“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠海馬ChAT、AChE活性的影響

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(廣西中醫(yī)藥大學 針灸推拿學院，廣西 南寧 530001)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由腦血管病引起的以認知功能損害為主要表現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)退行性疾病[1]。流行病學研究表明，VD的患病率非常高，在中國和世界其他國家的老年癡呆癥病例總數(shù)中占20%～30%[2]，是癡呆的第二大類型[3]。VD分為多發(fā)腦梗死性癡呆(MID)、關(guān)鍵部位腦梗死性癡呆和腦低灌流性癡呆[4]。比較常見的是MID，主要是大量微血栓引發(fā)的血管性癡呆[5]。隨著卒中后生存率的提高，VD有可能在未來幾十年影響全世界更多的人[6]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)特別有效的治療靶點[7]。越來越多的證據(jù)表明中樞膽堿能系統(tǒng)損傷參與了VD的發(fā)病。針灸治療VD是目前公認的療效肯定、副作用極少的療法之一，并且已經(jīng)取得了一些改善膽堿能系統(tǒng)方面的實驗證據(jù)。本實驗重點觀察“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸療法對MID模型海馬中ChAT和AChE兩種酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

ChAT、AChE比色試劑盒96T(南京建成生物工程研究所)；水合氯醛AR250G(No.SHLQ-250)；鹽酸多奈哌齊(國藥準字H20050978，加生理鹽水配成10%濃度的藥液)。Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)，離心機(TGL-16M，湖南湘儀儀器有限公司)，勻漿機(PRO200，F(xiàn)LUKO公司)，紫外可見分光光度計(UV5200PC，上海元析儀器有限公司)，酶標儀(THERMO公司)。

1.2 動物與分組

SPF級SD雄性大鼠100只(廣西醫(yī)科大學動物實驗中心)，體重(250±20)g，室溫20～22℃飼養(yǎng)。將100只大鼠隨機分為造模組80只，正常組和假手術(shù)組各10只；造模組經(jīng)Morris水迷宮篩選出40只成功模型，再隨機分為模型組、藥線灸組、西藥組和非穴組，每組各10只。

1.3 造模方法

大鼠預養(yǎng)7天，第8天開始造模。將同種大鼠腹主動脈所取到的血，于37℃溫箱內(nèi)無菌自然干燥，再將血凝塊研碎，經(jīng)200μm篩孔過濾備用。應用時取血栓栓子10mg加生理鹽水0.3mL，配制成33mg/mL混懸液。10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3mL/100g體重)。頸部常規(guī)備皮，碘伏消毒，頸正中偏右側(cè)切開，鈍性分離組織，暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈。用鑷子將頸外動脈挑起，血管下穿兩根縫合線，將遠心端縫合線結(jié)扎，近心端縫合線于靠近頸外和頸總動脈連接的地方打成松活結(jié)備用。夾閉頸總動脈(留出頸外動脈至頸內(nèi)動脈的通路)，抓住遠心端縫合線將頸外動脈提起至適合進針的角度，用4.5號針頭于兩根縫合線中間部分進針，從頸外動脈逆行穿刺至頸總動脈與頸內(nèi)動脈叉口處，適當將松活結(jié)拉緊以捆住埋入血管部分的針體(防止血液從進針口溢出)，緩慢注入制備好的栓子鹽水混懸液0.3mL，推注時間不短于30s，使栓子經(jīng)頸內(nèi)動脈進入顱內(nèi)，出針后結(jié)扎近心端縫合線，開放頸總動脈夾。切口處滴注青霉素后縫合皮膚，碘伏消毒縫合處。假手術(shù)組方法除了頸外動脈穿刺時以生理鹽水0.3mL代替栓子外，其余手術(shù)方法與模型組相同。

1.4 模型篩選

造模后第14天(確保手術(shù)傷口完全愈合)可對大鼠進行Morris水迷宮隱蔽平臺試驗，每天1次，連續(xù)訓練5天。以第5天正常組大鼠逃避潛伏期的均值作為參考值，計算出每個造模大鼠第5天的逃避潛伏期均值與參考值之差占參考值的比值，該值>20%的大鼠則被視為成功模型。

1.5 干預方法

模型篩選后開始各組處理，每天處理1次，每周6次，共4周。具體為：①藥線灸組：遵循“益氣調(diào)血、扶本培元”治則[8]取穴，參照中國針灸學會實驗針灸研究會華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》，選取膻中、中脘、氣海及雙側(cè)足三里、血海。采用直徑為0.25mm的3號藥線，點燃線頭變?yōu)榛鹬楹笥幂p刺激手法點灸相應穴位，按“先上后下、先軀干后四肢、先陽后陰”的次序點灸以上腧穴各1壯，順序為膻中、中脘、氣海、足三里、血海。②非穴組：參考于建春等[9]選擇非穴點的方法，取雙側(cè)肋下2個固定非穴點作對照刺激點(乳中線旁開2.5mm，肋弓下1mm處)，以相同手法行藥線點灸各1壯。③西藥組：按每天每公斤體重1mg的劑量將配制好的鹽酸多奈哌齊溶液給大鼠灌胃。④正常組、假手術(shù)組、模型組均給予相同時間的捉抓刺激。

1.6 取材方法

腹主動脈引出盡可能多的血液后斷頭處死動物，迅速取出整個腦組織，用冰冷生理鹽水洗去殘留血液，在冰上錫紙分離出海馬組織，在電子天平上稱重后迅速置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆么龣z測。

1.7 ChAT與AChE活性測定

標本融化后保持在4℃，按照海馬重量與生理鹽水體積比為1/9的比例混合勻漿，離心5min(2500r/min，4℃)，取上清液待測。采用比色法測定ChAT與AchE活性，按相應試劑盒步驟操作。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett’s T3法。

2 結(jié)果

假手術(shù)組與正常組比較，ChAT和AChE活性均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組與正常組比較，ChAT活性顯著降低(P<0.01)，AChE活性顯著升高(P<0.01)。藥線灸組、西藥組分別與模型組比較，AChE活性均顯著降低(P<0.01)；藥線灸組與西藥組比較，AChE活性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；藥線灸組、西藥組分別與正常組比較，AChE活性均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。藥線灸組與模型組比較，ChAT活性顯著升高(P<0.01)；藥線灸組與正常組比較，ChAT活性有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而西藥組與模型組比較，ChAT活性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。藥線灸組與西藥組比較，ChAT活性有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。非穴組與模型組比較，ChAT和AChE活性均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明治療穴具有穴位特異性。詳見表1。

組別ChAT (U/g)AChE (U/mg·prot)正常組228.93±23.370.67±0.14假手術(shù)組225.33±23.250.70±0.12模型組124.84±25.40●1.38±0.17●藥線灸組203.73±20.12○■▲◆0.82±0.11○■▲西藥組139.14±19.27●0.79±0.11○■▲非穴組126.04±19.45●1.37±0.14●F / P值51.833 /<0.0160.738 /<0.01

注：與正常組比較，●P<0.01，○P<0.05；與西藥組比較，◆P<0.01；與模型組比較，■P<0.01；與非穴組比較，▲P<0.01。

3 討論

本實驗所采用的微栓子造模法是在梅建勛等[10]的研究基礎(chǔ)上改進，重點是提前結(jié)扎頸外動脈遠心端減少遠心斷端出血，并加活結(jié)適時捆住頸外動脈近心端埋入的針體，防止推注栓子時由于壓力過大而導致的血液外溢，減少手術(shù)創(chuàng)傷和術(shù)中視線的干擾，從而進一步提高了造模成功率。

海馬神經(jīng)元對于缺血特別敏感[11]。慢性腦灌注不足所致血管性癡呆的記憶功能障礙，其原因可能為中樞膽堿能神經(jīng)元受損，致使腦內(nèi)學習記憶的神經(jīng)生化基礎(chǔ)海馬環(huán)路損害[12]。乙酰膽堿(Ach)是膽堿能傳導通路中的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，其含量與認知功能呈正相關(guān)。但Ach性質(zhì)很不穩(wěn)定，直接準確測定其水平比較困難。眾所周知，ChAT和AChE是維持腦內(nèi)Ach含量動態(tài)平衡的2種關(guān)鍵酶，其測定也更為方便準確。因此，以這2種酶的活性評價VD療效是目前主要的研究方法之一。

多奈哌齊是一種口服藥物，能夠通過血腦屏障可逆地抑制乙酰膽堿酯酶，從而改善認知功能障礙[13]。雖然這種藥物已經(jīng)在臨床治療VD中應用較多，但其并沒有被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準成為VD的標準用藥。在目前仍然沒有FDA批準的VD治療方案情況下，暫時治療策略主要集中于試圖控制VD引起的認知功能障礙的漸進性[14]。VD的發(fā)病機制較為復雜，可能涉及到氧化應激、能量缺乏、血管內(nèi)皮損傷、炎癥的級聯(lián)反應、血腦屏障的破壞、中樞膽堿能通路的損傷等。從目前的VD機制研究中不難看出，中樞膽堿能系統(tǒng)的損傷很可能不是VD發(fā)病的上游機制，而是下游機制。雖然以多奈哌齊為代表的膽堿能藥物可以提高中樞膽堿能系統(tǒng)的整體活躍度以改善認知功能，但這種治療方式只是基于癡呆必然出現(xiàn)中樞膽堿能系統(tǒng)障礙的假說(這種假說只在阿爾茨海默病被證實過)，并不一定切中VD的主要病機。另外，該類藥物增加Ach含量還會導致受體的敏感性下降，并伴隨膽堿能副作用，比如暈厥、惡心和嘔吐癥狀的出現(xiàn)[15]。

根據(jù)VD的中醫(yī)病機特點并綜合各醫(yī)家觀點來看，血瘀和痰濁應當是該病的主要致病因素，而多臟腑經(jīng)絡功能失調(diào)則是該病的根本發(fā)病機制?！耙鏆庹{(diào)血、扶本培元”治則最早是基于韓景獻“三焦氣化失常與衰老相關(guān)論”[16]提出的。與傳統(tǒng)的培補臟腑陰陽并佐以醒腦開竅的方法區(qū)別在于，其強調(diào)通過調(diào)理三焦氣機來消除因臟腑功能衰退而產(chǎn)生的各種病理產(chǎn)物，并適當調(diào)補氣血，促進各臟腑經(jīng)絡功能的協(xié)調(diào)，以解除“因衰老而易病，因病而加速衰老”的惡性循環(huán)，最大程度地恢復正常衰老之人應有的最佳身體狀態(tài)。該治則經(jīng)過多年的基礎(chǔ)實驗和臨床研究[17]已形成了比較完善的“益氣調(diào)血、扶本培元”針法體系?；救⊙殡?、中脘、氣海、血海、足三里。五穴涉及任脈、足太陰、足陽明三條正經(jīng)，治則以通為主、以補為輔，重調(diào)任脈氣機，佐以生化氣血。任脈貫通腹面，溝通上中下三焦，內(nèi)聯(lián)五臟六腑，為氣血精津液生化和輸布的大通道，是精微物質(zhì)得以上輸濡養(yǎng)腦髓的關(guān)鍵。調(diào)理任脈，可使三焦氣機升降的最主要通路得到改善，使中焦脾胃所化生的氣血精微得到最大程度的釋放。除此之外，暢通任脈還能溝通督脈，使一身上下之氣血運行如環(huán)無端、生生不惜。足太陰和足陽明兩經(jīng)居于任脈兩側(cè)，以絡脈相連，治之可培補脾胃，增強氣血生化之源，最終達到培補全身臟腑陰陽氣血的目的。為了使操作更加簡便而惠及更多人群，筆者繼承“益氣調(diào)血，扶本培元”理念，將其針法改為藥線灸法治療VD并進行了臨床觀察[18]，結(jié)果提示藥線灸治療VD在臨床上至少能達到相同穴位的針刺療效，且效果優(yōu)于西藥多奈哌齊。壯醫(yī)藥線點灸療法類似針刺和艾灸的結(jié)合體，雖然某些操作在刺激強度上可能比針刺和艾灸要大，但總體比針刺和艾灸操作更加簡便、時短，患者配合度也更高。另外，壯醫(yī)藥線點灸療法所使用的藥線是由廣西多種常見中草藥藥液浸泡而成，具有祛風毒、除濕毒、散寒毒、消瘀毒的作用，對于VD發(fā)病過程中各種病理產(chǎn)物的清除可能有重要意義。

本實驗研究很好地模擬了MID中樞膽堿能系統(tǒng)損傷里有關(guān)酶活性的變化，模型組海馬ChAT活性顯著降低，AChE活性顯著升高。實驗結(jié)果表明，“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸療法能顯著提高ChAT活性并降低AChE活性，而西藥多奈哌齊只能降低AChE活性，提示該藥線灸療法在提高大鼠海馬Ach含量以改善中樞膽堿能系統(tǒng)損傷方面整體上可能優(yōu)于西藥多奈哌齊，療效結(jié)果符合此前筆者的臨床研究結(jié)論。“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸療法根植于中醫(yī)治病的整體觀念，必將對西醫(yī)概念中的各種危險因素和發(fā)病機制產(chǎn)生影響。而膽堿能系統(tǒng)的改善很可能是上游發(fā)病機制陸續(xù)改善之后的一種水到渠成的體現(xiàn)。