剛毛檉柳S-腺苷甲硫氨酸合成酶(ThSAMS)基因的克隆及表達分析

張 悅 趙 鑫 侯 崢 王艷敏,2 王玉成 王 超*

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081)

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代謝中的一個關鍵酶，它催化甲硫氨酸與ATP生物合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM是生物體中重要的代謝物質，參與了植物的轉甲基、轉氨丙基和轉硫反應等多種生理過程[1～3]。SAM作為重要的甲基供體，為核酸、蛋白質、多糖、脂質等提供甲基化修[4]。SAM具有轉氨丙基功能，在多胺(精胺、亞精胺等)合成途徑中發(fā)揮重要作用[5]。此外，SAM還參與乙烯、谷胱甘肽、甜菜堿以及木質素的合成和代謝過程[6～8]。因此，SAMS基因在植物生長發(fā)育、新陳代謝及逆境脅迫響應過程中都發(fā)揮重要作用。

目前，SAMS基因已在擬南芥[9]、小麥[10]、玉米[11]、楊樹[12]、松樹[13]等多種植物中被克隆，并且發(fā)現在一些植物中SAMS基因家族具有多個成員，擬南芥中有4個SAMS成員、玉米中4個、番茄中有3個[14]、煙草中至少有2個[15]。在擬南芥基因SAMS家族4個成員中，SAMS1、SAMS2和SAMS4在所有組織中均有表達，而SAMS3主要在花粉中表達[16～17]。玉米SAMS基因家族4個成員根莖中的表達量大于葉片，其中SAMS1、SAMS2和SAMS4的表達受鹽脅迫誘導，而SAMS3不受鹽脅迫誘導[11]。松樹PcSAMS1優(yōu)先在根中表達，并且在不定根分生組織中特異性表達，而PcSAMS2在根和芽中表達并且在不定根形成期間表達下調[13]?？梢?，雖然植物SAMS基因序列具有較高的相似性，但不同植物SAMS基因或同一物種的不同家族成員之間的表達模式具有明顯的組織和時間特異性[16～18]，表明不同的SAMS基因可能參與了不同的生理代謝過程。因此，克隆不同物種的SAMS基因，對進一步了解該基因的功能具有重要意義。

剛毛檉柳(Tamarixhispida)是一種生長在干旱沙漠中的樹種，能吸收到深層的地下水，并且能在含鹽0.5%～1%的鹽堿地上生長，具有很強的抗干旱和抗鹽堿能力，表明其體內存在大量具有抗逆功能的基因資源，是研究木本植物抗逆機制和篩選及分離抗逆基因的理想材料[19]。但是，目前為止關于剛毛檉柳SAMS基因結構和功能的研究未見報道。本研究克隆了一條編碼剛毛檉柳SAMS基因ThSAMS全長cDNA序列，對該序列進行了生物信息學分析，利用qRT-PCR技術分析其在NaCl、PEG和外源ABA脅迫下的表達模式，為進一步研究ThSAMS在剛毛檉柳非生物脅迫應答中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理方法

將采自中國科學院吐魯番沙漠植物園的剛毛檉柳種子播種于V(泥炭土)∶V(沙)為1∶3的混合土中，放置于溫室培養(yǎng)，溫室培養(yǎng)條件為：平均溫度24℃，相對濕度70%～75%，光照強度400 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h。選取生長狀態(tài)良好和長勢相同的2月齡剛毛檉柳幼苗對其進行處理，分別用0.4 mol·L-1NaCl、20%(w/v)PEG6000和和100 μmol·L-1ABA澆灌檉柳幼苗，在脅迫處理1、2、6、12、24、48 h后，分別取剛毛檉柳的根部組織和地上部分組織，每個時間點同時用正常澆水幼苗作為對照，每個處理重復3次，每個樣品至少15棵幼苗，使其充分混合后用液氮速凍，置于-80℃冰箱用于提取RNA。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

用CTAB法提取不同脅迫處理的剛毛檉柳地上和地下組織總RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒說明進行反轉錄合成cDNA第一條鏈。

1.3 ThSASM全長cDNA序列克隆

根據剛毛檉柳轉錄組數據中Unigenes功能注釋結果，查找并獲得一條SAMS基因的序列。為了驗證基因序列的準確性，利用primer premier 5.0設計引物，上游引物P1序列為TGCTGGTGACCAAGGTCACATGTTTGGCTAC，下游引物P2序列為GGTGGTGCTTTCTCCGGAAAGGAC，以檉柳cDNA為模板對該基因進行PCR擴增，得到目的條帶進行膠回收純化后，連接到pMD18-T載體上進行測序。獲得ThSASM基因全長序列。

1.4 ThSASM基因及蛋白的生物信息學分析

利用在線工具ORF founder分析ThSAMS基因的開放讀碼框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)；利用ExPASy在線軟件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預測ThSAMS編碼的氨基酸序列的分子量及理論等電點；用二級結構預測軟件(https://www.predictprotein.org/)預測ThSAMS基因編碼蛋白質的二級結構；用Protscale在線分析ThSAMS蛋白質的疏水性(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)；用PSORT進行亞細胞定位預測(https://www.genscript.com/psort.html)。通過NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網站進行BlastP檢索，獲得與剛毛檉柳ThSAMS基因同源性較高的10種植物的SAMS基因蛋白序列，利用BioEdit軟件進行多序列比對，對其進行蛋白序列保守結構分析，并利用MEGA6.0軟件預測系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 ThSASM基因表達分析

利用實時熒光定量RT-PCR技術對ThSASM基因的表達進行分析。根據ThSAMS全長cDNA序列設計定量引物(表1)，以剛毛檉柳β-actin(FJ618517)、α-tubulin(FJ618518)和β-tubulin(FJ618519)基因作為內參基因，引物序列見表1。利用MJ Opticon實時定量PCR儀(Bio-Rad，Hercules，CA)分析ThSAMS基因的表達模式。實時熒光定量RT-PCR使用全式金的TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒，反應體系為：2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，稀釋10倍后的模板cDNA 2 μL，上游引物和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，加滅菌去離子水補足體積至20 μL。反應程序為：94℃預變性30 s；94℃變性12 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，79℃讀板1 s，45個循環(huán)。待PCR反應結束后，將反應溫度以0.5℃·s-1的速度從55℃升到99℃。每個樣品重復3次，用2-△△Ct方法進行基因的相對定量分析[20～21]。

表1 實時定量RT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 ThSAMS基因全長cDNA的獲得

通過分析剛毛檉柳轉錄組數據設計全長序列的上、下游引物P1和P2，經PCR擴增，產物由瓊脂糖凝膠電泳分離后呈現一條長約1 185 bp的特異性條帶(圖1)。與預期片段大小一致。將該序列膠回收后連接至pMD18-T上，基因測序結果與轉錄組堿基完全相同，將此基因命名為ThSAMS。

圖1 檉柳ThSAMS基因的克隆Fig.1 Cloning of ThSAMS gene from T.hispida

2.2 ThSAMS基因的生物信息學分析2.2.1 ThSAMS氨基酸組成、理化性質分析

運用ORF Finder和ExPASy進行分析，得知ThSAMS基因cDNA全長(ORF)為1 185 bp，編碼394個氨基酸序列(圖2A)。ThSAMS基因編碼蛋白的相對分子質量為97.85 kDa；理論等電點PI為5.02，推測其分子式為C3529H5875N1185O1478S290。蛋白質不穩(wěn)定系數估算值為47.75，為不穩(wěn)定性蛋白質。理論推導出半衰期大約為4.4 h；親水性平均數為0.765，預測該蛋白為親水性蛋白，與Protscale在線分析ThSAMS蛋白質的疏水性結果一致(圖3B)。利用NCBI CD-Search service工具對ThSAMS編碼蛋白的結構域進行分析，結果表明，ThSAMS基因序列氨基酸區(qū)域含有S-AdoMet_synt_C超級家族核心序列(圖2B)。

2.2.2ThSAMS基因二級結構預測

根據蛋白質二級結構預測，發(fā)現ThSAMS二級結構由無規(guī)則卷曲，α-螺旋和β-折疊組成。其中以無規(guī)則卷曲為主，占46.67%(約184個氨基酸)，其次是α-螺旋占29.74%(約117個氨基酸)，其中β-折疊占23.59%(約93個氨基酸)(圖3A)。利用Protscale分析發(fā)現(圖3B)，親水氨基酸均勻的分布在整個ThSAMS編碼蛋白質的肽鏈上且具有明顯的親水區(qū)，整條多肽鏈表現為親水性。利用SignlP4.1Server進行氨基酸序列信號肽分析發(fā)現ThSAMS基因編碼的蛋白沒有信號肽存在(圖3C)。

2.2.3 ThSAMS蛋白的亞細胞定位分析

利用Psort對ThSAMS蛋白的亞細胞進行定位預測，表2是可能定位在細胞質、線粒體、細胞核、過氧化氫酶和質膜上的概率，結果顯示定位在細胞質概率最大(60.9%)，其它定位概率較小，表明ThSAMS可能定位在細胞質中。

表2 ThSAMS亞細胞定位

圖2 剛毛檉柳ThSAMS基因序列及保守區(qū)結構 A.ThSAMS基因cDNA序列及其推測的氨基酸序列；B.ThSAMS保守區(qū)結構預測Fig.2 Nucleotide sequence and putative conserved domains of ThSAMS A.Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of ThSAMS; B.Putative conserved domains of ThSAMS

圖3 ThSAMS蛋白質的生物信息學分析 A.ThSAMS二級結構預測；B.ThSAMS蛋白質的疏水結構預測；C.ThSAMS蛋白信號肽預測Fig.3 Bioinformatics analysis of ThSAMS protein A. Secondary structure prediction of ThSAMS; B. Hydrophobicity analysis of ThSAMS; C. Signal P-NN prediction for ThSAMS protein

2.2.4ThSAMS基因編碼氨基酸序列的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

利用NCBI的Smart BLAST數據庫進行序列同源性分析比較，發(fā)現ThSAMS蛋白與其他植物的SAMS蛋白氨基酸序列具有較高的一致性，利用Bioedit對ThSAMS蛋白與已知10種不同植物(NtSAMS煙草；HbSAMS橡膠樹；DzSAMS榴蓮；CcSAMS黃麻；TcSAMS可可；CaSAMS辣椒；GhSAMS陸地棉；McSAMS苦瓜；GbSAMS海島棉；ZjSAMS棗)SAMS基因編碼的蛋白進行同源性序列比較(圖4)。結果表明，與其他物種的SAMS一樣，ThSAMS蛋白具有S-AdoMet_synt_C家族典型的結構域。其可能在剛毛檉柳SAM的生物合成過程中扮演著重要的角色，是細胞內影響生命活動的關鍵。ThSAMS基因編碼的氨基酸序列與煙草、海島棉的SAMS氨基酸序列相似度高達92%，與榴蓮、黃麻、可可、辣椒、陸地棉、苦瓜的SAMS氨基酸序列相似度高達93%，與橡膠樹的SAMS氨基酸序列相似度高達94%，其中與棗的的SAMS氨基酸序列最相似度高達95%，說明該基因在植物進化中非常保守。

為更好地研究進化關系，利用MEGA6.0軟件構建幾種植物SAMS基因編碼蛋白同源序列的系統(tǒng)進化樹(圖5)。結果顯示剛毛檉柳SAMS與棗SAMS親緣關系最近，二者間可能有相似的功能。

2.3 ThSAMS基因的表達分析

為了進一步研究ThSAMS基因表達的組織特異性及其對逆境脅迫的響應情況，采用實時RT-PCR方法分析其正常生長和脅迫處理下的表達模式。正常生長情況下，ThSAMS在檉柳的地上和地下部分都表達，但是其在地上部分的表達量是地下部分組織中2.36倍(圖6)。在0.4 mol·L-1NaCl和20% PEG和外源ABA處理下，ThSAMS的表達都發(fā)生了變化，但在不同處理條件和不同組織中的表達模式有所差異(圖7)。

在NaCl脅迫下，ThSAMS基因在檉柳中受到了不同程度的表達，其中ThSAMS基因在檉柳地上部分表達上調，表達量逐漸上升，在12 h時表達量達到峰值，約為對照表達量的14.4倍；ThSAMS基因在檉柳根部組織表達下調，表達量在2 h達到頂峰后逐漸下降，在48 h時表達量達到最低，下調了0.07倍；與地下部分相比，ThSAMS表達在地上部分中誘導程度更高。

圖5 幾種植物SAMS蛋白同源序列的系統(tǒng)進化樹分析 標尺代表每單位氨基酸的變化，0.01代表兩個序列之間1%的差異。Fig.5 Phylogenetic tree analysis of SAMS proteins from various plant species The scale bar expected number of substitutions per site,0.01means 1% changes were observed between two sequences.

圖6 ThSAMS基因在剛毛檉柳組織器官中的表達分析Fig.6 Expression analysis of ThSAMS gene in T.hispida under different tissues

圖7 ThSAMS基因在不同脅迫下的表達模式分析 基因相對表達量=2^-ΔΔCt，>1代表上調表達；=1代表表達無變化；<1代表下調表達。Fig.7 Expression analysis of ThSAMS gene under different abiotic stresses Relative expression level was 2^-ΔΔCt;>1 upregulation;=1,no change in regulation;<1,downregulation

在模擬干旱PEG脅迫下，ThSAMS基因在檉柳中呈現表達上調且呈現雙峰型特征。地上部分分別在2和12 h其相對表達量達到峰值。ThSAMS基因在地下根部組織中與地上部分的表達具有相似性，在脅迫6h時達到峰值后逐漸降低，在24 h時再次達到峰值后逐漸下降。與地上部分相比，ThSAMS基因的表達在地下根部組織中隨著脅迫時間的增加變化比較平緩。

在外源ABA處理下，ThSAMS基因在檉柳不同組織中呈現截然不同的表達模式。在地上部分組織中，ThSAMS基因的表達沒有發(fā)生明顯變化；而在地下部分組織中，ThSAMS基因受ABA誘導上調表達，處理48 h時表達量是對照的5.38倍。

上述實驗結果表明，ThSAMS基因在NaCl和PEG脅迫處理后剛毛檉柳地上和地下組織的表達均能產生不同程度的改變，推測該基因可能參與檉柳抗旱耐鹽生理過程。但是，在外源ABA處理下ThSAMS基因在檉柳地上和地下組織中呈現不同的表達模式，表明其在不同組織中可能受不同的信號轉導途徑所調控。

3 討論

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是生物體中一種重要的生理活性物質，參與了多胺、乙烯和谷胱甘肽等物質的合成和代謝過程，而這些物質在植物抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[22～23]。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)作為SAM合成的催化酶，也直接參與調節(jié)植物對多種逆境脅迫的應答反應[14,24～25]。本研究首次從剛毛檉柳中克隆到一個編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因ThSAMS的全長序列,序列分析表明,ThSAMS與其他物種的SAMS氨基酸序列具有很高的相似性，并且也包含了三個保守結構域：N端的蛋氨酸結合基序(GHPDK)、中間結構域(GAGDQGHMFGY)和C端ATP結合基序結構域(GGGAFSGKD)，表明該基因屬SAMS成員。

目前，多種植物中的SAMS基因已被克隆鑒定，研究發(fā)現SAMS基因表達受多種逆境脅迫誘導。鹽地堿蓬、煙草和陸地棉的SAMS受鹽脅迫誘導表達[26～28]。Ding等克隆了離子芥中SAMS基因，該基因表達受低溫、乙烯和鹽脅迫誘導[24]；黃瓜CsSAMs受NaCl、PEG、高溫和低溫等脅迫誘導表達[29]；黑穗病菌脅迫和低溫(4℃)、PEG、NaCl等非生物脅迫均能誘導甘蔗ScSAM的表達[30]。這些研究暗示SAMS基因可能在植物的生物和非生物脅迫響應中發(fā)揮重要作用。Gong等[28]將SAMS1基因轉入番茄中，轉基因植株體內的亞精胺(Spd)和精胺(Spm)的含量顯著提高，抗鹽堿脅迫的能力顯著增強[27]；石蒜SAMS基因能夠提高植物多胺和乙烯的含量，加速了細胞壁木質化，增強轉基因植株的耐鹽能力[31]。紫花苜蓿MfSAMS1在葉片中的表達受到了冷、脫落酸(ABA)、H2O2和一氧化氮(NO)誘導,過表達MfSAMS1促進了多胺的合成，改善細胞的抗氧化能力，進而提高轉基因植物對冷和低溫脅迫的耐受性[32]。鹽、甘露醇、乙烯、IAA和ABA處理增強了馬鈴薯SbSAMS的表達水平，SbSAMS過表達擬南芥的乙烯積累增加，轉基因植株表現出較高的耐鹽性和抗旱性[33]。須芒草AvSAMS1在擬南芥中過量表達，通過使組蛋白H3(H3K4me3和H3K9me3)甲基化，提高了轉基因擬南芥對Al、Pb、Cu和Zn等脅迫的抗性[34]。以上研究表明，SAMS能夠調控植物體內多胺、乙烯、木質素等物質的合成和積累，來改變植物抵御逆境脅迫的能力。同時，SAMS通過參與DNA甲基化和組蛋白甲基化修飾也影響著植物的抗逆性。但這些SAMS參與的抗逆代謝通路之間是否存在偶聯目前尚不清楚。SAMS的抗逆功能在植物基因工程育種工作中存在潛在的應用前景，因此，SAMS具有較高的研究價值。為了深入了解SAMS基因在檉柳非生物脅迫應答中的功能，本研究利用熒光定量PCR技術分析了ThSAMS在NaCl、PEG和ABA處理下的表達情況。在地上部分組織中，ThSAMS基因的表達受NaCl和PEG的誘導，脅迫后基因表達量顯著上升，這與上述其它植物SAMS基因表達分析的研究結果一致。但是，在檉柳地下部分組織中，ThSAMS基因表達變化并不明顯，表明在脅迫條件下其表達具有一定的組織特異性。與NaCl和PEG脅迫下的結果不同，在外源ABA處理后，ThSAMS基因在檉柳地下部分組織中表達上調，而在地上部分組織中沒有變化。綜合上述結果，我們推測ThSAMS可能參與剛毛檉柳對高鹽和干旱的脅迫應答反應，其主要在檉柳的莖、葉組織中行使功能，且并不依賴ABA信號通路。本研究為進一步揭示ThSAMS基因在檉柳高鹽、干旱脅迫應答中的具體功能及作用機制奠定基礎。