液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定魚肉中四聚乙醛殘留量

呂燕等

摘 要：建立測定魚肉中四聚乙醛殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取，提取液經(jīng)鹽析后采用N-丙基乙二胺和C18填料凈化，凈化液經(jīng)0.1%甲酸溶液稀釋后進樣分析。分析時采用Acquity BEH C18，以0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相作梯度洗脫，電噴霧正電子（ESI+）模式電離，多反應監(jiān)測（MRM）模式檢測，內(nèi)標法校準進行定量。四聚乙醛在0.05～5.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，線性相關系數(shù)大于0.999，魚肉樣品中最低定量限為1.0 μg/kg。魚肉樣品中添加1.0～2.0 μg/kg的回收率在98.5%～100.8%之間，相對標準偏差均小于10%。

關鍵詞：四聚乙醛；殘留；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；魚肉

Determination of Residual Metaldehyde in Fish Meat by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

Lü Yan1， LIU Yongjun2， JIANG Xiaoxiao1， CHEN Guo1， WU Yinliang1，*

（1. Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；

2. The Center for Animal Disease Control and Prevention， Beijing 100125， China）

Abstract： A method was developed for determining residual metaldehyde in fish meat by liquid chromatography with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Fish meat samples were extracted with acetonitrile and sequentially purified by salting-out method followed by solid phase extraction with PSA and C18 sorbent. After dilution with 0.1% formic acid solution， the samples were analyzed by LC-MS/MS on a Waters Acquity BEH C18 column with acetonitrile/0.1 % formic acid in water as mobile phase with gradient elution. The mass spectrometer was operated using multiple reaction monitoring （MRM） in the positive ion mode. The analyte was quantified by the internal standard calibration curve method. Good linearity was obtained for metaldehyde in the concentration range of 0.05–5.0 μg/L with linear relative coefficient more than 0.999. The recoveries in fish meat were 98.5%–100.8% at fortified levels of 1.0–2.0 μg/kg with a limit of quantitation of 1.0 μg/kg for metaldehyde. The relative standard deviations of intra-assay and inter-assay were below 10%. The method was demonstrated to be suitable for the determination of metaldehyde in fish meat.

Key words： metaldehyde； residue； liquid chromatography with tandem mass spectrometry； fish meat

中圖分類號：TS251.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）04-0035-04

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504008

四聚乙醛是乙醛聚合而成的四聚物，是一種選擇性很強的軟體動物殺滅劑，廣泛應用于防治作物上的田螺、蝸牛和蛞蝓[1-2]。雖然四聚乙醛毒性較低，但由于四聚乙醛導致人畜中毒的事例也時有發(fā)生[3-4]，作為一種環(huán)境污染物，四聚乙醛殘留在水產(chǎn)品中對人類健康威脅同樣存在，但目前為此我國尚未制定四聚乙醛在水產(chǎn)品中的殘留限量，歐盟僅規(guī)定了兩棲動物（如鱷魚肉）的殘留限量為0.05 mg/kg，但從完善標準體系和保障公眾身體健康角度出發(fā)，建立水產(chǎn)品中簡單準確的四聚乙醛殘留量分析方法標準已是迫在眉睫。

目前對于四聚乙醛殘留量分析方法主要有：高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法[5]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）

法[6]、氣相色譜質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[3，7]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，

LC-MS/MS）法[8-10]。其中GC法和HPLC法分析時，前處理步驟包括復雜的衍生化反應步驟，致使方法較復雜。雖然GC-MS法可以不用衍生直接進樣，但從已有的GC-MS法可知，四聚乙醛低濃度時易受干擾[7]。目前

LC-MS/MS在藥物殘留分析中已得到廣泛應用[11-20]，雖然在四聚乙醛殘留分析中有所應用，但在動物性食品包括水產(chǎn)品中四聚乙醛殘留分析的LC-MS/MS方法尚未見有相關報道。本研究開展了魚肉中四聚乙醛提取方法、凈化方法和儀器方法的研究，所建立的LC-MS/MS方法具有靈敏度高、重復性好的特點，能夠滿足現(xiàn)行藥物殘留分析的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉購于寧波市江東區(qū)歐尚超市。

四聚乙醛（95%）、四聚乙醛-D16（95%）

德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純） 美國默克

公司；甲酸（色譜純） 美國天地有限公司；N-丙基乙二胺（PSA） 美國Agilent公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；3K15離心機 美國Sigma公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

1.3.1.1 標準儲備液

準確分別稱取含10.0 mg四聚乙醛和四聚乙醛-D16的標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得四聚乙醛和四聚乙醛-D16標準儲備液，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL。

1.3.1.2 標準工作中間液

分別精密量取0.5mL 100 μg/mL的四聚乙醛和四聚乙醛-D16標準儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的標準工作液。

1.3.1.3 標準工作液

精密量取四聚乙醛和四聚乙醛-D16標準工作中間液適量，逐級用50%乙腈溶液溶解并稀釋成均含四聚乙醛-D16質(zhì)量濃度為1.25 ng/mL的0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0 ng/mL系列四聚乙醛標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5.0 g魚肉樣品于帶蓋的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入經(jīng)乙腈稀釋的四聚乙醛-D16標準工作液（0.25 μg/mL）100 μL，再依次加入2 mL水和10 mL乙腈，以10 000 r/min速度勻質(zhì)1 min后加入2 g氯化鈉，加蓋渦漩混合1 min后以5000 r/min的速度離心2 min，然后將2 mL上清液轉(zhuǎn)入裝有0.3 g無水硫酸鎂、0.1 g C18、0.1 g PSA的5 mL離心管中，漩渦混勻1 min，5 000 r/min離心2 min，吸取0.5 mL上清液與0.5 mL 0.1%甲酸溶液混勻后過0.22 ?m濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×

2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脫）；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10%～30%乙腈；0.5～1.5 min，30%～95%乙腈，保持2.0 min；3.5～3.6 min，95%～10%乙腈；再保持1.4 min。流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件優(yōu)化時采用1 000 μg/L的四聚乙醛和四聚乙醛-D16標準工作溶液，利用IntelliStart軟件進行優(yōu)化。

電離模式：ESI源正離子模式；多級反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓2.0 kV；萃取錐孔電壓30 V；RF透鏡電壓0.5 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣流速50 L/h；脫溶劑氣流速1000 L/h；倍增器電壓650 V；二級碰撞氣：氬氣；各物質(zhì)的定性定量離子對等參數(shù)詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇

2010年前對于四聚乙醛殘留LC-MS/MS分析方法僅見英國環(huán)保署建立的水樣中四聚乙醛LC-MS/MS分析方法，該方法采用[M+Na]+作為母離子，僅有一對離子對（m/z

199.1/67.0）用于監(jiān)測。然而經(jīng)實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，四聚乙醛電離時準分子離子峰至少有[M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+ 3 種形式，其中[M+NH4]+不僅響應好，且從子離子中可選擇出2 個離子對進行LC-MS/MS分析，因此本研究采用[M+NH4]+作為母離子，經(jīng)優(yōu)化后m/z 194.2/62.2，m/z 194.2/106.2兩離子對用于魚肉中四聚乙醛殘留量分析。

四聚乙醛極性較弱，當采用乙腈為有機相時，同樣色譜條件下出峰時間明顯快于甲醇為有機相時；當分別采用20 mmol/L乙酸銨溶液/乙腈、0.1%甲酸溶液/乙腈、0.1%甲酸溶液/甲醇進行梯度洗脫分析四聚乙醛時，20 mmol/L乙酸銨溶液/乙腈作為流動相分析時四聚乙醛的靈敏度相對較差，而后兩種溶液作為流動相分析時四聚乙醛的靈敏度相對較好，且差異不明顯。因此，本研究中采用0.1%甲酸溶液/乙腈作為流動相對四聚乙醛進行分析。

2.2 前處理條件的選擇

根據(jù)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》的方法，采用乙腈作為提取劑對四聚乙醛提取效果進行了研究，結(jié)果顯示不同用量（均大于10 mL）的乙腈回收率均在90%以上，本實驗采用最小的乙腈量進行提取，即10 mL。

對于四聚乙醛的凈化，液體樣品常采用固相微萃取進行凈化，固體樣品常采用提取后固相萃取凈化。由于四聚乙醛發(fā)表的殘留分析方法較少，僅見中性氧化鋁小柱作為固相萃取凈化柱使用。由于中性氧化鋁小柱凈化時所需時間相對較長，本研究決定嘗試采用QuEChERS方法進行凈化。為考察QuEChERS方法凈化的效果，本方法標準實驗過程中考察了2 mL上清液在使用0.3 g MgSO4和不同用量PSA和C18填料（PSA和C18同時使用，且每種處理兩者使用量一致）對于鯽魚肉樣品基質(zhì)效應的改善情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PSA和C18填料使用量的增加，四聚乙醛的基質(zhì)效應明顯改善，基質(zhì)標準曲線與標準工作液的斜率比值分別為0.412（0 mg）、0.658（25 mg）、0.744（50 mg）、0.824（100 mg）、0.902（150 mg）和0.924（200 mg）?？紤]到使用成本與基質(zhì)效應的改善程度（比值0.8～1.2為可接愛范圍），本研究最終選擇100 mg的PSA和C18填料進行實驗。

2.3 方法參數(shù)

2.3.1 標準曲線與線性范圍

根據(jù)1.3.1.3節(jié)配制的標準工作溶液，對四聚乙醛在0.05～5.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以四聚乙醛質(zhì)量濃度為橫坐標（x），待測物定量離子峰面積與內(nèi)標離子峰面積的比值為縱坐標（y），所得標準曲線方程為y=0.729 5x―0.025，相關系數(shù)（R2）為0.9995。標準溶液圖譜見圖1。

1. m/z 210.3/66.1（四聚乙醛-D16）；2. m/z 194.2/106.2（四聚乙醛）；3. m/z 194.2/62.2（四聚乙醛）。

圖 1 四聚乙醛標準溶液（0.05 μg/L）（a）、鯽魚肉空白樣品（b）和添加樣品（1.0 μg/kg）（c）色譜圖

Fig.1 Chromatograms of metaldehyde in standard solution （a， 0.05 μg/L）， fish blank sample （b） and fortified fish sample （c， 1.0 μg/kg）

2.3.2 靈敏度

根據(jù)測定標準曲線所得的結(jié)果，配制相近質(zhì)量濃度的陽性添加樣品，測定其實際信噪比。以RSN=3為檢測限，以RSN=10為定量限。結(jié)果表明，雞肉樣品中金剛烷胺的檢出限為0.30 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

2.3.3 準確度和精密度

取空白鯽魚肉樣品，加入標準工作溶液配制成1.0、1.5、2.0 μg/kg的加標樣品，按照1.3.2節(jié)進行操作，每個添加水平重復3 次，對5 個加標樣品進行定量分析。由

表2可知批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%，平均回收率均為98.5%～100.8%。

2.4 方法應用

利用該方法在2014年底對寧波市江東區(qū)大型超市所售的10 個鯽魚樣品進行了四聚乙醛殘留量測定，所有樣品均未檢出四聚乙醛。

3 結(jié) 論

本研究建立了魚肉中四聚乙醛測定的LC-MS/MS方法。魚肉樣品經(jīng)乙腈提取，提取液經(jīng)鹽析后采用N-丙基乙二胺（PSA）和C18填料凈化，凈化液經(jīng)0.1%甲酸溶液稀釋后直接進行LC-MS/MS分析。該方法具有快速、靈敏、準確的特點，可適用于我國對水產(chǎn)品中四聚乙醛中殘留分析監(jiān)控要求。

參考文獻：

[1] 朱丹， 周曉農(nóng)， 張世清， 等. 密達利殺滅湖北釘螺效果的研究[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志， 2006， 24（3）： 200-203.

[2] 李儒海， 褚世海， 朱文達. 殺軟體動物藥劑防治田間蝸牛的效果[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學， 2006， 45（1）： 76-77.

[3] VALENTINE B A， RUMBEIHA W K， HENSLEY T S， et al. Arsenic and metaldehyde toxicosis in a beef herd[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation， 2007， 19（2）： 212-215.

[4] JONES A， CHARLTON A. Determination of metaldehyde in suspected cases of animal poisoning using gas chromatography-ion trap mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999， 47（11）： 4675-4677.

[5] BROWN P， CHARLTON A， CUTHBERT M， et al. Identification of pesticide poisoning in wildlife[J]. Journal of Chromatography A， 1996， 754（1/2）： 463-478.

[6] 張雪燕， 代雪芳. 四聚乙醛在煙草和土壤中的殘留檢測與消解動態(tài)[J]. 農(nóng)藥學學報， 2006， 8（4）： 344-348.

[7] SAITO T， MORITA S， MOTOJYUKU M， et al. Determination of metaldehyde in human serum by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B， 2008， 875（2）： 573-576.

[8] ZHANG H Y， WANG C， XU P J， et al. Analysis of molluscicide metaldehyde in vegetables by dispersive solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Additives and Contaminants， 2011， 28（8）： 1034-1040.

[9] 李存， 趙莉， 吳銀良， 等. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中四聚乙醛殘留量[J]. 分析化學， 39（2）： 239-242.

[10] LI C， WU Y L， YANG T， et al. Determination of metaldehyde in water by SPE and UPLC-MS-MS[J]. Chromatographia， 2010， 72（9/10）： 987-991.

[11] NIELEN M W F， LASAROMS J J P， ESSERS M L， et al. Multiresidue analysis of beta-agonists in bovine and porcine urine， feed and hair using liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry[J]. Analytical Bioanalytical Chemistry， 2008， 391（1）： 199-210.

[12] DU X D， WU Y L， YANG H J， et al. Simultaneous determination of 10 β2-agonists in swine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and multi-walled carbon nanotubes as a reversed dispersive solid phase extraction sorbent[J]. Journal of Chromatography A， 2012， 1260： 25-32.

[13] BLANCA J， MUNOZ P， MORGADO M， et al. Determination of clenbuterol， ractopamine and zilpaterol in liver and urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2005， 529（1/2）： 199-205.

[14] DONG F， CHEN X， LIU X， et al. Simultaneous determination of five pyrazole fungicides in cereals， vegetables and fruits using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A， 2012， 1262： 98-106.

[15] CHAN D， TARBIN J， SHAMAN M， et al. Screening method for the analysis of antiviral drugs in poultry tissues using zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography/tandem mass spectrometry [J]. Analytica Chimica Acta， 2011， 700（1/2）： 194-200.

[16] 史娜， 侯彩云， 路勇， 等. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中的黃曲霉毒素[J]. 食品科學， 2010， 31（24）： 385-388.

[17] 許婷婷， 戴軍， 陳尚衛(wèi)， 等. LC-MS/MS法同時測定牛肉中15種同化激素類獸藥殘留[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2009， 35（8）： 110-116.

[18] 王剛， 孫媛媛， 唐曉姝， 等. 基于DSPE-LC-MS /MS 法的畜禽產(chǎn)品中雌激素的測定[J]. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（23）： 282-285.

[19] 楊立新， 路楊， 王麗英， 等. 辣椒面中25 種染色劑的液相色譜篩查及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜確證方法體系研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2014， 24（24）： 3505-3511.

[20] SHEN J Z， GUO L M， XU F， et al. Simultaneous determination of fluoroquinolones， tetracyclines and sulfonamides in chicken muscle by UPLC-MS-MS[J]. Chromatographia， 2010， 71（5/6）： 383-388.