水曲柳2個(gè)PLT轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達(dá)分析

丁一巍 詹亞光* 張佳薇 何利明

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

PLT(Plethora)為AP2/ERF型轉(zhuǎn)錄因子，其在根發(fā)育過程中起到了建成根尖分生組織細(xì)胞的作用[1～2]，在擬南芥根發(fā)育過程中通過響應(yīng)生長(zhǎng)素的累積而轉(zhuǎn)錄，同時(shí)其活性又能調(diào)控生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸和生物合成，以直接控制生長(zhǎng)素水平，形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)環(huán)來(lái)維持穩(wěn)定的生長(zhǎng)素濃度和根尖干細(xì)胞龕的位置[3～5]。

近些年，隨著模式植物根發(fā)育研究的深入，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)遺傳途徑調(diào)控?cái)M南芥根尖分生組織干細(xì)胞龕，并共同決定干細(xì)胞的命運(yùn)：一個(gè)是依賴生長(zhǎng)素和PLT濃度梯度的途徑[1]；另一個(gè)是調(diào)控根尖皮層和內(nèi)皮層的SCR(SCARECROW)-SHR(SHORT-ROOT)途徑[6～7]。有研究表明，在PLT途徑中有兩條通路影響著PLT轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)：一條是由酪氨酸磺基轉(zhuǎn)移酶TPST(tyrosylprotein sulfotransferase)[6]和根分生生長(zhǎng)因子RGFs(root meristem growth factor)共同介導(dǎo)的調(diào)控通路[8]，另一條是由生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARFs(auxin response factors)介導(dǎo)的根發(fā)育通路[9～10]。這兩條獨(dú)立的通路都是通過PINs(pin-formed)家族蛋白介導(dǎo)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸來(lái)實(shí)現(xiàn)的，它們轉(zhuǎn)運(yùn)生長(zhǎng)素，使其形成一定的濃度梯度，作用于下游的PLT基因。最終實(shí)現(xiàn)PLT途徑與SCR途徑協(xié)同調(diào)控根尖分生組織中的靜止中心QC(quiescent center)，進(jìn)而決定根尖分生組織細(xì)胞的命運(yùn)[11～12]。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，PLT蛋白存在劑量效應(yīng)，生長(zhǎng)素的梯度分布能夠引起PLT表達(dá)的差異：高水平的PLT活性維持干細(xì)胞特性，低水平PLT活性誘導(dǎo)干細(xì)胞子細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)，更低水平的PLT活性才可促使細(xì)胞分化[1～2,13]。在PLT轉(zhuǎn)錄因子當(dāng)中，PLT1和PLT2通過在根尖干細(xì)胞龕周邊形成的濃度梯度來(lái)維持根尖分生組織細(xì)胞的形態(tài)[1～2]。而PLT3、PLT5和PLT7不但能冗余地調(diào)節(jié)側(cè)根原基的啟動(dòng)，還保障了對(duì)稱生長(zhǎng)軸中基因表達(dá)程序的正確建立[8,14]。

水曲柳(Fraxinusmandshurica)屬于木犀科(Oleaceae)白蠟屬(Fraxinus)闊葉經(jīng)濟(jì)木材樹種，廣泛分布于中國(guó)東北部和西北部，俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，朝鮮半島北部及日本北部[15]。因其良好的質(zhì)量與質(zhì)地而被用于家具和特殊建筑材料。但由于長(zhǎng)期過度開采，中國(guó)現(xiàn)存的水曲柳純林極少，已被列為國(guó)家瀕危保護(hù)樹種[16]。目前，在水曲柳根系研究中，大多數(shù)都是生態(tài)學(xué)與林學(xué)的宏觀分析[17～19]，還有部分為建立植株再生體系而進(jìn)行的離體根系的組織培養(yǎng)和抗逆境的研究[20～22]。

根系作為植物之本，其發(fā)育的好壞直接影響植物體的生長(zhǎng)狀況，與林業(yè)生產(chǎn)息息相關(guān)[23]。所以，本研究以RNA-Seq測(cè)序技術(shù)得到的水曲柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，克隆獲得了2個(gè)PLT轉(zhuǎn)錄因子FmPLT2和FmPLT3基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及組織特異性表達(dá)分析，并通過植物激素對(duì)組培苗的生根處理來(lái)分析這兩個(gè)基因在生根過程中的表達(dá)情況，以期為水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子基因功能和根發(fā)育的研究提供參考[24]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以水曲柳組培苗、兩月生實(shí)生苗和二十年生水曲柳雄花為試驗(yàn)材料，于液氮冷凍處理后，置-80℃超低溫冰箱備用(上述材料取于東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院培養(yǎng)溫室和實(shí)驗(yàn)林場(chǎng))。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

CTAB提取RNA的所有試劑均購(gòu)于上海滬試公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)于Omega Bio-tek公司；LA-taq聚合酶購(gòu)于Takara生物公司；pEASY?-T5 Zero Cloning Kit、TranScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart? Tip Green qPCR SuperMix均購(gòu)于北京全世金生物公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

利用CTAB法提取水曲柳兩月生整株實(shí)生苗的總RNA，并分別提取實(shí)生苗根、莖、葉、芽和二十年生水曲柳雄花的總RNA，以及生根處理后第0、7、14和21天這4個(gè)時(shí)間的整株組培苗的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 FmPLT2和FmPLT3全長(zhǎng)基因克隆

以水曲柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，參照擬南芥基因組序列，對(duì)FmPLT2和FmPLT3基因分別設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以水曲柳整株苗cDNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保持。應(yīng)用膠回收試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，純化產(chǎn)物與pEASY-T5載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入Trans-T1感受態(tài)，送生工生物工程(上海)公司測(cè)序。

表1水曲柳FmPLT2和FmPLT3基因克隆及Real-timePCR分析所用引物

Table1PrimersusedinFmPLT2andFmPLT3genescloningandReal-timePCRanalysisinF.mandshurica

引物Primers正向引物序列Forward primer sequence(5'→3')反向引物序列Reverse primer sequences(5'→3')FmPLT2ATGAATTCCAACAATTGGCTTTTTTCAATCATTCCACATTGTGAAFmPLT3GCGAAATGGCACCAGAAAATACGAGTCAGACGAAAGGTCAGTTFmTUAGGACGCTGCCAACAACTTTTTGAGGGGAAGGGTAAATAGTGFmPLT2-qTGACACTCCGCTTCATAACCAAACAGATAATCGGAACCACTCGFmPLT3-qGGAACATTTGCTACTGAGGAGGGAGATTATGATGATAGAATGGGGC

1.5 FmPLT2和FmPLT3基因序列分析

用NCBI在線工具中的ORF Finder預(yù)測(cè)目的基因的ORF。通過ExPASy-ProParam、SMART、SignalP4.1等在線軟件對(duì)目的基因編碼的氨基酸序列、相對(duì)分子質(zhì)量、理論pI值、親水性/疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行基礎(chǔ)分析。利用SOPMA、ExPASy中的SWISS-MODEL、Psort等在線軟件分別對(duì)水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得同源性較高的其他物種的PLT基因編碼的氨基酸及核苷酸序列，整理后導(dǎo)入MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用ClustalX1.8軟件對(duì)不同物種的PLT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.6 FmPLT2和FmPLT3基因的表達(dá)分析

將制備的各組織部位與各生根時(shí)間的cDNA樣品作為模板，根據(jù)測(cè)序的水曲柳FmPLT2和FmPLT3基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)Real-time PCR引物(FmPLT2-q和FmPLT3-q，表1)，并以水曲柳TU基因作為內(nèi)參，引物為FmTU(表1)[25]。按照TransStart? Tip Green qPCR SuperMix試劑盒中20 μL反應(yīng)體系的說明加樣，在ABI-7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)3次，分析數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法(ΔΔCt=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對(duì)照組)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 FmPLT2和FmPLT3基因全長(zhǎng)基因的獲得

以水曲柳兩月生實(shí)生苗的cDNA為模板進(jìn)行克隆，分別獲得了兩條1 500 bp左右的片段(圖1)。經(jīng)測(cè)序，F(xiàn)mPLT2和FmPLT3基因的開放閱讀框長(zhǎng)度分別為1 599和1 494 bp，分別編碼了532和497個(gè)氨基酸(圖2)。利用在線軟件SMART分別對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，F(xiàn)mPLT2在168-240和270-334含有AP2結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)mPLT3在224-296和326-390含有AP2結(jié)構(gòu)域。AP2是PLT轉(zhuǎn)錄因子家族的特征結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步確認(rèn)它們編碼了PLT轉(zhuǎn)錄因子，將所得序列命名為FmPLT2和FmPLT3。

圖1 FmPLT2(A)和FmPLT3(B)基因克隆Fig.1 PCR product of FmPLT2 and FmPLT3

圖2 FmPLT2(A)和FmPLT3(B)基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列 灰色陰影區(qū)域?yàn)锳P2結(jié)構(gòu)域；“*”代表終止密碼子Fig.2 The nucleotide and encoded amino acid sequence of FmPLT2(A) and FmPLT3(B) Gray shaded area is the AP2 domain；“*” represents the stop codon

2.2 FmPLT2和FmPLT3蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 FmPLT2和FmPLT3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

利用在線軟件預(yù)測(cè)了FmPLT2和FmPLT3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，相對(duì)分子量分別為59和55 kDa左右，等電點(diǎn)分別為5.98和5.79，脂肪系數(shù)分別為61.65和59.76，半衰期都是30 h，不穩(wěn)定系數(shù)分別為46.09和52.11，均為不穩(wěn)定蛋白。兩種蛋白中絲氨酸含量均最高，分別占總氨基酸含量的11.7%和10.9%。

利用Protscal在線軟件預(yù)測(cè)了水曲柳FmPLT2和FmPLT3蛋白的親水性和疏水性，F(xiàn)mPLT2平均親水系數(shù)為-0.712，F(xiàn)mPLT3平均親水系數(shù)為-0.600。通過親水性分布圖看到FmPLT2多肽鏈第280位的氨基酸最低分為-3.022，親水性最強(qiáng)，第454位氨基酸最高分為1.367，疏水性最強(qiáng)。而FmPLT3多肽鏈的第62位氨基酸最低分為-3.511，親水性最強(qiáng)，第434位氨基酸最高分為1.456，疏水性最強(qiáng)。根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)的規(guī)律，推測(cè)FmPLT2和FmPLT3這兩個(gè)蛋白都為親水性蛋白。經(jīng)SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)FmPLT2和FmPLT3均無(wú)信號(hào)肽，且通過TMHMM Server.2.0預(yù)測(cè)兩種蛋白均無(wú)跨膜區(qū)域，全部位于膜外。

2.2.2 FmPLT2和FmPLT3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件對(duì)FmPLT2和FmPLT3的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，F(xiàn)mPLT2蛋白由α螺旋(23.31%)、β折疊(16.17%)、β轉(zhuǎn)角(3.95%)、無(wú)規(guī)則卷曲(56.58%)組成，F(xiàn)mPLT3蛋白由α螺旋(25.35%)、β折疊(13.08%)、β轉(zhuǎn)角(4.83%)、無(wú)規(guī)則卷曲(56.74%)組成，說明這兩個(gè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)都以無(wú)規(guī)則卷曲為主。

2.2.3 FmPLT2和FmPLT3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件預(yù)測(cè)FmPLT2和FmPLT3的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖3)?？梢詮哪Ｐ椭锌闯鯢mPLT2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相似，都以α螺旋和β折疊為主要組成部分，而FmPLT3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)則是以β折疊為主，α螺旋相對(duì)較少。

圖3 FmPLT2(A)和FmPLT3(B)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型Fig.3 Predicted three-dimensional configuration of FmPLT2 and FmPLT3

2.2.4 FmPLT2和FmPLT3蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用在線軟件對(duì)FmPLT2和FmPLT3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示FmPLT2在細(xì)胞核中的概率是82.6%，在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的概率都為8.7%；FmPLT3在細(xì)胞核中的概率為69.6%，在細(xì)胞質(zhì)中為17.4%，在線粒體中為8.7%，在過氧化物酶體中為4.3%。利用NetPhos 2.0 Server預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示FmPLT2蛋白含有24個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、5個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和8個(gè)酪氨酸位點(diǎn)，F(xiàn)mPLT3蛋白含有27個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、8個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和5個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。

2.3 FmPLT2和FmPLT3蛋白保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

分別以FmPLT2和FmPLT3蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與水曲柳FmPLT2和FmPLT3蛋白同源性較高的其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。包括油橄欖(Oleaeuropaea)、毛果楊(Populustrichocarpa)、可可(Theobromacacao)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、榴蓮(Duriozibethinus)、胡桃(Juglansregia)、煙草(Nicotianatabacum)的PLT2氨基酸序列和油橄欖(Oleaeuropaea)、毛果楊(Populustrichocarpa)、芝麻(Sesamumindicum)、葡萄(Vitisvinifera)、絨毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、野生煙草(Nicotianaattenuata)、番木瓜(Caricapapaya)、番茄(Solanumlycopersicum)的PLT3氨基酸序列。利用MEGA7.0軟件通過鄰近法(Neighbour-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。從圖4中能夠看出水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子與同屬木犀科的油橄欖親緣關(guān)系最為緊密，其次是PLT3與芝麻的關(guān)系較為親近。

圖4 FmPLT2和FmPLT3蛋白與部分植物PLT蛋白的同源性比較Fig.4 Homologous comparison of FmPLT2 and FmPLT3 protein with PLT protein from other species

圖5 FmPLT2和FmPLT3蛋白同源序列比對(duì) 底部小寫字母表示保守氨基酸；“·”表示缺失；黑色、粉色、綠色、黃色分別表示保守性為100%、≥75%、≥50%、≥33%的氨基酸；A和B為PLT轉(zhuǎn)錄因子的AP2結(jié)構(gòu)域。Fig.5 Homologous alignments of FmPLT2 and FmPLT3 protein Lowercase letters at the bottom indicate conservative amino acids; “·” represents missing; The shadow of the black, pink, green, yellow represent conservative amino acids were 100%,≥75%,≥50%,≥33%; A and B are the AP2 domains of the PLT transcription factor.

利用Clustal X1.8將水曲柳、油橄欖、毛果楊等不同物種的PLT2和PLT3蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域多重比對(duì)分析(圖5)。結(jié)果顯示水曲柳FmPLT2蛋白與油橄欖OePLT2(XP_022874541.1)蛋白一致性最高，為70.30%，與毛果楊PLT1(XP_024453004.1)的一致性次之，為58.42%，與可可(XP_017982598.1)、巴西橡膠樹(XP_021645779.1)、榴蓮(XP_022756268.1)、煙草(XP_018807472.1)、木薯(XP_021634694.1)、胡桃(XP_018807472.1)PLT2蛋白一致性近似，分別為57.57%、57.00%、57.00%、56.86%、56.44%和56.29%。FmPLT3蛋白與油橄欖OePLT3(XP_022893842.1)一致性最高，為67.19%，與芝麻PLT3(XP_011097469.1)的一致性次之，為56.39%，與番木瓜(XP_021897531.1)、葡萄(XP_003635541.1)PLT3的一致性近似，分別為47.81%和47.52%，與番茄(XP_004250153.2)、絨毛煙草(XP_009603183.1)、野生煙草(XP_019245429.1)及毛果楊(XP_024460943.1)PLT3的一致性最差，分別為45.54%、45.50%、45.40%和44.13%。

2.4 FmPLT2和FmPLT3基因的表達(dá)分析

分別取水曲柳兩月生實(shí)生苗的根、莖、葉、芽及水曲柳二十年生雄花，通過熒光定量檢測(cè)FmPLT2和FmPLT3在不同組織中的表達(dá)情況(圖6A)。從圖6中可以看出，F(xiàn)mPLT2和FmPLT3在根中的表達(dá)量都高于在其他組織中的表達(dá)量，且在葉中的表達(dá)量均為最低。特別是FmPLT2在根中的表達(dá)量是葉中表達(dá)量的27.5倍之多。

通過不同組織的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mPLT2和FmPLT3在根中的表達(dá)量均高于其他組織，所以想利用水曲柳組培苗生根過程來(lái)進(jìn)一步探究這兩個(gè)基因在生根過程中的表達(dá)情況(圖6B)。本研究將生根處理前視為第0天，生根處理后第7、14和21 d視為生根第7、14和21 d。結(jié)果表明，F(xiàn)mPLT2在生根7天時(shí)的表達(dá)量顯著升高，而FmPLT3在7天時(shí)與0天(未生根)時(shí)的表達(dá)量相比變化不明顯。且FmPLT3的表達(dá)量在生根14天時(shí)達(dá)到高峰，是0天時(shí)表達(dá)量的3.8倍，隨后下調(diào)；而FmPLT2的表達(dá)量卻在7天后逐漸增長(zhǎng)，隨后進(jìn)入緩慢上升狀態(tài)，并在21天時(shí)達(dá)到高峰，是0天時(shí)表達(dá)量的32倍。

圖6 水曲柳PLT基因的表達(dá)分析 A.不同組織中兩個(gè)基因的表達(dá)量；B.不同生根天數(shù)時(shí)兩個(gè)基因的表達(dá)量Fig.6 F.mandshurica PLT genes expression analysisA. Expression levels of two genes in different tissues; B. Expression levels of two genes in different rooting days

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，植物根系發(fā)育的研究取得了顯著的成果，其中PLT轉(zhuǎn)錄因子在根尖分生組織生長(zhǎng)素遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到了非常重要的作用，且實(shí)現(xiàn)了對(duì)PLT轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控通路的初步探究[3]。其中還包括PLT基因在根——芽轉(zhuǎn)化體系中的研究，研究表明由于PLT基因與控制莖尖分生組織發(fā)育的關(guān)鍵基因CUC2(CUPSHAPED-COTYLEDON)之間的調(diào)控關(guān)系，致使其在擬南芥芽再生通路中也發(fā)揮重要作用[27]。由于PLT基因與生長(zhǎng)素的互作關(guān)系，使之成為葉原基發(fā)育與花發(fā)育通路的關(guān)鍵一環(huán)[9,28～29]。

目前，對(duì)PLT轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究主要集中在擬南芥、小立碗蘚和水稻等草本植物中[30～32]。水曲柳是“東北三大硬闊”之一，提高其繁殖規(guī)模對(duì)人工造林有著重大意義，但目前對(duì)水曲柳根系發(fā)育的研究報(bào)道甚少。本研究克隆了兩個(gè)水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子基因FmPLT2和FmPLT3。通過對(duì)核苷酸序列及編碼產(chǎn)物生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因各含有2個(gè)AP2特征結(jié)構(gòu)域，且蛋白都為親水性蛋白。同源序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，它們與同屬木犀科的油橄欖OePLT2和OePLT3蛋白的同源性最高，與毛果楊PtPLT1和PtPLT3蛋白也有較高的一致性，可預(yù)測(cè)FmPLT2和FmPLT3轉(zhuǎn)錄因子在水曲柳根系發(fā)育過程中起到調(diào)控根尖分生組織規(guī)模的基點(diǎn)作用。通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)FmPLT3蛋白有一定概率存在于過氧化物酶體中，且過氧化物酶在細(xì)胞中參與植物細(xì)胞內(nèi)吲哚乙酸的氧化分解和木質(zhì)素的形成，從而起調(diào)節(jié)細(xì)胞的伸長(zhǎng)和次生壁木質(zhì)化的作用，也可作為組織老化的一種生理指標(biāo)[33～34]?？蛇M(jìn)一步推測(cè)FmPLT3在根系發(fā)育時(shí)發(fā)揮作用。另外，也有研究者通過毛果楊PtPLT1(與FmPLT2同源)的表達(dá)來(lái)分析根系發(fā)育情況的報(bào)道[35]?？蛇M(jìn)一步推測(cè)FmPLT2在水曲柳根原基發(fā)生起重要作用。

同時(shí)，表達(dá)分析表明FmPLT2和FmPLT3基因在根中的表達(dá)量均高于其他組織，且利用植物激素對(duì)無(wú)根組培苗進(jìn)行生根處理前后，兩個(gè)基因都具有差異性的變化(圖6B)。在處理后第7天，組培苗并沒有根的發(fā)生，但FmPLT2基因表達(dá)卻發(fā)生明顯變化；而第14天時(shí)根系逐漸發(fā)生，此時(shí)FmPLT3基因才發(fā)生顯著變化；在第21天時(shí)根生長(zhǎng)處于最旺盛階段，F(xiàn)mPLT2始終活躍的調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育，而FmPLT3在根發(fā)生后開始下調(diào)。雖然整個(gè)生根過程中FmPLT3的表達(dá)量變異幅度沒有FmPLT2的表達(dá)量顯著，但以往的都是將擬南芥AtPLT3、AtPLT5和AtPLT7這三個(gè)基因結(jié)合研究它們?cè)诟l(fā)育中的冗余作用[14]。所以對(duì)PLT3基因功能的研究還需更深層次的推進(jìn)。而FmPLT2的顯著變化可能與其參與細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)等多個(gè)發(fā)育途徑有關(guān)[36]。但是上述推測(cè)有待進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證，而本研究將作為后續(xù)水曲柳根系發(fā)育遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的初步探索。