糖蛋白組學(xué)技術(shù)在腎臟疾病的應(yīng)用

楊 旭 綜述 劉欣穎 審校

蛋白質(zhì)糖基化是重要的翻譯后修飾，人體有超過(guò)一半的蛋白質(zhì)需要糖基化修飾[1]，影響蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)，并且調(diào)控大部分細(xì)胞外活動(dòng)，包括細(xì)胞-細(xì)胞間或者細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。因此，蛋白質(zhì)糖基化在生命活動(dòng)過(guò)程中起重要調(diào)控作用。

糖蛋白是與寡糖鏈共價(jià)連接的蛋白質(zhì)。糖蛋白組學(xué)是大規(guī)模分離富集鑒定糖蛋白一門學(xué)科。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)合糖鏈不同，糖基化主要分為四種類型，分別是N-糖基化、O-糖基化、GPI錨定糖基化和C-糖基化。N-糖基化和O-糖基化最為常見(jiàn)。N-糖基化是指多肽鏈中的天冬酰胺(Asn)側(cè)鏈氨基酸殘基與N-糖鏈的N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)連接，而O-糖基化是多肽鏈通過(guò)N-乙酰半乳糖(N-acetylgalactosamine,GalNAc)與蛋白質(zhì)上的絲氨酸(Ser)或者蘇氨酸(Thr)側(cè)鏈羥基連接(圖1)。異常的糖基化過(guò)程與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有直接關(guān)聯(lián)，因此該技術(shù)將為腎臟疾病的研究提供新的技術(shù)平臺(tái)。目前學(xué)界對(duì)糖蛋白組檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及其在臨床應(yīng)用中認(rèn)識(shí)不足，故本文對(duì)此進(jìn)行綜述。

圖1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中N-糖基化N-連接糖蛋白是多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的加工修飾，最后形成復(fù)雜的天線結(jié)構(gòu)。O-糖基化則是在乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和β-N-乙酰氨基己糖苷酶(OGA)作用下直接修飾蛋白分子；LLO：脂質(zhì)連接低聚糖；OST：寡糖基轉(zhuǎn)移酶；GIsI：α-葡萄糖苷酶I；GIsIIα/β：α-葡萄糖苷酶IIα-β異二聚體；Bip:重鏈結(jié)合蛋白；Asn:天冬酰胺；Ser:絲氨酸；Thr:蘇氨酸

糖肽/糖蛋白富集的方法

生物樣品成分包括糖蛋白和非糖蛋白，低豐度和高豐度等。如何運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)這些生物樣品進(jìn)行檢測(cè)是糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究中首要問(wèn)題，所以在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前，首先需要對(duì)低豐度糖肽進(jìn)行分離和富集。目前報(bào)道的分離富集的方法包括：凝集素親和法、親水相互作用色譜法、肼化學(xué)富集法和硼酸法等。

凝集素親和法凝集素是一類能高度專一識(shí)別糖并與之高親和力可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)。凝集素親和法主要用于選擇性捕獲特定糖型，例如含有唾液酸和鹽藻糖的聚糖。因此基于凝集素的糖蛋白組學(xué)研究對(duì)象主要是含有鹽藻糖基化和唾液酸糖基化的糖蛋白。Waniwan等[2]將凝集素-磁性納米探針和HCD-CID-MS/MS耦合，成功揭示耐藥性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中具有更多的鹽藻糖基化和唾液酸化糖肽。雖然凝集素親和法操作簡(jiǎn)單，但是凝集素對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)識(shí)別具有選擇性，所以難以對(duì)整個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面精確地分析。

親水相互作用色譜法親水相互作用色譜法的機(jī)制是依靠糖鏈親水性的差異。親水性聚糖會(huì)吸附在形成穩(wěn)定富水層的極性材料表面，而親水性較低的肽段和鹽則保留在本體溶劑中被洗脫。一些親水性的材料如纖維素已經(jīng)被用來(lái)選擇性的富集N-連接聚糖。該方法操作簡(jiǎn)單，不破壞糖型，可以富集各種類型的糖肽，但是由于這是一種非特異性的吸附，不能夠?qū)⒂H水性非糖肽和糖肽完全區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此富集特異性并不理想。

肼化學(xué)富集法肼化學(xué)富集法首先由Zhang等[3]應(yīng)用于人血清蛋白和血漿膜蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。先利用高碘酸將聚乙二醇氧化產(chǎn)生醛基,再將醛基與載體上的肼化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)生成肼腙共價(jià)鍵，然后通過(guò)清洗去除非特異性吸附的糖肽。N-糖肽酶F(PNGaseF)會(huì)切割捕獲N-連接糖蛋白上天冬酰胺殘基和GlcNAc之間的糖苷鍵，然后通過(guò)質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定去糖基化糖肽。與親水相互作用色譜法相比，該方法特異性高，但是強(qiáng)氧化劑高碘酸除了氧化糖蛋白的聚乙二醇，也會(huì)氧化肽段上的其他基團(tuán)產(chǎn)生副反應(yīng)。

硼酸法硼酸法是利用硼酸基團(tuán)在堿性條件下可被羥基化，在酸性條件下反應(yīng)可逆向進(jìn)行的原理。硼酸法用于糖肽/糖蛋白富集具有高度特異性，但是當(dāng)利用硼酸法將糖肽從含有大量非糖肽的復(fù)雜樣品中分離出來(lái)時(shí)，可能會(huì)存在非糖肽物質(zhì)抑制糖肽結(jié)合的現(xiàn)象。而且如果樣品中的非糖類物質(zhì)具有和糖肽相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，同樣會(huì)發(fā)生反應(yīng)被捕獲[4]。Xiao等[5]通過(guò)硼酸法對(duì)酵母細(xì)胞和人體細(xì)胞中的糖蛋白進(jìn)行分析，成功在酵母中鑒定出234種O-連接糖蛋白，同時(shí)在人體細(xì)胞中也鑒定了1 127個(gè)蛋白上的2 710個(gè)N-糖基化位點(diǎn)?？傊摲椒ê?jiǎn)單快速，具有高度可重復(fù)性，而且可保持糖肽的完整，有利于鑒定糖基化位點(diǎn)和分析聚糖結(jié)構(gòu)。

其他方法近年來(lái)也有文獻(xiàn)報(bào)道另外兩種非常有效的糖肽/糖蛋白富集和分析方法。Woo等[6]首先提出利用同位素靶向糖蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合代謝標(biāo)記和同位素來(lái)分析糖蛋白。探針標(biāo)記的糖肽會(huì)在質(zhì)譜中呈現(xiàn)出獨(dú)特的同位素模式。Sun等[7]結(jié)合化學(xué)和酶促反應(yīng)，運(yùn)用NGAG(N-linked glycans and glycosite-containing peptides)方法靶向標(biāo)記N-糖肽，成功在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中鑒定出2 044種特異N-糖肽。NGAG還可定量檢測(cè)總蛋白和位點(diǎn)特異性聚糖中的糖蛋白的改變。

以上證據(jù)提示，四種主要的糖蛋白富集技術(shù)具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。凝集素親和法和親水相互作用色譜法對(duì)糖鏈識(shí)別的特異性不高，但是操作簡(jiǎn)單；肼化學(xué)富集法對(duì)糖肽富集具有高度特異性，但是可能會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)；而硼酸法也顯示出了巨大的應(yīng)用前景。因此，選取恰當(dāng)?shù)奶堑鞍赘患椒ㄊ呛罄m(xù)利用質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定糖蛋白位點(diǎn)、解析糖鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。

糖蛋白組學(xué)技術(shù)與腫瘤相關(guān)疾病

大量研究顯示異常的糖基化過(guò)程與腫瘤的轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。甲胎蛋白(AFP),前列腺特異抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)等糖蛋白已成為疾病篩查的常規(guī)指標(biāo)，也是評(píng)估預(yù)后的重要依據(jù)。AFP是一種分子量為70 kD的N-連接糖蛋白，大部分是由胚胎時(shí)期的肝臟和卵黃囊產(chǎn)生，小部分由胃腸道生成。血清中的AFP濃度在胚胎的第12周至第十六周達(dá)峰，隨后迅速下降，直至胎兒生后2周血清中只能檢測(cè)到微量AFP。正常人血清中AFP的水平應(yīng)<20 ng/ml。如果發(fā)現(xiàn)血清AFP>400 ng/ml且持續(xù)一個(gè)月，應(yīng)高度懷疑肝細(xì)胞癌可能。PSA是由前列腺腺泡和導(dǎo)管相連的上皮細(xì)胞分泌的N-連接糖蛋白。PSA產(chǎn)生之后主要存在于精液和前列腺中，血清中的PSA水平極低，當(dāng)前列腺結(jié)構(gòu)破壞，PSA釋放入血循環(huán)導(dǎo)致血清中PSA的水平異常升高。此時(shí)應(yīng)考慮前列腺惡性腫瘤可能。CEA是分子量為180 kD的糖蛋白，在成年人血清中含量低于2.5 ng/ml。CEA除了作為結(jié)、直腸癌的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，在胰腺癌和胃癌等其他胃腸道惡性腫瘤中也具有較低的特異性。糖蛋白組學(xué)技術(shù)已經(jīng)較多地運(yùn)用于癌癥的診斷治療和預(yù)后評(píng)估中，尋找癌癥相關(guān)的特異性糖基化位點(diǎn)一直是癌癥研究的熱點(diǎn)。

糖蛋白與腎臟疾病

IgA腎病(IgAN)IgAN是一種常見(jiàn)的慢性原發(fā)性腎小球疾病，預(yù)后較差，只有不到10%的患者能夠完全緩解，6%～43%的患者會(huì)在初次診斷后10～20年進(jìn)展為終末期腎病[8]。人類血清中的IgA主要是以單體形式存在，分為IgA1和IgA2兩種完全不同的亞型，其中IgA1約占90%[9]。IgA1與IgA2相比在重鏈上多一個(gè)獨(dú)特的鉸鏈區(qū)，該區(qū)具有多個(gè)絲氨酸或者蘇氨酸殘基，與GalNAc連接形成O-連接聚糖，然后分別在核心β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1GalT1)和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，將半乳糖(galactose,Gal)以β1，3鍵先與GalNAC結(jié)合生成Galβ1，3GalNAc,再以α-2,6鍵與GalNAC結(jié)合或者以α-2,3鍵與Gal結(jié)合形成更長(zhǎng)的糖鏈。若IgA1的GalNAC未與Gal連接則稱為半乳糖缺陷(Gal-deficient)。IgAN患者的一部分IgA1分子鉸鏈區(qū)O-聚糖就存在半乳糖缺陷，而且與正常IgA1相比，其IgA1鉸鏈區(qū)GalNAc的糖型分布更多[10]。這些變化會(huì)導(dǎo)致患者體內(nèi)產(chǎn)生末端帶有GalNAc的特異性抗原，再與機(jī)體內(nèi)針對(duì)半乳糖缺陷型的IgA1自身抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物沉積在腎小球中引起腎臟損傷[11]。Serino等[12]為了更好的了解IgAN中簇狀O-糖基化的過(guò)程以及起始酶在該過(guò)程中的作用，研究了GalNAc-T2對(duì)IgA1鉸鏈區(qū)的糖基化作用，證明了糖基化途徑多樣性和糖基化密度之間的相關(guān)性。因此，糖蛋白組學(xué)研究可幫助我們?cè)谔堑鞍讓用嫔细钊肓私釯gAN的發(fā)病機(jī)制，甚至尋找出疾病相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物。

糖尿病腎病(DN)DN是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，20%的糖尿病患者都合并DN[13-14]。腎臟是人體的排泄器官，附著在腎小球基底部的足細(xì)胞是血液濾過(guò)屏障的組成結(jié)構(gòu)，在阻止大分子物質(zhì)流失到尿液中的同時(shí)也參與調(diào)節(jié)水的重吸收過(guò)程。大部分參與這些過(guò)程的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面蛋白都會(huì)與天冬酰胺結(jié)合發(fā)生N-糖基化。已有研究表明在DN早期，細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)N-連接糖蛋白已經(jīng)發(fā)生形態(tài)上的變化[15]，但是對(duì)該種變化發(fā)生的機(jī)制和這些形態(tài)上的變化是否會(huì)引起糖蛋白豐度的變化尚知之甚少。Ravid等[16]利用凝集素親和層析法證明了二肽基肽酶4(DPP4)的異常糖基化與DN之間存在著實(shí)質(zhì)性的聯(lián)系。人源性DPP4是一種以二聚體形式存在的跨膜糖蛋白，廣泛分布在肝、腎、腸、脾等人體器官當(dāng)中。該作者還發(fā)現(xiàn)在疾病早期，鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠和對(duì)照動(dòng)物之間DPP4表達(dá)存在著顯著差異，但是在疾病的后期卻并沒(méi)有觀察到明顯的差異。他們應(yīng)用免疫沉淀法和凝集素法分析發(fā)現(xiàn)DPP4出現(xiàn)了異常的糖基化狀態(tài)。Bermingham等[17]發(fā)現(xiàn)1型糖尿病患者的血糖控制水平與血清當(dāng)中IgGN-聚糖的顯著變化有關(guān),但是并不能闡釋N-聚糖的異常糖基化與DN的因果關(guān)系。亮氨酸的α-2-糖蛋白1(LRG1)最近被發(fā)現(xiàn)與DN預(yù)后相關(guān)[18]。敲除LRG1顯著減少糖尿病引起的腎小球血管生成和足細(xì)胞丟失，延緩了糖尿病性腎小球病的發(fā)展，但是具體LRG1的糖基化過(guò)程是如何影響DN的預(yù)后仍待進(jìn)一步的探索。以上研究都表明DN存在著異常的糖基化，但是并不能定量測(cè)定這些異常的糖蛋白，也不能確定異常的糖基化位點(diǎn)。因此，確定異常糖基化具體位點(diǎn)和特異性疾病標(biāo)志物是目前研究的重要方向。

常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)ADPKD是最常見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，約占發(fā)達(dá)國(guó)家終末期腎病患者的5%～10%[19]。80%～85%的病例都存在16號(hào)染色體PKD1或者4號(hào)染色體上的PKD2突變。PKD1和PKD2分別編碼多囊蛋白1(polycystin-1)和polycystic-2,這兩種多囊蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致正常的腎臟結(jié)構(gòu)被無(wú)數(shù)小囊代替并逐漸導(dǎo)致腎衰竭。α3β1整合素受體是一種介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的異二聚體跨膜蛋白[20]。Zhang等[21]選取α3整聯(lián)蛋白的輕鏈部分，在小鼠模型中運(yùn)用基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)方法分析了從Pkd1-/-細(xì)胞和Pkd1+/+細(xì)胞內(nèi)分離出的α3整合素亞基上異常和正常的N-連接糖基化結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)與Pkd1-/-細(xì)胞相比，Pkd1+/+細(xì)胞在Asn-925和Asn-928這兩個(gè)糖基化位點(diǎn)上有相對(duì)分子質(zhì)量更高的聚糖結(jié)構(gòu)。而且也在Pkd1-/-細(xì)胞上觀察到了獨(dú)特的二唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)。多囊蛋白2是瞬時(shí)受體電位(TRP)通道超家族的成員，被歸類為瞬時(shí)受體電位通道多囊蛋白2(TRPP2)。在ADPKD患者中發(fā)現(xiàn)受體電位通道TRPP2被嚴(yán)重N-糖基化。Hofherr等[22]全面分析并確定了人類TRPP2中的五個(gè)異常的天冬酰胺糖基化位點(diǎn)：299、305、328、362和375，這些異常的糖基化會(huì)影響真核細(xì)胞中分泌蛋白和膜蛋白的穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致APDKD的發(fā)生。這些研究結(jié)果都表明異常的蛋白質(zhì)糖基化可能在ADPKD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。同樣ADPKD特異性糖基化位點(diǎn)仍不確定，有待于進(jìn)一步的研究和探索。

除上述腎臟疾病，糖蛋白組學(xué)技術(shù)在其他腎臟疾病中也有很多其他應(yīng)用。比如在腎細(xì)胞癌(RCC)中Zhang等[23]基于3-氨基苯基硼酸和唾液酸之間相互作用開(kāi)發(fā)新型阻抗式生物傳感器用于診斷腎細(xì)胞癌。唾液酸是黏蛋白、糖蛋白和糖脂中寡糖鏈的組成成分。而轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞通常表達(dá)高豐度富含唾液酸的糖蛋白。唾液酸的量會(huì)隨著腫瘤的惡化而急劇增加。硼酸鹽化合物3-氨基苯基硼酸(APBA)分子對(duì)唾液酸的結(jié)合力非常強(qiáng)，細(xì)胞傳感器靈敏度大大提高。這是一種新型、簡(jiǎn)便且無(wú)創(chuàng)的腎細(xì)胞癌檢測(cè)手段?？傊?，糖蛋白組學(xué)技術(shù)在腎臟疾病中顯示出了巨大的應(yīng)用前景。

小結(jié):(1)蛋白質(zhì)糖基化在生理與疾病過(guò)程中起重要的調(diào)控作用；(2)低豐度的糖蛋白和復(fù)雜的聚糖結(jié)構(gòu)是糖蛋白組學(xué)精準(zhǔn)檢測(cè)的難題；(3)凝集素親和法、親水相互作用色譜法、肼化學(xué)富集法、硼酸法糖蛋白分離富集技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，選取恰當(dāng)?shù)奶堑鞍赘患椒ㄊ呛罄m(xù)利用質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定糖蛋白位點(diǎn)、解析糖鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵；(4)糖蛋白組學(xué)檢測(cè)技術(shù)在腎臟疾病中的應(yīng)用，不僅將成為腎臟疾病的重要診斷手段，而且必將對(duì)腎臟病疾病發(fā)生、發(fā)展和機(jī)理研究起到重要地推動(dòng)作用。