基于響應(yīng)面法的藥膳參苓谷物沖調(diào)粉提取工藝研究

，*，，，,

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208；3.抗腫瘤中藥創(chuàng)制技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410007)

參苓谷物沖調(diào)粉提取物的配方為古方參苓白術(shù)散通過加減化裁而來，由人參、茯苓、白扁豆、陳皮、蓮子、山藥、薏苡仁、黃精、枸杞組成，具有扶助正氣、健脾益腎之功效。該方出自《太平惠民和劑局方》，臨床常用于脾胃虛弱、飲食不進(jìn)、多困少力、嘔吐泄瀉的治療，久服可養(yǎng)氣育神、醒脾悅色、順正辟邪，是為培土生金治法的常用方劑[1]。此方應(yīng)用廣泛、療效確切，可改善晚期惡性腫瘤患者的部分臨床癥狀，提高免疫功能，改善生活質(zhì)量[2-3]?，F(xiàn)代研究證實參苓白術(shù)散能提高IL-2、干擾素γ、腫瘤壞死因子水平，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)提高人體抵御癌細(xì)胞的能力[4]。藥理研究表明人參對實體腫瘤有一定療效，其含有豐富的三萜皂苷類及多糖類等生物活性成分，二者皆具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、抗輻射等作用[5-7]。研究表明，植物多糖具有抗腫瘤活性，且毒副作用小，是潛在的新型抗腫瘤藥物資源[8]。本實驗考察參苓谷物沖調(diào)粉醇提工藝的醇濃度、加醇量、浸泡時間指標(biāo)，水提工藝的加水量、提取時間、浸泡時間指標(biāo)，然后采用響應(yīng)面試驗設(shè)計法優(yōu)化醇提、水提工藝參數(shù)，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技有限公司)；UV9100B紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；YP-B5001型電子天平(上海光正醫(yī)源儀器有限公司)；RHP-400型高速多功能粉碎機(浙江永康市榮浩工業(yè)有限公司)；SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；YJD20老藥師常溫煎藥機(長沙市卓成醫(yī)療器械有限公司)；RE-200013旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 藥材及試劑

人參皂苷Rg1對照品(批號：110703-200726)購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；人參皂苷Rb1對照品(批號：110704-200921)購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；人參皂苷Re對照品(批號：110702-200925)購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；無水葡萄糖對照品(批號：110833-201506)購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他HPLC用試劑皆為色譜純；苯酚、濃硫酸、乙醚、無水乙醇等比色用試劑皆為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苯酚-硫酸比色法測定參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提液中多糖的含量

2.1.1 對照品溶液制備 取無水葡萄糖對照品約0.025 g，精密稱定，置于250 mL容量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，制得含0.1004mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 精密移取各工藝條件下制得的醇提樣品液(約相當(dāng)于生藥量0.5 g)，加乙醚100 mL加熱回流1 h，靜置，放冷，小心棄去乙醚液，殘渣置水浴上揮盡乙醚。加入80 %乙醇100 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用熱80 %乙醇30 mL分次洗滌，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流2 h。趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至250 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得供試品1；吸取2 mL供試品1置于10 mL試管中，加水至刻度線，得供試品2。精密吸取1 mL供試品2，加入1 mL蒸餾水，1 mL 5 %的苯酚，5 mL濃硫酸，搖勻，室溫置10 min，40 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，在最大吸收波長處測定吸光度A。

2.1.3 最大吸收波長選擇 精密吸取葡萄糖對照品溶液和參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提樣品溶液1 mL，按照“2.1.2”項下方法在400～600 nm范圍內(nèi)分別進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果對照液和供試液最大吸收波長皆為490 nm，故選擇490 nm為測定波長。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取無水葡萄糖對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，分別加蒸餾水補至2.0 mL，各再精密加入5%苯酚溶液1mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置10 min，置于40 ℃水浴加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，在490nm的最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度對無水葡萄糖溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=0.0171 76+0.0435 39X，R=0.992 9。

2.2 HPLC法測定參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量

2.2.1 色譜條件[9-10]Ultimate 3000色譜柱，固定相為C18烷基鍵合硅膠，流動相為水-乙腈，運行時間30 min，檢測波長203 nm，柱溫30℃。按人參皂苷Rg1、Re、Rb1分別計算理論塔板數(shù)均>4000，分離度>1.5。

2.2.2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品溶液配制 稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品各約10 mg，分別精密稱定0.010 3 g、0.010 4 g、0.010 1 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，分別制得1.03 mg/mL、1.04 mg/mL、1.01 mg/mL人參皂苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密移取參苓谷物沖調(diào)粉提取物部分藥材的醇提各樣品液適量，過0.22μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，即制得部分藥材醇提供試品溶液。

2.2.4 陰性對照品溶液制備 按處方比例稱取除去人參的其他藥材，按照醇提液的制備工藝和供試品溶液的處理方法制備陰性對照品溶液。

2.2.5 人參皂苷Rg1、Re、Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍 取1.03 mg/mL人參皂苷Rg1、1.04 mg/mL的人參皂苷Re、1.01 mg/mL的人參皂苷Rb1對照品溶液分別依次稀釋成100 μg/mL、90 μg/mL、80 μg/mL、70 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL的濃度，按照“2.2.1”項下色譜分離條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，分別以人參皂苷Rg1濃度、人參皂苷Re濃度、人參皂苷Rb1濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1線性回歸方程為：Y=0.802 8X+0.1463，R2=0.999 4；人參皂苷Re線性回歸方程為：Y=0.387 1X+0.159 3，R2=0.999 2；人參皂苷Rb1線性回歸方程為：Y=0.795 4X+0.276 3，R2=0.999 7，即人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對照品溶液濃度在10～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 分離條件的考察 精密吸取對照品溶液10 μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有一相同的色譜峰，而陰性對照液未見干擾。見圖1、圖2、圖3。

圖1 對照品HPLC(由左到右依次為人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1)

圖2 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提樣品供試液HPLC

圖3 陰性對照品溶液HPLC

2.2.7 方法學(xué)考察 人參皂苷Rg1、Re、Rb1的儀器精密度RSD分別為1.012 %、1.062 %、1.089 %；供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，測定應(yīng)在48 h內(nèi)完成；重復(fù)性試驗RSD分別為1.871 %、1.683 %、1.764 %；加樣回收率試驗結(jié)果表明，參苓谷物沖調(diào)粉提取物部分藥材的醇提樣品液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1平均回收率分別為99.34 %、101.9 %、100.5 %，RSD分別為1.65 %、1.926 %、1.538 %。

2.3 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提基本方法

將人參、黃精、陳皮加一定濃度和倍量的乙醇，浸泡后，同法回流2～3次，過濾合并濾液，濃縮并定容至一定體積。

2.3.1 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提次數(shù)考察 取人參、黃精、陳皮3份，每份100 g，按表1設(shè)計方案中的參數(shù)分別回流法醇提，制備3份醇提液，50 ℃減壓濃縮并定容至100 mL，按“2.2.3”項分別處理成供試液，每份按照“2.2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測定3種人參皂苷含量，結(jié)果見表1。由表1結(jié)果可知，醇提2次3種人參皂苷之和提取量占醇提3次的95 %以上，故醇提2次為佳。

表1 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提次數(shù)的考察

2.3.2 響應(yīng)面設(shè)計試驗法優(yōu)選參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提工藝參數(shù) 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，對參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提關(guān)鍵工藝參數(shù)，即醇濃度、加醇量、醇提時間采用3因素3水平Box-Bebnken試驗設(shè)計的響應(yīng)面設(shè)計試驗法，通過Design Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。以藥材中3種人參皂苷總含量(%)為評價指標(biāo)值，篩選最優(yōu)醇提工藝參數(shù)。各因素水平見表2。

表2 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平及編碼

注：加醇量為藥材量12倍時，第1次加醇7倍量、第2次加醇5倍量；加醇量為藥材量16倍時，第1次加醇10倍量、第2次加醇6倍量；加醇量為藥材量20倍時，第1次加醇12倍量、第2次加醇8倍量。醇提時間為1.0 h時，第1次0.6 h、第2次0.4 h；水提時間為2.0 h時，第1次1.2 h、第2次0.8 h；水提時間為3.0 h時，第1次2.0 h、第2次1.0 h。

2.3.3 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 響應(yīng)面試驗安排及結(jié)果見表3，表3共14個試驗點，其中12個為析因點，2個為零點，析因點為自變量取值醇濃度(A)、加醇量(B)和醇提時間(C)所構(gòu)成的頂點，零點為區(qū)域的中心點，其中零點試驗重復(fù)2次，用以估算試驗誤差。

2.3.4 模型的建立及顯著性分析 利用Design Expert8.0軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得Y值對醇濃度(A)、加醇量(B)和醇提時間(C)的二次多項回歸模型方程為：Y=0.5562-0.0381625×A+0.0227875×B+0.00185×C-0.014275×A×B-0.0025×A×C-0.0026×B×C-0.0422875×A2-0.0115375×B2+0.0055875×C2，對該模型進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果見表4。

試驗選用的模型P值<0.05具有顯著性，失擬項不顯著(P=0.6748>0.05)，說明該模型是有統(tǒng)計意義的；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2adj=0.9779，說明該模型能解釋97.79%響應(yīng)值的變化，因而該模型的擬合程度比較好，可以用此模型來分析和預(yù)測參苓谷物沖調(diào)粉提取物水煎工藝參數(shù)。

2.3.5 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提工藝各因素對加強指數(shù)影響的曲面分析結(jié)果 利用Design Expert 8.0軟件對參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提工藝數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到曲面分析結(jié)果，見圖4、圖5、圖6。從回歸方程各項方差的進(jìn)一步檢驗也可看出，一次項中影響顯著因素為醇濃度、加醇量，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序，即醇濃度>加醇量>醇提時間。3個因素中，醇濃度與加醇量之間交互作用明顯，而其他兩兩因素之間交互作用不明顯。

表3 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提響應(yīng)曲面設(shè)計試驗測定結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

圖4 醇濃度(A)和加醇量(B)對Y值影響的曲面圖

圖5 醇濃度(A)和加醇量(C)對Y值影響的曲面圖

圖6 加醇量(B)和醇提時間(C)對Y值影響的曲面圖

2.3.6 參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提工藝條件優(yōu)化結(jié)果 采用Design-Expert 8.0軟件對方程Y求解，得到參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提的最優(yōu)工藝參數(shù)：醇濃度為62.01 %，加醇量為20倍，醇提時間為3.0 h，理論上Y值為0.59 %。

2.3.7 驗證試驗結(jié)果 對參苓谷物沖調(diào)粉提取物醇提工藝所得到的優(yōu)化條件進(jìn)行微調(diào)：醇濃度為62 %，第1次提取加醇量為12倍，醇提時間為2.0 h，第2次提取加醇量為8倍，醇提時間為1.0 h。3批小試驗證試驗實際測得Y值為0.64 %，RSD=1.83 %(n=3)，與理論值相接近，所以基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化醇提提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 茯苓、枸杞子、黃精、山藥等與醇提藥渣一并水提工藝條件研究

2.4.1 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提基本方法 將茯苓、枸杞子、黃精、山藥加一定量水浸泡2.0h，加入醇提藥渣一并水提回流2次或3次，每次水提回流一定時間，過濾，合并濾液，濃縮至一定體積。

2.4.2 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提次數(shù)考察 取茯苓、枸杞子、黃精、山藥等3份，每份100 g，分別浸泡，加入醇提藥渣，按表5設(shè)計方案中的參數(shù)分別水提，制備3份水提液，50 ℃減壓濃縮至100 mL，按照“2.1.2”項下方法分別處理成供試液，每份按照“2.1”項下測定多糖含量，結(jié)果見表5。由表5結(jié)果可知，水提2次多糖提取量占水提3次的94%以上，故水提2次為佳。

2.4.3 響應(yīng)面設(shè)計試驗法優(yōu)選參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提工藝參數(shù) 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，對參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提關(guān)鍵工藝參數(shù)，即水提溫度、加水量、水提時間采用3因素3水平Box-Bebnken試驗設(shè)計的響應(yīng)面設(shè)計試驗法，通過Design Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。以藥材中多糖含量(%)為評價指標(biāo)值，篩選最優(yōu)水提工藝參數(shù)。各因素水平見表6。

表5 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提次數(shù)考察設(shè)計

表6 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平及編碼

注：加水量為藥材量10倍時，第1次加水6倍量、第2次加水4倍量；加水量為藥材量20倍時，第1次加水12倍量、第2次加水8倍量；加水量為藥材量30倍時，第1次加水18倍量、第2次加水12倍量。水提時間為1.0 h時，第1次0.6 h、第2次0.4 h；水提時間為2.0 h時，第1次1.2 h、第2次0.8 h；水提時間為3.0 h時，第1次2.0 h、第2次1.0 h。

2.4.4 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提響應(yīng)面試驗安排及結(jié)果 響應(yīng)面試驗安排及結(jié)果見表7，表7共14個試驗點，其中12個為析因點，2個為零點，析因點為自變量取值水提溫度(A)、加水量(B)和水提時間(C)所構(gòu)成的頂點，零點為區(qū)域的中心點，其中零點試驗重復(fù)2次，用以估算試驗誤差。

表7 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提響應(yīng)曲面設(shè)計試驗測定結(jié)果

2.4.5 模型的建立及顯著性分析 利用Design Expert8.0軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得Y值對水提溫度(A)、加水量(B)和水提時間(C)的二次多項回歸模型方程為：Y=2.66+0.73×A+0.19×B+7.062E-003×C+0.11×A×B-0.069×A×C+0.054×B×C+0.35×A2-0.51×B2+0.40×C2，對該模型進(jìn)行顯著性檢驗。結(jié)果見表8。

表8 回歸模型方差分析

2.4.6 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水煎工藝各因素對加強指數(shù)影響的曲面分析 利用Design Expert 8.0軟件對參苓谷物沖調(diào)粉提取物水煎工藝數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到曲面分析結(jié)果見圖7、圖8、圖9。從回歸方程各項方差的進(jìn)一步檢驗也可看出，一次項中影響顯著因素為水提溫度、加水量，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序，即水提溫度>加水量>水提時間。3個因素中，各兩兩因素之間交互作用不明顯。

圖7 水提溫度(A)和加水量(B)對Y值影響的曲面圖

圖8 水提溫度(A)和水提時間(C)對Y值影響的曲面圖

圖9 加水量(B)和水提時間(C)對Y值影響的曲面圖

2.4.7 參苓谷物沖調(diào)粉提取物水煎工藝條件優(yōu)化結(jié)果 采用Design-Expert 8.0軟件對方程Y求解，得到參苓谷物沖調(diào)粉提取物水煎的最優(yōu)工藝參數(shù)：水提溫度為100 ℃，加水量為22.43倍，水提時間為3.0 h，理論上Y值為4.239 %。

2.4.8 驗證試驗結(jié)果 對參苓谷物沖調(diào)粉提取物水提工藝所得到的優(yōu)化條件進(jìn)行微調(diào)：水提溫度為100 ℃，第1次提取加水量為12倍，水提時間為2.0 h，第2次提取加水量為10倍，水提時間為1.0 h。3批驗證試驗實際測得Y值為4.213 %，RSD=2.92 %(n=3)，與理論值相接近，因此基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化水提提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 討論

參苓谷物沖調(diào)粉由藥材和食材組成，其是由中藥材制成的干浸膏粉與谷物食材混合制成的便捷營養(yǎng)沖調(diào)粉，添加天然調(diào)味劑、調(diào)色劑而來。本研究對藥材提取工藝及參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為后續(xù)的噴霧干燥制成干浸膏粉工藝研究奠定了基礎(chǔ)并提供了參考依據(jù)，具有實用意義和應(yīng)用價值。

乙醇濃度、加醇倍量對藥材中人參皂苷的提取量影響顯著。從理論上講提取次數(shù)越少越好，提取次數(shù)太多，時間周期長，效率低，溶劑倍數(shù)多，給濃縮帶來不便。本實驗經(jīng)過多次反復(fù)研究，得出最優(yōu)醇提工藝參數(shù)為醇提2次，浸泡時間1.0h，62%乙醇，加乙醇量為藥材量的12倍、8倍，醇回流時間為2.0h、1.0h；最優(yōu)水提工藝參數(shù)為水提2次，浸泡時間2h，水提溫度100℃，加水量為藥材量的12倍、10倍，水提時間為2.0h、1.0h。采用該醇提方法提取本方中人參、黃精、陳皮中的皂苷成分，水提方法提取本方中茯苓、枸杞、山藥、白扁豆等的多糖成分成本較低、操作簡便、提取條件易于控制且提取效率較高，在工業(yè)化大生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

采用苯酚-硫酸法測定本方水提液中多糖的含量誤差較大，系導(dǎo)致響應(yīng)面設(shè)計實驗結(jié)果無統(tǒng)計意義的主要原因，應(yīng)增加多糖測定的重復(fù)次數(shù)，以重復(fù)試驗的誤差作為誤差來源，系本研究的不足之處。