基于SSR標(biāo)記的不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松遺傳多樣性分析

蔡年輝 許玉蘭 王亞楠 陳 詩(shī) 汪夢(mèng)婷 李根前*

(1.西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

云南松(PinusyunnanensisFranch.)是我國(guó)西南地區(qū)重要的造林樹(shù)種，在區(qū)域林業(yè)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中發(fā)揮著重要的作用。在林分中，個(gè)體的生長(zhǎng)因遺傳基礎(chǔ)或環(huán)境因素(對(duì)有限的光、水、養(yǎng)分等資源的競(jìng)爭(zhēng))而產(chǎn)生了分化[1～2]，生長(zhǎng)表現(xiàn)參差不齊[3]，存在優(yōu)勢(shì)度的差異，其相對(duì)大小或冠層位置常用優(yōu)勢(shì)木、中等木、被壓木或劣勢(shì)木等林木等級(jí)來(lái)描述[2,4～7]。在林木經(jīng)營(yíng)管理中，可能因優(yōu)勢(shì)度的不同采取不一樣的經(jīng)營(yíng)管理措施。對(duì)于天然更新的異齡林，在空間上呈現(xiàn)一定的層次結(jié)構(gòu)，可將林層分為林冠層和更新層，其中林冠層為大量生物提供棲息地并主導(dǎo)著森林生態(tài)系統(tǒng)功能的發(fā)揮，例如固碳增匯、雨量分配、涵養(yǎng)水源及調(diào)節(jié)區(qū)域氣候變化等，并承載了森林生物多樣性的主體部分[8～9]；更新層是決定未來(lái)林分結(jié)構(gòu)的重要因子，也是林分可持續(xù)循環(huán)的決定性因子[10]，其物種的演替是森林群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主導(dǎo)驅(qū)動(dòng)因子[11]，按林層分布探討其遺傳變異特征對(duì)于全面系統(tǒng)地估測(cè)遺傳變異的動(dòng)態(tài)變化有重要意義。

了解遺傳多樣性和遺傳變異結(jié)構(gòu)對(duì)于科學(xué)制定其遺傳資源保護(hù)策略具有重要的指導(dǎo)作用，并有利于合理的開(kāi)發(fā)利用該遺傳資源[12]。因此，有必要對(duì)林木進(jìn)行優(yōu)勢(shì)度劃分，進(jìn)而開(kāi)展遺傳多樣性的研究。目前針對(duì)云南松遺傳多樣性的研究較少，且主要集中在天然群體遺傳變異及其空間格局形成機(jī)制[13～15]，研究揭示了云南松群體遺傳多樣性豐富、群體間遺傳分化不明顯，也不存在明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，地理隔離對(duì)云南松群體遺傳距離的影響低于生態(tài)隔離的作用，但各生態(tài)因子對(duì)云南松群體的作用不一樣，進(jìn)一步依據(jù)云南松群體的遺傳變異特點(diǎn)，初步提出云南松群體的遺傳多樣性的優(yōu)先保護(hù)單元。但從林木優(yōu)勢(shì)度差異研究遺傳多樣未見(jiàn)報(bào)道。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)[16]，在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、圖譜構(gòu)建、基因挖掘等方面的研究發(fā)揮著重要作用[16～19]。為此，本試驗(yàn)以云南松林分為試驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)樹(shù)高和胸徑(地徑)優(yōu)勢(shì)度不同劃分為優(yōu)勢(shì)木、中等木和劣勢(shì)木，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，比較不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松種質(zhì)的遺傳多樣性，研究結(jié)果可為深入了解種質(zhì)遺傳完整性的時(shí)空變化特征奠定基礎(chǔ)，為云南松可持續(xù)生產(chǎn)營(yíng)林措施制定提供依據(jù)，進(jìn)而指導(dǎo)林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)地林分為云南松天然更新林，林分生長(zhǎng)良好，冠層郁閉。野外調(diào)查以樣地法和每木檢尺為基礎(chǔ)，樣地選擇采用隨機(jī)抽樣法，設(shè)置3個(gè)30 m×30 m樣地，樣地位于云南省雙江拉祜族佤族布朗族傣族自治縣境內(nèi)，各樣地的地理坐標(biāo)分別為：樣地一：99°46′41.75″E～99°46′58.35″E、23°22′54.12″N～23°22′57.99″N；樣地二：99°45′32.67″E～99°45′33.81″E、23°20′30.27″N～23°20′31.53″N；樣地三：99°46′54.10″E～99°46′55.86″E、23°22′58.88″N～23°22′59.88″N。對(duì)樣地內(nèi)的每木進(jìn)行檢尺，測(cè)定時(shí)將各植株按生長(zhǎng)狀況劃分為林冠層和更新層，胸徑大于或等于5 cm的植株視為林冠層；將胸徑小于5 cm的植株視為更新層[20]。林冠層測(cè)量樹(shù)高和胸徑，更新層測(cè)量樹(shù)高和地徑。試驗(yàn)地為云南松林，樹(shù)種單一，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，故按樹(shù)高和胸徑(地徑)為主要分類(lèi)因子，將樣地內(nèi)林冠層和更新層的各樣株按樹(shù)高和胸徑(地徑)進(jìn)行優(yōu)勢(shì)等級(jí)分級(jí)。對(duì)3個(gè)樣地內(nèi)實(shí)測(cè)每木的樹(shù)高和胸徑(地徑)整理，確定級(jí)差，將各樣株歸入相應(yīng)的級(jí)別[21]即得到分級(jí)結(jié)果(表1)。

表1 各樣地不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)樹(shù)高與胸徑

表2 SSR擴(kuò)增引物信息表

采集當(dāng)年生針葉，每個(gè)樣品采集的針葉分為兩份，一份新鮮針葉直接進(jìn)行DNA提取，另一份采用硅膠干燥貯藏備份。提取的DNA進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，分別比較優(yōu)勢(shì)木、中等木和劣勢(shì)木3個(gè)不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間的遺傳多樣性，探討它們之間的遺傳變異特征。

1.2 DNA提取與SSR-PCR擴(kuò)增

云南松針葉DNA的提取采用CTAB提取法[22]，由于云南松自身的生物特性，為了提高提取效果，本次研究增加了CTAB的用量，即采用4×CTAB[23]。研究中共使用引物15對(duì)，SSR引物信息見(jiàn)表2。SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照前期研究[29]，擴(kuò)增產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司采用熒光分型檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的收集與分析同前期研究[15]，數(shù)據(jù)收集采用GeneMarker V2.2.0，以GS500LIZ為標(biāo)準(zhǔn)收集數(shù)據(jù)，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，人工逐一校對(duì)，Excel表格輸出基因型分子量數(shù)據(jù)。利用Convert 1.3.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，以滿(mǎn)足不同分析軟件的輸入要求。采用GenALEx 6.4計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)等遺傳多樣性參數(shù)，運(yùn)用Arlequin 3.0進(jìn)行分子方差分析(AMOVA，Analysis of Molecular Variance)。利用GenALEx 6.4計(jì)算遺傳距離，運(yùn)用NTSYS-pc 2.10s對(duì)不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)進(jìn)行聚類(lèi)，聚類(lèi)采用算術(shù)平均數(shù)非加權(quán)成組配對(duì)法(UPGMA，Unweighted Pair Group Method with Arithmetic average)，生成聚類(lèi)圖。不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間遺傳多樣性的差異顯著性采用單因素方差分析，由SPSS17.0軟件進(jìn)行運(yùn)算。圖表制作采用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

將采集的各樣本植株進(jìn)行SSR遺傳多樣性分析(圖1)。結(jié)果表明，從林冠層來(lái)看，三個(gè)樣地優(yōu)勢(shì)木、中等木和劣勢(shì)木的Shannon’s信息指數(shù)平均值分別為0.762、0.759和0.741，以?xún)?yōu)勢(shì)木的最高，觀測(cè)雜合度也表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)木>中等木>劣勢(shì)木；同樣的三個(gè)樣地優(yōu)勢(shì)木、中等木和劣勢(shì)木的期望雜合度平均值分別為0.423、0.402和0.412，以?xún)?yōu)勢(shì)木的最高，有效等位基因數(shù)也表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)木>劣勢(shì)木>中等木。總體來(lái)看，不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間的遺傳多樣性差別較小，以?xún)?yōu)勢(shì)木的略高。

更新層的遺傳多樣性變化表現(xiàn)有所不一樣，三個(gè)樣地的優(yōu)勢(shì)木、中等木和劣勢(shì)木的Shannon’s信息指數(shù)平均值分別為0.774、0.661和0.736，以?xún)?yōu)勢(shì)木的最高；同樣地，三個(gè)樣地的優(yōu)勢(shì)木、中等木和劣勢(shì)木的期望雜合度平均值分別為0.410、0.374和0.403，以?xún)?yōu)勢(shì)木的最高。等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)也表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)木>劣勢(shì)木>中等木，觀測(cè)雜合度表現(xiàn)為中等木>劣勢(shì)木>優(yōu)勢(shì)木。相比較林冠層而言，更新層不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間的遺傳多樣性總體差別稍大些。

進(jìn)一步對(duì)各遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明(表3)，無(wú)論在林冠層還是更新層，不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間的遺傳多樣性差異均不顯著(P>0.05)。

對(duì)不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)內(nèi)各指標(biāo)的變異波動(dòng)進(jìn)行分析(圖2)，在林冠層，優(yōu)勢(shì)木5個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)的變異系數(shù)為8.04%～18.14%，平均為12.55%；中等木為2.56%～19.32%，平均為8.58%；劣勢(shì)木為2.68%～9.13%，平均4.71%，各指標(biāo)平均值在不同分化等級(jí)林木之間表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)木>中等木>劣勢(shì)木。更新層優(yōu)勢(shì)木5個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)的變異系數(shù)為3.78%～13.72%，平均為8.41%；中等木為7.64%～22.17%。平均為14.81%；劣勢(shì)木為8.20%～22.00%，平均12.75%。更新層的總體表現(xiàn)與林冠層有所不同，以?xún)?yōu)勢(shì)木最低，而以中等木最大?？傮w來(lái)看，不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)各指標(biāo)的變化格局不一。

2.2 遺傳距離分析

為進(jìn)一步比較不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松林木間的遺傳關(guān)系，計(jì)算不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松林木間的遺傳距離(表4)。從表中可以看出，林冠層三個(gè)樣地各等級(jí)林木間遺傳距離分別為0.016～0.043、

圖1 不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松遺傳多樣性Fig.1 Genetic diversity in different dominance hierarchies of P.yunnanensis

林層Forest layers指數(shù)Index變異來(lái)源Source of variation平方和Sum of variation自由度Degree of freedom均方Mean squareF值F value顯著性Significance林冠層Canopy layer等位基因數(shù)Number of observed alleles有效等位基因數(shù)Number of effective alleles觀測(cè)雜合度Observed heterozygosity期望雜合度Expected heterozygosityShannon’s信息指數(shù)Shannon’s information index組間Between group0.39802520.1990120.6760.543組內(nèi)Within group1.76592660.294321總數(shù)Total2.1639518組間Between group0.00272820.0013640.1120.896組內(nèi)Within group0.07289360.012149總數(shù)Total0.0756218組間Between group0.00007020.0000350.0360.965組內(nèi)Within group0.00580360.000967總數(shù)Total0.0058738組間Between group0.00064620.0003230.4700.646組內(nèi)Within group0.00412160.000687總數(shù)Total0.0047678組間Between group0.00079420.0003970.0830.921組內(nèi)Within group0.02872960.004788總數(shù)Total0.0295238更新層Regeneration layer等位基因數(shù)Number of observed alleles有效等位基因數(shù)Number of effective alleles觀測(cè)雜合度Observed heterozygosity期望雜合度Expected heterozygosityShannon’s信息指數(shù)Shannon’s information index組間Between group1.32246920.6612351.6860.262組內(nèi)Within group2.35259360.392099總數(shù)Total3.6750628組間Between group0.01481920.0074090.2770.767組內(nèi)Within group0.16046460.026744總數(shù)Total0.1752828組間Between group0.00328320.0016411.6180.274組內(nèi)Within group0.00608760.001014總數(shù)Total0.0093708組間Between group0.00216820.0010840.7350.518組內(nèi)Within group0.00884360.001474總數(shù)Total0.0110118組間Between group0.01994720.0099741.0360.411組內(nèi)Within group0.05778560.009631總數(shù)Total0.0777328

0.013～0.051和0.026～0.048，其高值在樣地一和樣地三均表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)木與劣勢(shì)木之間、樣地二表現(xiàn)為中等木與劣勢(shì)木之間，三個(gè)樣地平均分別為0.032、0.036和0.037，總體平均為0.035。更新層三個(gè)樣地遺傳距離分別為0.016～0.020、0.026～0.028和0.033～0.116，其高值在樣地一和樣地三均表現(xiàn)為劣勢(shì)木與中等木之間、樣地二表現(xiàn)在中等木與優(yōu)勢(shì)木之間，三個(gè)樣地平均分別為0.019、0.027和0.079，總體平均為0.041。綜合來(lái)看，無(wú)論是林冠層還是更新層，其各等級(jí)林木間的遺傳距離均較低，且出現(xiàn)無(wú)一致的規(guī)律性，不同等級(jí)林木間的遺傳距離較近。

2.3 聚類(lèi)分析

為確定各等級(jí)林木間的遺傳關(guān)系，根據(jù)遺傳距離，采用NTSYS-pc 2.10s軟件中的算數(shù)平均數(shù)非加權(quán)成組配對(duì)法(UPGMA)構(gòu)建聚類(lèi)圖。從圖3中看出，三個(gè)樣地林冠層的聚類(lèi)呈現(xiàn)隨機(jī)性，分別以?xún)?yōu)勢(shì)木與中等木、優(yōu)勢(shì)木與劣勢(shì)木、中等木與劣勢(shì)木先聚再與另一優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木聚類(lèi)。同樣地，在三個(gè)樣地更新層的聚類(lèi)也呈現(xiàn)較大的隨機(jī)性，其中樣地一和樣地三以?xún)?yōu)勢(shì)木和劣勢(shì)木相近，而樣地二以中等木與劣勢(shì)木相近。但總體來(lái)看，各個(gè)樣地不同等級(jí)林木間的聚類(lèi)均比較隨機(jī)，聚類(lèi)與林木生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)間無(wú)明顯聯(lián)系。

表4 不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松遺傳距離分析

圖2 不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松遺傳多樣性變異分析 A.林冠層；B.更新層 Na.等位基因數(shù)；Ne.有效等位基因數(shù)；Ho.觀測(cè)雜合度；He.期望雜合度；I. Shannon’s信息指數(shù)Fig.2 Variance coefficient of genetic diversity in different dominance hierarchies of P.yunnanensisA.Canopy layer; B.Regeneration layer Na.Number of alleles; Ne.No. of effective alleles; Ho.Observed heterozygosity; He.Expected heterozygosity; I.Shannon’s information index

3 討論

林木生長(zhǎng)受遺傳物質(zhì)或環(huán)境的影響而呈現(xiàn)不一樣的表型性狀，出現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)程度，然而，這些不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間的遺傳分化和遺傳多樣性差異等均未明確。本研究對(duì)不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，無(wú)論在林冠層還是更新層，不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松林木的遺傳多樣性均表現(xiàn)為觀測(cè)雜合度低于期望雜合度，表現(xiàn)為雜合子缺失。與前期不同群體遺傳多樣性的研究相比[15]，各遺傳多樣性指標(biāo)有所降低，其中以觀測(cè)雜合度差異稍大。在林冠層，三個(gè)樣地優(yōu)勢(shì)木的有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為2.083、0.762、0.290和0.423，均表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)木略高于中等木和劣勢(shì)木。在更新層，有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為2.063、0.774、0.272和0.410，除觀測(cè)雜合度外，其余3個(gè)指標(biāo)也均表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)木略高于中等木和劣勢(shì)木。這在其它樹(shù)種的研究中有類(lèi)似的報(bào)道，如華北落葉松的遺傳多樣性比較中結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)樹(shù)群體的雜合度或多樣性水平要高于天然林，可能是雜種優(yōu)勢(shì)的存在使得基因雜合性高的個(gè)體更容易被選中成為優(yōu)樹(shù)[12]。從總體平均值來(lái)看，不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松林木間遺傳多樣性以?xún)?yōu)勢(shì)木較高，但各等級(jí)間的差異不顯著。

遺傳距離及其聚類(lèi)分析表明，不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間的聚類(lèi)隨機(jī)性較大，其聚類(lèi)與林木生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)間無(wú)必然聯(lián)系，這也進(jìn)一步表明遺傳變異對(duì)林木生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)差異無(wú)明顯響應(yīng)，即遺傳多樣性受林木生長(zhǎng)分化影響不明顯，這可能與林木的天然繁育系統(tǒng)相關(guān)。然而，其它的研究表明，不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)間在臭氧吸收特征與環(huán)境調(diào)控[5]、樹(shù)干液流差異及其對(duì)土壤水分與氣象因子的響應(yīng)[4,6～7]等方面存在差異，可能與光照、溫度、光合有效輻射等有關(guān)[5]。在光競(jìng)爭(zhēng)的林分中，優(yōu)勢(shì)度(相對(duì)樹(shù)高)是最直接反映樹(shù)木對(duì)自然資源利用能力的樹(shù)形因子[30]，水力限制作用尚不明顯下，隨樹(shù)高增加，優(yōu)勢(shì)度增大，樹(shù)木接受更多光照，導(dǎo)致蒸騰和液流速率提高[31]；優(yōu)勢(shì)木具有較強(qiáng)的蒸騰能力，可能是其占據(jù)林內(nèi)有利空間位置，更為充分的獲取光輻射能量以驅(qū)動(dòng)樹(shù)干液流[4,7]；優(yōu)勢(shì)木在林分中占據(jù)空間優(yōu)勢(shì)，容易從環(huán)境中獲得較多的資源，保證了高大樹(shù)木維持較高的液流通量和對(duì)環(huán)境干擾后的恢復(fù)能力[32]；優(yōu)勢(shì)木的樹(shù)干儲(chǔ)水能力較強(qiáng)[33～34]，其對(duì)環(huán)境因子的改變具有較強(qiáng)的緩沖能力[6]。也有研究表明，不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)間木材材性或生物量差異不明顯，木材材性相對(duì)量對(duì)林木分化不太敏感[32]；生物量分配研究表明，除根莖生物量之外，不同林木分化等級(jí)的生物量組分(包括枝、葉、樹(shù)干和根系)的相對(duì)分配比例無(wú)顯著差異，并保持根冠比相對(duì)穩(wěn)定，其相對(duì)分配格局較為保守[2]。不同的研究從各自角度提示了不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)間的差異，總體表現(xiàn)為易受環(huán)境影響的指標(biāo)其波動(dòng)較大，而不易受環(huán)境影響的相對(duì)比較保守。

圖3 不同優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松林木聚類(lèi)圖 a.樣地一林冠層；b.樣地二林冠層；c.樣地三林冠層；d.樣地一更新層；e.樣地二更新層；f.樣地三更新層Fig.3 UPGMA cluster in different dominance hierarchies of P.yunnanensis a.The forest canopy layer at the sample plot one; b.The forest canopy layer at the sample plot two; c.The forest canopy layer at the sample plot three; d.The regeneration layer at the sample plot one; e.The regeneration layer at the sample plot two; f.The regeneration layer at the sample plot three

本研究中，優(yōu)勢(shì)木的遺傳多樣性略高，但它們差異不顯著，表明研究區(qū)域內(nèi)云南松遺傳多樣性與不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)林木間關(guān)系不明顯。但是，調(diào)查中觀察到，林分中作為優(yōu)勢(shì)木的，其長(zhǎng)勢(shì)或干型比中等木或劣勢(shì)木好，同時(shí)對(duì)環(huán)境改變的緩沖能力也較強(qiáng)[6]。此外，遺傳多樣性高其適應(yīng)環(huán)境的能力也越強(qiáng)，森林生態(tài)系統(tǒng)也更加穩(wěn)固[12]。因此，在林分管理或撫育間伐中，建議保留優(yōu)勢(shì)木，給采伐跡地保留生長(zhǎng)勢(shì)好的植株，以其作為天然更新的母樹(shù)，提高遺傳增益的潛力很大，同時(shí)亦有望保持群體有較高遺傳多樣性和相對(duì)穩(wěn)固的生態(tài)系統(tǒng)，但其在較長(zhǎng)時(shí)間尺度上的表現(xiàn)仍有待進(jìn)一步研究。