液相色譜串聯(lián)質譜法同時測定動物血漿中21種霉菌毒素或其代謝物殘留

王瑞國　蘇曉鷗　王培龍　張維　薛巖　李玉

摘要建立了同時檢測動物血漿中黃曲霉毒素B1等21種霉菌毒素或其代謝物殘留的液相色譜串聯(lián)質譜方法。動物血漿樣品中加入0.1%甲酸乙腈溶液、NaCl和無水MgSO4進行萃取，無水MgSO4和C18，PSA，AAL對提取液進行脫水凈化，經濃縮、復溶和離心后，再進行測定。采用反相C18色譜柱分離，以0.1%甲酸0.5 mmol/L 乙酸銨溶液和0.1%甲酸甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI）多反應監(jiān)測離子模式（MRM）進行檢測，基質標準曲線外標法進行定量分析，線性范圍在0.05～100 ng/mL之間，方法的定量限為0.05～0.5 ng/mL。在高、中、低3個添加濃度水平下，21種霉菌毒素的平均回收率為62.0%～116.4%， 相對標準偏差小于19%。

關鍵詞液相色譜串聯(lián)質譜； 動物血漿； 霉菌毒素； 殘留

1引 言

霉菌毒素（Mycotoxins）是霉菌在生長過程中產生的次級有毒代謝產物[1]，目前已經確認化學結構的霉菌毒素達400多種[2]，這些霉菌毒素主要由曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）和麥角菌屬（Claviceps）霉菌產生[3]。谷物、油料籽實以及由此加工的動物飼料特別易于被各種霉菌毒素污染，從而造成人或動物急性或慢性中毒反應[4]。研究顯示，全球大約25%的農產品受到霉菌毒素污染，因此需要對其進行監(jiān)測以控制食物鏈中的霉菌毒素[5]。世界衛(wèi)生組織將霉菌毒素納入食品安全體系重點監(jiān)測內容[6]，中國對食品和飼料中黃曲霉毒素等重要毒素規(guī)定了最高限量標準[7～11]。評價人和動物霉菌毒素暴露水平一般采取分析食品、飼料中霉菌毒素含量的間接方法[12]。由于受到食品和飼料中霉菌毒素污染水平、加工方式、個體攝入和吸收代謝等多種因素影響，這種方法的評估結果可靠性比較差[13]。近年來，一些研究直接測定人和動物血液、尿液等生物樣本中霉菌毒素或其代謝物， 反映霉菌毒素暴露水平及其體內的吸收代謝過程。例如，urner等[14]調查了英國34名成年人尿液中嘔吐毒素及其葡萄糖醛苷酸結合物濃度范圍為5.0～78.2 ng/mL，證實了葡萄糖醛苷酸化是嘔吐毒素在人體內主要代謝途徑。Cunha等[15]對13名葡萄牙志愿者尿液中嘔吐毒素進行了檢測，發(fā)現69%的志愿者尿液中檢出嘔吐毒素或其代謝物。Meky等[16]研究了小鼠恩鐮孢菌素A連續(xù)暴露28天，其在血液、尿液和糞便中殘留水平與暴露時間的動態(tài)變化。然而，這些方法只針對一種或一類結構相似的霉菌毒素進行檢測，但飼料由于原料來源復雜多樣，常被多種霉菌毒素污染[17]。因此，開發(fā)動物血漿中多種霉菌毒素同時檢測方法具有十分重要的現實意義。

目前，已經有少量關于動物和人血液等生物樣本中霉菌毒素檢測方法的報道。這些方法主要有高效液相色譜法[18]、液相色譜串聯(lián)質譜法[19～21]和氣相色譜串聯(lián)質譜法[22]，樣品前處理方法采用了免疫親和柱[18，19]或固相萃取[20～22]等技術，操作比較繁瑣，檢測費用高，一般難以做到多種霉菌毒素的同時測定。QuECERs方法（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged， Safe）是近年發(fā)展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術，利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的。本研究應用液相色譜串聯(lián)質譜技術，基于QuECERs原理開發(fā)了樣品提取和凈化方法，同時檢測動物血漿中21種霉菌毒素及其代謝物，具有操作簡單、快速、成本低、定量準確等特點，可用于動物霉菌毒素聯(lián)合暴露評估及霉菌毒素毒代動力學研究。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Acquity超高效液相色譜儀、XEVO QS串聯(lián)質譜儀（美國Waters公司）； RVC 218臺式離心濃縮儀（德國CRIS公司）； 3K15高速冷凍離心機（美國Sigma公司）； D37520高速離心機（美國Kendro公司）； VXⅢ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

標準品及由標準品配制的混合標準溶液儲備液（溶劑為乙腈）濃度信息見表1。乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，美國Fisher公司）； 實驗用水為MilliQ超純水?；旌蠘藴嗜芤簝湟河?/p>

2.2樣品前處理

準確量取2.0 mL（精確至0.001 mL）豬血漿樣品于50 mL塑料離心管中，向其中加入6 mL 0.1%甲酸乙腈溶液以沉淀蛋白，2000 r/min渦旋1 min，置于4℃冷藏20 min，再加入0.2 g NaCl和0.8 g無水MgSO4，2000 r/min渦旋1 min，8000 r/min離心5 min。靜置片刻，量取上層溶液4 mL置于10 mL具塞塑料離心管中，加入無水MgSO4 600 mg， C18，PSA，AAL各100 mg， 2000 r/min渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm尼龍微孔濾膜，精密量取濾液3 mL置于10 mL塑料離心管中，真空濃縮儀中60℃、1500 r/min抽干，用0.5 mL 0.1%甲酸乙腈（70∶30， V/V）溶解殘渣，13000 r/min離心5 min，取上清液置于進樣小瓶中，供LCMS/MS測定。

2.3色譜和質譜條件

Acquity UPLC BERP18色譜柱（100 mm × 2.1mm，1.7 μm，美國Waters公司）； 柱溫40℃，流速0.3 mL/min， 進樣量3 μL。流動相A為0.1%甲酸0.5 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為0.1%甲酸甲醇。梯度洗脫： 0～2 min，95% A； 2～4 min，95%～80% A； 4～12 min，80%～5% A； 12～12.1 min，5%～1% A； 12.1～13 min，1% A； 13～13.5 min，1%～95% A； 13.5～14 min，95% A。

電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為150℃，脫溶劑溫度為450℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速為1000 L/h，錐孔氣流速為40 L/h。序號1～16霉菌毒素采用正離子監(jiān)測，序號17～21霉菌毒素采用負離子監(jiān)測方式。采用MRM多反應監(jiān)測方式檢測，監(jiān)測離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數見表2。

3結果與討論

3.1質譜條件的優(yōu)化

以甲醇水（50∶50， V/V）為流動相，采用結合（Combine）進樣方式，對21種霉菌毒素的質譜條件進行優(yōu)化，在正、負離子模式下進行全掃描，選擇合適的準分子離子峰和電離方式。根據不同化合物的響應，設置不同的掃描模式。其中，正電離模式下獲得[M+]+或 [M+N4]+，負電離模式下獲得[M-]-。結合基質空白和基質標準液的離子掃描圖，進一步優(yōu)化參數，確定了各種毒素在多反應監(jiān)測模式下信號采集的特征離子對（表2）。對于具有相同保留時間的同分異構體3AcDON和15AcDON，選擇各自特有的離子碎片作為監(jiān)測子離子。

3.2色譜條件優(yōu)化

根據本實驗室前期研究結果[23]，采用0.1%甲酸和0.1%甲酸甲醇作為流動相，梯度洗脫，分段采集目標物峰信號，適用于多種霉菌毒素的同步檢測。由于部分目標物母離子電離方式是+N4的方式，所以在流動相0.1%甲酸中添加0.5 mmol/L乙酸銨，以獲得更好的峰響應信號。本流動相梯度設定對于具有相同離子碎片的同分異構體αZEL、βZEL以及αZAL和βZAL能夠通過保留時間實現良好分離。圖1為空白豬血漿加標的定量離子色譜圖。

3.3提取方法的優(yōu)化

選擇血漿樣品3倍體積的0.1%甲酸乙腈作為提取液，主要考慮到乙腈既能夠沉淀血漿中的蛋白，也是霉菌毒素目標物的良好溶劑，在NaCl和無水MgSO4的鹽析作用下，待測霉菌毒素能夠很好地從血漿中進入乙腈層，甲酸則有助于保持酸性提取和凈化體系。對提取方式考察表明，本實驗的提取條件下，除黃曲霉毒素M1萃取率偏低外，其它待測目標物的萃取率均超過80%。為避免在加入無水MgSO4時溶液發(fā)熱，提前將樣品置于4℃冷藏20 min。

3.4凈化材料的選擇

考察了C18， PSA， AAL和GCB對豬血漿樣品中目標物的凈化回收效果。結果表明，GCB對大部分目標物有強吸附作用，回收率<30%，C18， PSA和AAL對目標物均無明顯吸附作用，回收率在80%～120%之間。C18可以吸附血漿中脂肪和脂類等非極性的組分，降低檢測過程中的雜質干擾； PSA可以有效去除樣品中的有機酸和色素，而且對于大部分目標物質譜峰相應信號具有明顯增強效果； AAL也有一定的脫脂效果，并能夠顯著降低AFB1， 2， DON和ZEA等目標物的基質干擾，提高檢測靈敏度。其次，應用20個不同來源的豬、綿羊、奶牛等血漿樣品，進一步考察了C18、PSA和AAL的適宜添加量。結果顯示，C18、PSA和AAL各100mg即可對4 mL樣品提取液進行有效凈化。 此外，還發(fā)現由于樣品提取液中存在少量水會影響到樣品的濃縮過程，添加600 mg無水MgSO4可以有效去除待凈化提取液中殘存的水。

3.5基質效應評價

用0.1%甲酸乙腈（70∶30， V/V）配制系列梯度濃度（目標物序號1～9為0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0和20.0 ng/mL； 目標物序號10～21為0.25， 0.5， 2.5， 5.0， 25.0和100.0 ng/mL）混合標準溶液，同時量取豬血漿樣品，按照前處理步驟提取、

凈化和分析，確定不含痕量目標物后，再用空白樣品進樣液稀釋與溶劑標樣濃度相同的系列基質匹配標樣，分別以標樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析。

基質匹配與溶劑標樣曲線斜率的比值（圖2）可反映出基質效應的強弱，0.8～1.2可認為是無基質效應，超過這一范圍則表明具有較強的基質抑制或增強效應。由圖2可見，AFB1等12種目標物在0.8～1.2內，而SE等9種目標物則低于0.8。因此，采用基質匹配標準溶液進行定量分析。

3.6方法的線性范圍與定量限

用空白樣品提取液配制混合標準溶液，配制濃度為0.05～20 ng/mL（目標物序號為1～9）和0.25～100 ng/mL（目標物序號為10～21），根據10倍信噪比（S/N）確定化合物的方法定量限（LOQ），以濃度為橫坐標和定量離子對峰面積為縱坐標進行線性回歸計算， 線性相關系數（R2）均大于0.99，結果見表3。

3.7回收率和精密度實驗

采用豬血漿空白樣品，進行添加回收和精密度實驗。樣品中添加低、中、高3個濃度梯度的混合標準溶液，每個添加濃度設6個平行樣本，按本實驗方法進行樣品處理和測定， 結果見表4，平均回收率為62.0%～116.4%，相對標準偏差（RSD）為0.9%～19.0%。

3.8實際樣品分析

應用本方法對分別經靜脈同時注射AFB1、DON和ZEA低、高兩種劑量（低濃度： 5， 15和15 μg/kg BW； 高濃度： 10， 30和30 μg/kg BW）2 h后的綿羊血漿樣品進行測定，低劑量組檢出AFB1、DON、ZEA藥物原型及代謝物AFM1、αZEL和βZEL的濃度分別為1.75， 0.25， ND， 0.28， 0.55和0.51 ng/mL； 高劑量組檢出濃度分別為6.24， 2.72， 1.15， 1.58， 1.31和1.15 ng/mL，血漿中霉菌毒素及其代謝物濃度與給藥劑量呈正相關。結果表明，本方法能夠對動物血漿樣品中多種霉菌毒素同時進行快速、靈敏的檢測，適用于動物霉菌毒素暴露的風險評估和毒代動力學等研究。

AbstractA novel method for simultaneous detection of mycotoxins （e.g.， aflatoxin B1） or their metabolic residues in animal plasma with impurity adsorption purification followed ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） was developed. Extraction of mycotoxins and their metabolites from animal plasma sample was performed with 0.1% formic acidacetonitrile solution after addition of sodium chloride and hydrous magnesium sulfate. he extract was then dehydrated and purified with hydrous magnesium sulfate， C18， primary secondary amine， and aluminaA. 3 mL of the supernatant was evaporated and redissolved with 0.5 mL of 0.1% formic acid aqueous solution/acetonitrile （70∶30， V/V） for UPLCMS/MS detection. he analytes were separated by a C18 column utilizing gradient elution with 0.1% formic acid aqueous solution containing 0.5 mmol of ammonium acetate and 0.1% formic acidmethanol solution， and finally detected by tandem mass spectrometry in positive/negative ESI mode. Identification and quantification were achieved by LCMS/MS with multireaction monitoring （MRM）. Good linearity in response was obtained in the analytes concentration range of 0.05-100 ng/mL with correlation coefficients larger than 0.99. he limits of quantification （S/N=10） were around 0.05-0.5 ng/mL. he recoveries of mycotoxins and their metabolites spiked in blank plasma samples were in the range of 62.0%-116.4%， with relative standard deviations （RSDs） less than 19.0%.

KeywordsLiquid chromatographytandem mass spectrometry； Plasma； Mycotoxins； Residue