云南牛干巴加工過程產(chǎn)生物胺的微生物消長規(guī)律

孫燦等

摘 要：目的：分析云南牛干巴加工過程中產(chǎn)生物胺的微生物的消長規(guī)律。方法：采用傳統(tǒng)工藝加工牛干巴，并于腌制前、腌制中期、腌制后期、成熟1 個月、成熟2 個月及成熟3 個月取樣，用選擇性培養(yǎng)基對菌落總數(shù)和產(chǎn)生物胺微生物：乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科細(xì)菌進行菌落計數(shù)。結(jié)果：菌落總數(shù)在加工過程中先增加后減少，在成熟1 個月時達到最大值；乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科細(xì)菌的數(shù)量在加工過程中先增加后減少；其中假單胞菌屬和腸桿菌科細(xì)菌的數(shù)量在腌制后期達到最大值，乳酸菌的數(shù)量在成熟1 個月達到最大值。結(jié)論：從數(shù)量上來說，乳酸菌是牛干巴加工中的優(yōu)勢菌。

關(guān)鍵詞：云南牛干巴；傳統(tǒng)工藝；產(chǎn)生物胺微生物；消長規(guī)律

Changes in Biogenic Amine-Producing Microorganisms during the Manufacture of Yunnan Dry Cured Beef

SUN Can1， XIAO Rong1， YIN Feng1， GONG Na1， DAI Jiahe2， LIAO Guozhou1，*

（1. College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；

2. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China ）

Abstract： Objective： To understand the patterns of growth and decline of the major biogenic amine-producing microorganisms in the processing of Yunnan dry-cured beef. Method： In the traditional production process， five samples were collected before curing， mid-curing， post-curing， and after one， two and three months of fermentation and ripening， respectively. The numbers of total microorganisms and biogenic amine-producing microorganisms including lactic acid bacteria， Pseudomonas and Enterobacteriaceae were measured by using selective medium. Results： The aerobic plate count first increased to reach the maximum level as observed in the 1-month fermented sample and then decreased， and the same trend was observed for the counts of lactic acid bacteria， Pseudomonas and Enterobacteriaceae. The growth of Pseudomonas and Enterobacteriaceae reached their peaks at the later stage of curing， whereas the maximum count of lactic acid bacteria was observed after 1 month of fermentation. Conclusion： Lactic acid bacteria were the dominant bacteria during the processing of dry-cured beef.

Key words： Yunnan dry-cured beef； traditional process； biogenic amine-producing microorganisms； growth and decline

中圖分類號：TS251.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）04-0006-04

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504002

云南是一個多民族省份，多年來各民族由于地域、文化、宗教和傳統(tǒng)飲食習(xí)俗不同，逐漸形成了具有典型民族特色的牛肉、牛乳及牛副產(chǎn)物加工產(chǎn)品[1]。云南牛干巴是以黃牛后腿肉經(jīng)腌制、晾曬、風(fēng)干發(fā)酵而成的塊狀自然發(fā)酵肉制品。傳統(tǒng)的云南牛干巴加工依賴環(huán)境中的微生物自然生長來進行發(fā)酵，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，腌制發(fā)酵過程形成復(fù)雜的微生物菌群會產(chǎn)生一些對人體有害的有機化合物，主要的化合物為生物胺（biogenic amine，BA）。

國內(nèi)外研究表明，生物胺普遍存在于蛋白質(zhì)含量豐富的發(fā)酵食品中[2]，主要由微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生[3]，一些食品中生物胺的含量還超過美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[4]，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)潛在的食品安全問題，引起廣泛的關(guān)注。

肖蓉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，牛干巴加工過程中成熟中期具有較多的微生物數(shù)量，其中需氧菌（3×105 個/g）、厭氧菌（1.6×105 個/g），對檢出的優(yōu)勢微生物進行分離鑒定，分屬5 個屬，分別是微球菌屬、假單胞菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬與埃希氏菌屬，其中假單胞菌屬、片球菌屬、腸桿菌屬是腌制過程中的自然污染菌。

本研究對產(chǎn)生物胺微生物：乳酸菌、假單胞菌屬以及腸桿菌科細(xì)菌進行了菌落計數(shù)。希望通過研究牛干巴加工過程中各工藝點產(chǎn)生物胺微生物的消長情況，進一步闡明云南牛干巴中生物胺形成和累積機制，解決云南牛干巴中生物胺的潛在安全性問題，旨在為云南牛干巴的品質(zhì)控制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)獸醫(yī)衛(wèi)生檢驗合格的新鮮黃牛后腿肉（剔除筋膜）5 塊，總質(zhì)量為25.3 kg，購于云南省昆明市威遠(yuǎn)街農(nóng)貿(mào)市場。

食鹽 市售；PCA瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基 北京陸橋有限公司；Pseudomonades瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨20 g、無水氯化鎂1.4 g、無水硫酸鉀1.0 g、瓊脂13.6 g、甘油10 mL、蒸餾水1 000 mL） 實驗室自制；硝酸鈉（0.4 g/kg）、VC（0.01 g/kg）均為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

BS11OS分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；

SHP-250生化培養(yǎng)箱 金壇市晶玻實驗儀器廠；

SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司；HWS-80智能恒溫恒濕箱 上海百典儀器設(shè)備有限

公司；BPN-80CH CO2培養(yǎng)箱 上海滬粵明科學(xué)儀器有限

公司；101-2A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海典穎精密儀器設(shè)備有限公司；DSX-280B蒸汽滅菌器 上海申安儀器廠；

SW-CF-IFD 單人潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限

公司；SW-CJ-2D 雙人單面凈化工作臺 上海博迅實業(yè)公司。

1.3 方法

1.3.1 加工工藝[6]

黃牛后腿肉→冷涼→稱質(zhì)量→擦腌制劑→入壇壓實，密封腌制→晾曬→堆碼擠壓→風(fēng)干→成品→切片→真空包裝

1.3.2 腌制溫度與時間

鮮牛肉經(jīng)冷涼后應(yīng)及時腌制，按比例稱出腌制料，具體方法是用雙手在案板上將肉塊經(jīng)揉搓滾動1～2 min，使肉塊由硬變軟后，撒上腌料，再進行揉搓，重復(fù)2～3次（肉源處要多撒腌制料，使之充分腌透）搓揉到肉表面濕潤，腌制料基本用完滲入肉塊為止。最后在肉縫、刀口和外面再敷上一些腌制料，裝入壇子。

腌制牛干巴的溫度一般在0～10 ℃之間，控制在8 ℃以下。每年寒露節(jié)令至立春這段時間，最適合腌制。在此溫度條件下，牛肉在壇內(nèi)腌制為15 d最佳[7]。

1.3.3 生物胺微生物的測定

對牛干巴在腌制發(fā)酵的不同時期即腌制前（腌制第0天）、腌制中期（腌制第7天）、腌制后期（腌制第15天）、成熟1 個月、成熟2 個月和成熟3 個月進行取樣，依表1測定方法對菌落總數(shù)、乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科細(xì)菌進行培養(yǎng)計數(shù)。菌落總數(shù)、假單胞菌屬、腸桿菌科細(xì)菌采用稀釋平板法進行計數(shù)，而乳酸菌則采用涂布平板法進行計數(shù)。結(jié)果以lg（CFU/g）表示。根據(jù)每次菌落數(shù)情況相應(yīng)的調(diào)整稀釋度。主要微生物培養(yǎng)分類和條件如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，所得數(shù)據(jù)均為±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南牛干巴加工過程菌落總數(shù)變化

由表2可知，從腌制前到成熟1個月，菌落總數(shù)呈上升趨勢，成熟1 個月時達到最大值，為6.82（lg（CFU/g））。這主要與腌制前期原料肉水分含量較高，酸度適中，細(xì)菌在適宜的環(huán)境下大量生長繁殖有關(guān)。從成熟1個月到成熟3 個月菌落總數(shù)呈下降趨勢，主要由于水分蒸發(fā)、水分活度下降、乳酸菌產(chǎn)酸、pH值降低以及腌制過程的相對厭氧和高濃度氯離子的毒性等抑制了細(xì)菌的生長繁殖[8]。與腌制前的菌落總數(shù)相比，腌制中期和成熟2 個月顯著升高了22.80%、28.60%（P<0.05）。在腌制中期，由于牛肉中含有豐富的適合微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)，水分含量高，適宜菌的生長，因此在牛肉中的各菌都處于增長的形勢[9]；而在成熟2 個月，由于干燥失水后牛干巴中緩沖物質(zhì)（蛋白質(zhì)）的濃度相應(yīng)提高，盡管這時電解質(zhì)的解離會出現(xiàn)一定程度的提高，但最終還是使產(chǎn)品的pH值略微升高，加上乳酸的分解導(dǎo)致pH值回升，水分含量趨于平衡和穩(wěn)定，最終導(dǎo)致細(xì)菌的大量繁殖。腌制后期和成熟1個月顯著升高了44.09%、46.67%（P<0.01），這說明微生物已經(jīng)適應(yīng)了腌制過程的環(huán)境，利用牛肉中的營養(yǎng)物質(zhì)進行自我生長和繁殖，同時一部分微生物進入對數(shù)生長期，表現(xiàn)為菌落總數(shù)的迅速上升；成熟3個月差異不顯著（P>0.05），隨著貯藏期的延長，牛肉中水分減少，油脂大量析出，pH值和水分活度下降，酸價和過氧化值明顯升高，鹽濃度增加，不僅抑制了需要高水分活度、不耐酸細(xì)菌的生長，游離脂肪酸和過氧化物等也阻礙了細(xì)菌的生長，表現(xiàn)為細(xì)菌的增長速度減慢，直到菌落總數(shù)下降[10]。

2.2 云南牛干巴加工過程乳酸菌數(shù)量變化

由表3可知，從腌制前到成熟1 個月，乳酸菌的數(shù)量逐漸增加，成熟1 個月達到最大值，為6.40（lg（CFU/g））。腌制過程相對厭氧，為乳酸菌這類異養(yǎng)厭氧菌創(chuàng)造了適宜的生長環(huán)境，促其大量生長。乳酸菌在此過程中主要進行同型乳酸發(fā)酵，對牛肉中的葡萄糖、糖原等糖類物質(zhì)進行發(fā)酵，最終只產(chǎn)生乳酸；部分進行異型發(fā)酵，產(chǎn)生乙醇、乙酸和CO2。乳酸菌的發(fā)酵不斷降低牛肉的pH值和氧化還原電位，從而抑制腐敗菌和致病菌生長，防止了牛肉的腐敗變質(zhì)，保證產(chǎn)品的食用安全。從成熟

1個月開始，乳酸菌呈下降趨勢。葛長榮等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在肉制品發(fā)酵過程中數(shù)量達到最大值后趨于下降，這與本實驗結(jié)果相一致。這可能是由于腌制料中添加的硝酸鹽被硝酸鹽還原微生物還原為亞硝酸鹽，隨著亞硝酸鹽濃度的不斷升高，明顯抑制對產(chǎn)生風(fēng)味化合物或其前體物質(zhì)有益的微生物的活力。與腌制前的乳酸菌數(shù)量相比，腌制中期、成熟2 個月顯著升高了46.65%、26.20%（P<0.05），腌制后期、成熟1 個月顯著升高了38.43%、39.74%（P<0.01）。乳酸菌普遍存在于原料肉中，初始數(shù)量很低，在腌制的中期和后期，相對厭氧的腌制環(huán)境有利于乳酸菌的生長，一般發(fā)酵2～5 d后其菌落數(shù)量即可達到106～108 CFU/g；腌制結(jié)束后對乳酸菌的生長并未產(chǎn)生影響，風(fēng)干過程雖然是將牛干巴晾曬于外界空氣中，但風(fēng)吹日曬使牛干巴表面變得堅硬、干燥、致密，阻擋了內(nèi)部和外界環(huán)境的接觸，其內(nèi)部環(huán)境仍是相對厭氧的，這對于牛干巴中乳酸菌的生長仍有利。乳酸菌在成熟時可利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸，降低肉制品中的pH值，有利于NO2―分解為NO，而NO可與肌紅蛋白結(jié)合生成亞硝基肌紅蛋白，從而最終使肉品具有特有的腌制顏色。此外在酸性條件下，病原菌和腐敗菌的生長得以抑制，大大提高了肉品的安全性。

2.3 云南牛干巴加工過程假單胞菌屬數(shù)量變化

由表4可知，從腌制前到腌制后期，假單胞菌的數(shù)量呈上升趨勢，腌制后期達到最大值，為4.89 （lg（CFU/g））。假單胞菌屬雖然專性需氧，但是只要1%的氧氣就能繁殖，每個假單胞菌生長需要的氧氣為9.7×10―8 L/（細(xì)胞·d），即使周圍環(huán)境相對厭氧，假單胞菌也能生長，從腌制后期開始，牛干巴進入到干燥成熟階段，許多情況下，干燥是在相對較早的階段完成的，而成熟則一直持續(xù)到消費階段。從腌制后期到成熟2 個月，假單胞菌的數(shù)量明顯減少，原因可能是晾曬使溫度升高，加之空氣流速加快，水分蒸發(fā)加快，水分活度下降，氯化鈉濃度相應(yīng)增加，對假單胞菌的生長產(chǎn)生了抑制作用。與腌制前的假單胞菌數(shù)量相比，腌制中期、腌制后期、成熟1個月及成熟2 個月顯著升高了84.38%、91.02%、85.94%、82.81%（P<0.01），成熟3 個月顯著升高了36.72%

（P<0.05）。由于腌制期正處于寒露節(jié)令至立春這段時間，較低溫度以及初始成熟階段的高氧濃度都為假單胞菌屬這種需氧嗜冷菌提供了生長動力；而與成熟3個月差異不顯著（P>0.05），此時昆明的氣溫已經(jīng)達到20 ℃左右，高溫會抑制假單胞菌的生長和存活。

2.4 云南牛干巴加工過程產(chǎn)生物胺微生物菌相變化

由表5可知，不同時期產(chǎn)生物胺微生物的構(gòu)成不同，但乳酸菌在不同時期菌相構(gòu)成中均占有最高比例，若從數(shù)量上來說是云南牛干巴加工過程中的優(yōu)勢菌群。Lvcke[12]、Hammes[13]等的研究表明，通常在未加控制的肉制品發(fā)酵過程中，乳酸菌是優(yōu)勢的微生物類群，它們具有較高的競爭性和較好的環(huán)境適應(yīng)性。馬德功等[14]研究也表明乳酸菌是自然發(fā)酵香腸中的優(yōu)勢菌群，在香腸的發(fā)酵、保存、風(fēng)味形成中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。肖蓉等[5]分離了云南牛干巴（臘牛肉）及其鹵水中的細(xì)菌，得到17 株乳桿菌屬，占總優(yōu)勢細(xì)菌的29.3%。

2.5 云南牛干巴加工過程腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量變化

由表6可知，從腌制前到腌制后期，腸桿菌科細(xì)菌的數(shù)量增加較為明顯，腌制后期達到最大值，為4.11（lg（CFU/g））。與腌制前的腸桿菌科細(xì)菌數(shù)相比，腌制中期、成熟2 個月顯著升高了46.96%、48.58%

（P<0.05）；腌制后期、成熟1 個月顯著升高了66.40%、57.89%（P<0.01），從成熟開始，腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量逐漸減少。

牛肉中的初始腸桿菌來自于屠宰和分割以及所使用的器具的污染，腌制過程中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、充足的水分以及適宜的pH值非常適合腸桿菌科細(xì)菌的生長繁殖，從而使得腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量不斷增加。隨著牛肉風(fēng)干成熟的開始，乳酸菌大量繁殖，消耗環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生大量的乳酸和少量的醋酸，這些有機酸對腸桿菌具有非常重要的抑制作用，另外，低氧、水分含量下降、滲透壓（氯化鈉）升高、防腐劑（硝酸鹽和亞硝酸鹽）等柵欄因子的作用最終使腸桿菌在風(fēng)干成熟過程一直下降[15]。

腸桿菌科微生物為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，需氧或兼性厭氧，廣泛分布于環(huán)境中，即使腌制環(huán)境中的氧氣濃度較低，腸桿菌科細(xì)菌也能生長和繁殖，而進入有氧的成熟階段，將會更有利于該類細(xì)菌的增殖，尤其在較高的溫度條件下，其優(yōu)勢地位將更加明顯[16]。

腌制前的腸桿菌科細(xì)菌數(shù)與成熟3 個月差異不顯著

（P>0.05），原因可能是以下幾點：硝酸鹽已被還原為亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽會抑制厭氧菌的生長；作為不同時期菌相中優(yōu)勢菌的假單胞菌與腸桿菌科細(xì)菌之間也存在一定的競爭關(guān)系，阻礙了腸桿菌科細(xì)菌的生長；乳酸菌產(chǎn)乳酸使pH值快速下降從而加速了腸桿菌的消亡；乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素，從而抑制腸桿菌的生長[17]。

3 結(jié) 論

在云南牛干巴加工過程中，菌落總數(shù)先增加，后減少，在成熟1個月達到最大值，最大對數(shù)值為6.82；乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科細(xì)菌的數(shù)量表現(xiàn)出先增加后減少。假單胞菌和腸桿菌科的細(xì)菌數(shù)量在腌制后期達到最大值，假單胞菌的最大對數(shù)值為4.89，腸桿菌科的最大對數(shù)值為4.11；乳酸菌的數(shù)量在成熟1 個月達到最大值，最大對數(shù)值為6.40；乳酸菌為牛干巴加工過程中的優(yōu)勢菌群。

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