白藜蘆醇聯(lián)合SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡遷移的影響及機(jī)制

李雪玲，張凱敏,李孌英,李明君

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居?jì)D科惡性腫瘤第二位，而病死率位居首位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年宮頸癌新增病例約30萬，死于宮頸癌的約5萬，而且宮頸癌的發(fā)病率逐年上升并有年輕化的趨勢(shì)[1-2]。宮頸癌的治療主要采用手術(shù)和放療，但針對(duì)早期病人有很好的效果，對(duì)于晚期病人，只能采取放療，而放療藥物有毒性作用，對(duì)病人身體會(huì)造成嚴(yán)重危害[3]。因此，尋找低毒高效的抗宮頸癌藥物受到廣大研究者的關(guān)注。中藥因作用廣譜，且能有效抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用成為研究熱點(diǎn)[4]。白藜蘆醇屬于非黃酮類多酚化合物，存在于葡萄、藜蘆等植物中[5]。研究顯示，白藜蘆醇對(duì)腫瘤的起始、促進(jìn)、進(jìn)展三個(gè)過程均有明顯的抑制作用，并通過多種途徑對(duì)乳腺癌、肝癌等腫瘤有抑制效應(yīng)[6-8]。p38絲裂原活性蛋白激酶(p38MAPKs)在多種腫瘤的生長(zhǎng)和增殖中處于活性狀態(tài)，其特異性抑制劑SB203580對(duì)子宮內(nèi)膜癌、食管癌等腫瘤有促凋亡和殺傷特性[9-10]。因此，本研究于2015年3月—2016年3月對(duì)白藜蘆醇聯(lián)合SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡遷移的影響及機(jī)制進(jìn)行探索，以期為后續(xù)更多研究治療宮頸癌的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細(xì)胞 人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試劑 胎牛血清(FBS)(批號(hào)：1618862)、RPMI1640培養(yǎng)基(批號(hào)：20131112)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司(批號(hào)：B148216)；二喹啉甲酸(BCA)(批號(hào)：P0010S-1)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)(批號(hào)：1213BS159)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Promeg(批號(hào)：101024)；B型白細(xì)胞/2型淋巴細(xì)胞樣蛋白(Bcl-2,批號(hào)：2772S)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,批號(hào)：2762S)、單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；p38(批號(hào)：37619)、p-p38(批號(hào)：21771)抗體均購(gòu)自Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(批號(hào)：109525)購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱HERAcell型購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；倒置熒光顯微鏡CK2-TRC-3型購(gòu)自日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀LSR II購(gòu)自美國(guó)BD公司；垂直電泳槽DYCZ-24EN購(gòu)自北京六一儀器；128C型酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利CliniBio公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出裝有人宮頸癌HeLa細(xì)胞的凍存管，37 ℃水浴解凍。向凍存管中加入含有10%FBS、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5min，倒除上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察到細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上時(shí)，0.25%的胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮趨于變圓時(shí)停止消化，1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，離心，倒掉培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代。

1.2.2 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×103/mL，將100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入40、60、80、100 μmol/L的白藜蘆醇作用48 h，對(duì)照組不加白藜蘆醇。每孔加入含10%CCK8溶劑的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定并記錄各組的吸光度OD，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 白藜蘆醇與SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 將細(xì)胞分為四組，即對(duì)照組(A組)：不做處理；SB203580組(B組)，加10 μmol/L SB203580；白藜蘆醇組(C組)，加60 μmol/L白藜蘆醇；白藜蘆醇組+SB203580組(D組)，加60 μmol/L白藜蘆醇和10 μmol/L SB203580。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞以每毫升5×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察到細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，加入分組的四組細(xì)胞，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集懸浮及貼壁細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，膜聯(lián)蛋白V-FITC(AnnexinV-FITC)結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞，避光室溫孵育10 min，離心，棄上清，碘化丙啶(PI)冰盒中避光孵育10 min。加400 μL緩沖液。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 白藜蘆醇與SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升105個(gè)，Transwell小室上層加入100 μL細(xì)胞懸液，下層加入500 μL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄去上下室的培養(yǎng)基，上層分別加入四組細(xì)胞，下層加入含10%FBS的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，37℃，5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)基棄去，用棉簽輕輕拭掉膜上的細(xì)胞，HE染色后隨機(jī)選擇5個(gè)視野，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。每組重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)p38、p-p38、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 四組細(xì)胞作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h后，PBS洗滌細(xì)胞，適量的裂解液冰上裂解30 min，收集細(xì)胞，4℃ 14 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，SDS-PAGE電泳分離，4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜。取出PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后，分別以p38、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax作為一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并計(jì)算蛋白表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響為了確定白藜蘆醇作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞合適的濃度，選擇40、60、80、100 μmol/L的白藜蘆醇作用于細(xì)胞48 h，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，40、60、80、100 μmol/L白藜蘆醇的細(xì)胞抑制率分別為(24.1±2.3)%、(52.2±3.4)%、(73.1±3.1)%、(91.4±2.7)%，均顯著高于對(duì)照組(2.2±1.5)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表現(xiàn)出濃度依賴性。60 μmol/L的白藜蘆醇抑制了一半的細(xì)胞增殖，后續(xù)選擇60 μmol/L的白藜蘆醇作為研究對(duì)象。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 各組的 q′(Dunnett法) 雙側(cè)檢驗(yàn)結(jié)果

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05

圖1 白藜蘆醇聯(lián)合SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

2.2白藜蘆醇聯(lián)合SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響四組細(xì)胞作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h后，B組細(xì)胞凋亡率顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.083，P=0.000)，C組和D組的凋亡率顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=28.411，P1=0.000；t2=17.700，P2=0.000)，D組顯著高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.617，P=0.000)，且低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.710，P=0.000)，如圖1和表2。

表2 白藜蘆醇聯(lián)合SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

注：與A組相比，aP<0.05;與D組相比，bP<0.05

2.3白藜蘆醇聯(lián)合SB203580對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響四組細(xì)胞作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48h后，Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，B組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCleaved-caspase3=13.276，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=3.345，PBax=0.010)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tBcl-2=13.203，PBcl-2=0.000)；C組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCleaved-caspase3=29.791，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=25.948，PBax=0.000)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tBcl-2=26.217，PBcl-2=0.000)；D組細(xì)胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCleaved-caspase3=19.861，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=12.658，PBax=0.000)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于A組(tBcl-2=18.143，PBcl-2=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCleaved-caspase3=16.514，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=22.603，PBax=0.000)，低于C組tCleaved-caspase3=9.930，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=13.291，PBax=0.000，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tBcl-2=13.013，PBcl-2=0.000)，高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tBcl-2=8.074，PBcl-2=0.000)，如圖2和表3。

圖2 白藜蘆醇聯(lián)合SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別Cleaved-caspase3BaxBcl-2A組0.093±0.0090.154±0.0120.347±0.015B組0.162±0.011ab0.191±0.013ab0.208±0.014abC組0.315±0.013ab0.441±0.015ab0.071±0.010abD組0.223±0.012a0.294±0.014a0.156±0.012aF 值206.872269.831241.618P值0.0000.0000.000

注：與A組相比，aP<0.05；與D組相比，bP<0.05

2.4白藜蘆醇與SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移的影響四組細(xì)胞作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h后，B組細(xì)胞遷移數(shù)顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.495，P=0.000)，C組和D組細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=24.338，P1=0.000；t2=16.166，P2=0.000)，D組細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.843，P=0.000)，高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.171，P=0.000)，見表4。

表4 白藜蘆醇與SB203580對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移的影響

注：與A組相比，aP<0.05；與D組相比，bP<0.05

2.5白藜蘆醇與SB203580對(duì)p38和p-p38蛋白表達(dá)的影響四組細(xì)胞作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)p38和p-p38蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，B組p-p38蛋白表達(dá)顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.636，P=0.001)，C組和D組細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=11.272，P1=0.000；t2=4.249，P2=0.003)，D組p-p38蛋白表達(dá)顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.909，P=0.000)，低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.024，P=0.000)，p38在四組的蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3和表5。

圖3 白藜蘆醇與SB203580對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞p38和p-p38蛋白表達(dá)的影響

3 討論

研究顯示，白藜蘆醇能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并通過殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到抗腫瘤的目的，因此被認(rèn)為是有效的潛在抗腫瘤藥物。

表5 白藜蘆醇與SB203580對(duì)p38和p-p38蛋白表達(dá)的影響

注：與A組相比，aP<0.05；與D組相比，bP<0.05

一些體外實(shí)驗(yàn)顯示白藜蘆醇能通過影響細(xì)胞生長(zhǎng)和炎癥、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗血管轉(zhuǎn)移等途徑抑癌和抗癌[11-12]。MAPKs信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、蛋白合成等途徑有調(diào)控作用，p38是MAPK信號(hào)通路中重要的一員，p38MAPK信號(hào)通路能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等維持機(jī)體各個(gè)組織的相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)p38MAPK信號(hào)通路受到抑制時(shí)，能引起細(xì)胞增殖[13-14]。本研究中用不同濃度的白藜蘆醇作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制，且隨著白藜蘆醇濃度增加細(xì)胞抑制率增加。60 μmol/L的白藜蘆醇抑制了一半的細(xì)胞增殖，被選擇作為后續(xù)研究對(duì)象。p38MAPK抑制劑SB203580與白藜蘆醇聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)，B組細(xì)胞凋亡率顯著低于A組，C組和D組細(xì)胞凋亡率顯著高于A組，D組細(xì)胞凋亡率顯著高于B組，低于C組。這說明白藜蘆醇通過p38MAPK抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

凋亡有內(nèi)源性和外源性兩種途徑，雖然兩種途徑的機(jī)制不一樣，但都需要激活凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3，從而啟動(dòng)細(xì)胞的程序性死亡[15]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中，Bax移位到線粒體膜上，導(dǎo)致膜電位發(fā)生變化，Bax空間構(gòu)象變大從而發(fā)生活化。Bax發(fā)生活化后可誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2和Bax可結(jié)合形成二聚體，抑制或促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[16-18]。研究顯示，Bcl-2表達(dá)抑制和Bax表達(dá)升高，能使線粒體膜發(fā)生滲透性轉(zhuǎn)化，釋放細(xì)胞色素C，激活Cleaved-caspase3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，B組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著低于A組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于A組；C組和D組細(xì)胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著高于A組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于A組；D組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著高于B組，低于C組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于B組，高于C組。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征之一，是對(duì)惡性腫瘤不斷增殖，并沿著趨化劑濃度梯度向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程。其異常生長(zhǎng)除了腫瘤本身的生長(zhǎng)外，還能向腫瘤臨近組織侵襲并轉(zhuǎn)移到其他部位，這往往是腫瘤引起死亡的原因[19-20]。研究顯示，白藜蘆醇能通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的遷移[21]。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇能抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移，p38MAPK抑制劑能減弱白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞遷移的影響。這說明白藜蘆醇通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞遷移。

綜上所述，白藜蘆醇可通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移，并通過調(diào)節(jié)caspase3、Bax、Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡。