在豬尿前處理環(huán)節(jié)中對(duì)樣品進(jìn)行離心預(yù)處理，研究豬尿樣品離心對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響（如表3所示），結(jié)果表明，作離心處理樣品結(jié)果比不作離心處理精密度更好。

2.1.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在已知豬尿中FQNS殘留含量的樣品中加入不同濃度FQNS標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算檢測(cè)回收率，結(jié)果如表4所示。

2.1.5 FQNS殘留在豬尿樣品中的特異性實(shí)驗(yàn)

通過在已知FQNS殘留含量（1.6ng/mL）的豬尿樣品中加入一定濃度的氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，研究FQNS殘留在豬尿樣品中的特異性，結(jié)果如表5所示。

3 ?討論

3.1豬尿樣品本底顏色對(duì)測(cè)定的影響

在檢驗(yàn)檢疫日常的監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，采集自不同豬場(chǎng)的不同豬尿樣品其顏色深淺不一，大體是黃色至棕黃色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不添加顯色劑的豬尿樣品盡管其本底顏色較深，經(jīng)測(cè)定扣除樣品本底顏色結(jié)果和不扣除樣品本底顏色結(jié)果基本一致，可見樣品本底顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小，在樣品前處理的過程中無需采取除色處理等步驟，減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和步驟。

3.2蛋白質(zhì)沉淀常用的方法有鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、生物堿試劑與某些酸（如三氯醋酸）沉淀，重金屬鹽沉淀等。豬尿是一種生理體液，含有氨基酸及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，我們通過添加亞鐵氰化鉀+乙酸鋅溶液、磺基水楊酸溶液、三氯乙酸溶液、高氯酸溶液、無水乙醇處理豬尿中的蛋白質(zhì)，通過空白對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)，樣品前處理中加入蛋白沉淀劑均會(huì)不同程度影響樣品含量，其中加入無水乙醇對(duì)結(jié)果影響較大，可能與FQNS在無水乙醇的溶解性有關(guān)，而加入高氯酸溶液、三氯乙酸溶液影響較小。

3.3豬尿樣品離心對(duì)測(cè)定的影響

實(shí)驗(yàn)所添加豬尿樣品無肉眼可見懸浮物、沉淀物，結(jié)果表明作離心處理豬尿與不經(jīng)過離心處理尿液結(jié)果相比，結(jié)果基本一致，作離心處理豬尿樣品結(jié)果精密度稍高。一般豬尿樣品久置后經(jīng)微生物分解豬尿釋放含氮或含硫等有機(jī)成分氣體物質(zhì)，如氨氣、硫化氫、硫醇、糞臭素等，在相互作用下產(chǎn)生尿酸鹽等沉積，形成懸浮物和沉淀，這將會(huì)影響我們?nèi)拥臏?zhǔn)確，因此我們建議如果發(fā)現(xiàn)尿液有懸浮物及沉淀，在檢測(cè)之前應(yīng)進(jìn)行離心處理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。

3.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

通過在已知豬尿FQNS殘留含量的樣品中加入FQNS標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)在加標(biāo)量1—4ng/mL時(shí)，回收率隨添加濃度增加而升高，其回收率在73%—125%之間，平均回收率達(dá)到104%，操作中宜使樣品濃度范圍在2—3ng/mL之間，結(jié)果較為準(zhǔn)確。

3.5通過在已知FQNS殘留含量的豬尿樣品中加入一定濃度的氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，研究FQNS殘留在豬尿樣品中的特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、克倫特羅、萊克多巴胺等標(biāo)準(zhǔn)品基本不反應(yīng)，特異性滿足實(shí)驗(yàn)要求。而沙丁胺醇存在一定交叉反應(yīng)，這也體現(xiàn)了試劑盒的局限性，故FQNS殘留確證還需配合HPLC等方法。

4 ?小結(jié)

開展供港活豬等農(nóng)產(chǎn)品的獸藥殘留安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控工作，不僅是產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)管理的重要基礎(chǔ)和質(zhì)量把關(guān)的主要手段，更是一項(xiàng)重大的政治任務(wù)，是關(guān)系到國(guó)家穩(wěn)定，人民健康以及經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的大問題。因此，掌握研究供港活豬獸藥殘留的現(xiàn)狀，不僅對(duì)發(fā)展壯大轄區(qū)供港澳活豬養(yǎng)殖企業(yè)意義重大，而且能為檢驗(yàn)檢疫部門的進(jìn)出口檢疫與常規(guī)監(jiān)管提供可靠參考。

動(dòng)物服用藥物以后其原形藥物和代謝物主要以尿液的形式排泄?？赏ㄟ^檢測(cè)豬尿中氟喹諾酮類藥物殘留掌握該類藥物在豬個(gè)體和養(yǎng)殖場(chǎng)的使用情況^[6]。我們通過研究豬尿樣品本底顏色，蛋白含量以及樣品離心對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，獲得豬尿樣品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)的前處理方法為：豬尿本底顏色對(duì)結(jié)果影響較小，如果發(fā)現(xiàn)尿液有懸浮物及沉淀，建議在檢測(cè)之前應(yīng)進(jìn)行離心處理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。并通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及豬尿樣品特異性試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了確定。

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作者簡(jiǎn)介：陳浩（1988.4-），男，漢族，廣西南寧人，本科，助理工程師，主要從事微生物及理化檢測(cè)。

洪體玉（1983），男，漢族，廣西南寧人，研究生，工程師，主要從事微生物及理化檢測(cè)。