模式識別受體的免疫調(diào)節(jié)作為限制流感策略研究進(jìn)展

宋 丹，孫欣榮

1．西安醫(yī)學(xué)院(西安710068)；2.西安市兒童醫(yī)院(西安710003)

1 介 紹

流行性感冒是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，可致較高的發(fā)病率和病死率。鑒于目前的疫苗和抗病毒藥物治療的局限性，預(yù)防性治療旨在增強多方面的先天免疫力。免疫調(diào)節(jié)策略用來增強對甲型流感病毒(IAV)感染的先天免疫力，以減少肺損傷，或提高疫苗接種的療效。模式識別受體(PRR)能夠識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)從而區(qū)分病原微生物與機體自身[1]，觸發(fā)這些受體引起的保護(hù)性反應(yīng)以誘導(dǎo)抗病毒宿主防御系統(tǒng)來提供立即的，短期的，以及持久的，特定的免疫。

2 模式識別受體

IAV被至少3個不同類別的PRR細(xì)胞識別，包括Toll 樣受體(TLR)，RIG-I樣受體(RLR)和具有核苷酸結(jié)合寡聚域的NOD 樣受體(NLR)。TLR是一種膜結(jié)合受體，為Ⅰ型跨膜蛋白，胞外區(qū)為富含亮氨酸的重復(fù)序列，胞內(nèi)區(qū)具有與Toll和白細(xì)胞介素1(IL-1)受體家族同源的結(jié)構(gòu)域TIR[2]。TLR配體包括廣泛的微生物組分，如脂質(zhì)和脂肽(TLR2/TLR1，TLR2/TLR6，TLR4)，蛋白質(zhì)(TLR5)和核酸(TLR3,7,8,9)。除了TLR3之外，大多數(shù)TLRs信號通過MyD88依賴的途徑來誘導(dǎo)促炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，包括I型干擾素，細(xì)胞因子，和共刺激分子。TLR3使用TRIF和不同的信號級聯(lián)激活促炎基因的轉(zhuǎn)錄。TLR的表達(dá)方式根據(jù)細(xì)胞類型不同而不同，TLR2、4在巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、DC中高表達(dá)。TLR7、9在漿細(xì)胞樣DC中高度表達(dá)。TLR的激活在抗菌和抗病毒免疫中都是重要的，TLR信號所需的蛋白質(zhì)突變導(dǎo)致免疫缺陷和廣泛的感染易感性增加。RLR是細(xì)胞內(nèi)PRR家族，可識別病毒來源的RNA來啟動先天性免疫信號級聯(lián)。 RLR在上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和一系列造血細(xì)胞中是至關(guān)重要的病毒感染的傳感器。它包括3名成員：RIG-I，MDA-5基因和LGP-2。 RIG-I識別5＇-三磷酸未加帽的ssRNA，這是許多病毒的共同特征，還可以識別短鏈dsRNA-這可以是病毒復(fù)制的副產(chǎn)物。MDA-5結(jié)合長鏈dsRNAs，這由病毒產(chǎn)生，但通常不在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。目前，關(guān)于LGP-2的知之甚少。RIG-1和MDA5 是細(xì)胞漿內(nèi)的主要抗病毒分子。NLR具有兩個亞類: 包括5個成員(NOD1-5)的 NOD家族和包括14個成員的NALP家族。NALP蛋白可通過形成復(fù)雜蛋白質(zhì)復(fù)合物-炎癥小體, 來活化促炎癥胱冬酶[3],來調(diào)節(jié)先天免疫，炎性小體的功能是上調(diào)IL-1β和IL-18的分泌。NLRP3是最有特點的炎癥復(fù)合體，并在對微生物(包括病毒)的刺激和細(xì)胞損傷的反應(yīng)上有關(guān)鍵作用，其包括NLRP3、接頭蛋白ASC、胱冬酶-1。炎性體激活需要兩個步驟，第一信號由TLR，IL-1受體和TNFR信號傳導(dǎo)介導(dǎo)并激活編碼NLRP3 pro-IL-1β和pro-IL-18的基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致IL-1β、IL-18和炎性小體的其他組分的合成。共生菌群激活信號1，并因此使宿主細(xì)胞對進(jìn)一步的細(xì)胞損傷或感染做出反應(yīng)。信號2是細(xì)胞壓力，這是通過改變離子通量、釋放線粒體ROS或能量代謝物、溶酶體蛋白酶來感知的，導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的裝配、胱冬酶1的激活和IL-1β 、IL-18的分泌。病毒蛋白和ssRNA以被表明激活炎性小體，因為它們干擾正常細(xì)胞功能的能力。

3 細(xì)菌的免疫調(diào)節(jié)作用

3.1 先天性免疫力限制IAV感染 氣道微生物群將有可能在氣道病原體調(diào)節(jié)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。用特定細(xì)菌定殖或感染可以限制IAV通過生產(chǎn)微生物產(chǎn)物直接感染。例如，由表皮葡萄球菌產(chǎn)生的一種巨大的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白被證明阻斷IAV的感染。此外，通過細(xì)菌產(chǎn)物的粗制混合物刺激先天性免疫，已被證明為限制流感病毒生長及死亡率的免疫調(diào)節(jié)策略，例如，鼻內(nèi)給予嗜血桿菌、流感裂解物，霍亂毒素，CpG DNA或修飾的來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素(LTK63)，對小鼠隨后的IAV感染有顯著的保護(hù)作用。

3.2 細(xì)菌源性的產(chǎn)物 預(yù)防和治療TLR2和TLR4是TLR 家族中研究最早也是目前研究最清楚的成員之一， 在 LPS 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起主要作用[4]。TLR2是革蘭陽性菌的主要識別受體，也能識別LPS并介導(dǎo)細(xì)胞LPS反應(yīng)[5]。鼻內(nèi)施用合成的TLR2激動劑，如Pam2Cys或Pam3CSK4已被報道會引發(fā)肺部的炎癥反應(yīng)和先天性反應(yīng)，保護(hù)其免受IAV感染，并減少了其在IAV感染小鼠中的傳播。這種保護(hù)的具體機制尚不清楚。

TLR4與細(xì)菌細(xì)胞壁的成分結(jié)合，或與天然TLR4配體如LPS、合成的激動劑如脂質(zhì)A模擬物結(jié)合。LPS刺激巨噬細(xì)胞后激活的SR-A可抑制TLR4誘導(dǎo)的細(xì)胞活化，從而降低炎癥因子的釋放[6]。另一方面，LPS通過激活的TLR4下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使巨噬細(xì)胞SR-A表達(dá)上調(diào)[7]。有報道稱鼻內(nèi)用LPS以TLR4依賴性的方式保護(hù)小鼠，這是致死流感感染前3d最有效的管理。FimH已被報道激活一系列先天性免疫細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，通過TLR4/MyD88依賴途徑以及重組FimH的陰道遞送與對抗小鼠生殖器HSV-2感染的TLR4-依賴的先天性保護(hù)有關(guān)。FimH介導(dǎo)的對IAV感染的保護(hù)反應(yīng)似乎是部分依賴于肺泡巨噬細(xì)胞。TLR4也在病毒感染巨噬細(xì)胞后激活PI3K-Akt 途徑，并誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生，可能增加抗病毒活性。因此，藥理學(xué)調(diào)節(jié)TLR4也可能通過作用于PIK3-Akt軸，促進(jìn)抗病毒活性。合成的脂質(zhì)A類似物，例如AGPs，解除了脂質(zhì)A免疫調(diào)節(jié)作用的毒性。當(dāng)在IAV感染之前48h施用，幾種類型的AGPs在小鼠中提供了對IAV誘導(dǎo)的體重減輕和依賴TLR4方式的疾病的強有力的保護(hù)。

此外，用TLR4拮抗劑Eritoran治療小鼠，減少了IAV誘導(dǎo)的肺病理改變和病毒復(fù)制，從而改善生存。有趣的是，Eritoran的療效也依賴于TLR2，提示相互作用的組合可能增加了在IAV感染期間的保護(hù)作用。

TLR9在漿細(xì)胞樣和其他DC亞群、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)表達(dá)，并結(jié)合細(xì)菌或病毒DNA中非甲基化的CpG二核苷酸，觸發(fā)先天反應(yīng)。用合成的非甲基化CpG、ODN或脂質(zhì)體包封的CpG ODN 在致死性IAV感染的前1～5d對小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)預(yù)處理，預(yù)防或減少IAV誘導(dǎo)的死亡率。有報告說，用TLR2/6激動劑(Pam2CSK4)或CpG ODN治療小鼠沒有保護(hù)其免受致死性IAV感染;然而，當(dāng)兩種治療同時應(yīng)用，存活率顯著增加。在有輕度，間歇性哮喘的人類受試者，特定CpG ODN的霧化被報道是安全和具有藥理活性的，在過敏原入侵期間誘導(dǎo)外周血和痰細(xì)胞的IFN-γ和ISGs[8]。但治療并不抑制變應(yīng)原誘導(dǎo)的癥狀，如支氣管收縮或嗜酸性粒細(xì)胞增多等。

3.3 細(xì)菌衍生物：擴大接種策略 細(xì)菌毒素衍生的疫苗接種的佐劑主要有：如霍亂毒素B或大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素、TLR4激動劑(如MPL)及其衍生物、TLR2激動劑Pam2Cys、TLR5激動劑(如鞭毛蛋白)、TLR9激動劑(如CpG)等。

為了減少細(xì)菌毒素來源的佐劑的毒性，突變毒素或低劑量的霍亂毒素B已被有效地使用在鼠模型中[9]；在SE中制定的合成MPL-衍生物GLA被證明增強重組H5亞基疫苗在健康成人中的免疫原性。GLA-SE激活髓系DC產(chǎn)生高水平的Th1-促細(xì)胞因子并且當(dāng)與病毒裂解疫苗結(jié)合時，通過抑制IL-10的產(chǎn)生，增強Th1細(xì)胞對流感的反應(yīng)[10]，暗示在現(xiàn)有流感疫苗中添加GLA-SE可能會改善功效。TLR2激動劑Pam2Cys可激活DC上表達(dá)的TLR2，誘導(dǎo)高水平的肽特異性CD8+T細(xì)胞并促進(jìn)在繼發(fā)的IAV感染后的病毒清除及增強抗原依賴性免疫；在流感感染的情況下，TLR5激動劑(如鞭毛蛋白)已被作為佐劑研究，來增強對滅活流感疫苗的反應(yīng)以及在新型亞單位疫苗的研制。

4 限制IAV感染的先天性免疫的病毒的免疫調(diào)節(jié)

宿主細(xì)胞主要通過細(xì)胞模式識別受體識別病毒RNA或DNA來感知和對抗IAV和其他病毒。感受核酸的內(nèi)體PRR包括TLR3、TLR7/8和TLR9，而RIG-I、線粒體抗病毒信號蛋白、炎性體是細(xì)胞質(zhì)PRR。由病毒或病毒產(chǎn)物觸發(fā)的這些PRRs，可引起I型IFN的誘導(dǎo)，ISG的調(diào)節(jié)和促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌;所有這些有助于有效的抗病毒反應(yīng)。

4.1 病毒來源的產(chǎn)物：預(yù)防和治療 TLR3是識別dsRNA的內(nèi)體PRR，誘導(dǎo)一系列有效的抗病毒反應(yīng)。Poly-IC是dsRNA合成的類似物，是最常用的實驗性TLR3激動劑。用Poly-IC對小鼠進(jìn)行預(yù)防性治療保護(hù)其免受隨后的IAV感染。當(dāng)通過鼻內(nèi)途徑輸送Poly-IC對于限制IAV誘導(dǎo)的疾病是有效的，沒有明顯的副作用，而全身性輸送導(dǎo)致輕度癥狀。

TLR7(小鼠和人)和TLR8(人類)在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上相關(guān)，內(nèi)體傳感器在漿細(xì)胞樣DCs和B細(xì)胞中表達(dá)，這可被病毒ssRNA、咪唑啉化合物、核苷類似物、siRNA刺激。在小鼠中用3M-011(一種合成的人類咪唑啉家族的TLR7/8配體)在IAV感染72h之前或感染6h后鼻內(nèi)給藥與肺病毒滴度急劇下降有關(guān)[11]。1V270的肺部給藥迅速誘導(dǎo)肺中先天性細(xì)胞因子、趨化因子，如肺CD11C+DCs的活化，為小鼠免受致命的IAV的攻擊提供保護(hù)[12]。

靶向IAV基因中的保守序列的siRNA已被用于抑制體外和體內(nèi)的病毒生長和IAV感染的動物模型中。改善IAV感染的能力可能是由于其誘導(dǎo)TLR7依賴性IFN-α應(yīng)答的能力。但是，有效的輸送到氣道是限制使用基于siRNA的方法來限制IAV誘導(dǎo)的疾病的主要因素，因為“裸”siRNA易在體內(nèi)降解。目前傳送載體包括在帶正電的聚合物或脂質(zhì)或脂質(zhì)體中包裹帶負(fù)電的siRNA、或?qū)iRNA與“類脂質(zhì)”絡(luò)合。盡管新型遞送系統(tǒng)有所發(fā)展，但siRNA被有效傳遞到上皮細(xì)胞-肺中IAV復(fù)制的主要部位，已被證明是困難的。

細(xì)胞溶質(zhì)RIG-I在啟動對抗病毒感染(通過識別攜帶5＇ppp或5＇pp的病毒RNA來激活I(lǐng)型IFN和促炎反應(yīng)來對抗病毒感染)的免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵的作用。早期研究表明體外轉(zhuǎn)錄5＇ppp ssRNA可能通過RIG-I誘導(dǎo)IFN。然而，近期的研究表明dsRNA的平端與5＇ppp直接相鄰，這表明在體外轉(zhuǎn)錄ssRNA也可能形成dsRNA產(chǎn)物來激活RIG-1。5＇ppp ssRNA還可以用作預(yù)防劑以限制H5N1的復(fù)制和體外IAV的大流行。在細(xì)胞培養(yǎng)物和小鼠中，給一個IAV特異性siRNA增加一個5＇ppp，可有效抑制IAV感染[13]。

4.2 病毒衍生物：接種策略 用poly-IC和滅活的流感病毒裂解疫苗鼻內(nèi)給藥，誘導(dǎo)針對同源和異源IAV毒株的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答，而沒有poly-IC的免疫在小鼠中誘導(dǎo)很小的反應(yīng)。Poly-IC和相關(guān)的dsRNA ONs在小鼠中也被用作佐劑來介導(dǎo)TLR3依賴的DCs的激活，產(chǎn)生特異性CTL 。此外，小鼠用重組IAV核蛋白在poly-IC或dsRNA ONs存在下的接種免疫，其存活率較只接受重組核蛋白高。在減毒流感病毒接種后24h鼻內(nèi)接種poly-IC，導(dǎo)致呼吸道DC功能增強，引發(fā)抗IAVCD8+T細(xì)胞，以及中和抗體的產(chǎn)生。有趣的是，Poly-IC只有在疫苗接種24h后接種才能提高疫苗接種的效果。如果疫苗和Poly-IC同時被接種則廢除功效。polyIC的佐劑對流感病毒裂解疫苗的效應(yīng)通過增加TLR2配體酵母聚糖進(jìn)一步增強。在體外，用poly-IC加酵母聚糖孵化DCs，導(dǎo)致有效的DC活化，并誘導(dǎo)一系列炎癥介質(zhì)，包括TNF-α，IL-6，IL-12，IFN-b和IL-10。

Poly-IC被批準(zhǔn)用于人體，其核糖核酸酶穩(wěn)定形式，poly-ICLC，現(xiàn)在處于癌癥治療的I期和II期試驗中。poly-ICLC本身療效差，但與載體抗原DC相結(jié)合，已經(jīng)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中獲得可觀的結(jié)果。在人類中，poly-ICLC治療增加了IFN-α的產(chǎn)生、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，并與激活DCs增強對腫瘤抗原的免疫反應(yīng)有關(guān)。PIKA是poly-IC的穩(wěn)定衍生物，已被申請作為對抗廣泛的Ags的疫苗的新佐劑 。在IAV的鼠標(biāo)模型中，PIKA鼻內(nèi)治療可能參與減少肺中病毒滴度[14]。

5 限制IAV感染的先天性免疫的炎性免疫調(diào)節(jié)

5.1 炎性體衍生物：預(yù)防和治療應(yīng)用 在IAV感染的情況下，NLRP3炎性體在 IAV感染后被激活并在IAV感染的小鼠中引發(fā)的早期保護(hù)性先天應(yīng)答上發(fā)揮重要作用。有研究表明，用NLRP3炎性小體的一種小分子抑制劑-MCC950治療IAV感染的小鼠 ，如果治療延遲到高峰(如感染后d3)，會起保護(hù)作用[15]。NLRP3炎性體的預(yù)防性配體有腸道微生物群、TLR配體(如LPS)。

5.2 炎癥反應(yīng)產(chǎn)物 明礬是第一批被開發(fā)的佐劑之一，也是少數(shù)人類準(zhǔn)許使用的佐劑之一。明礬導(dǎo)致溶酶體中斷。與單獨接種VLP的疫苗相比，VLP和明礬聯(lián)合使用可以增加H5N1病毒致死性感染后的老齡小鼠的生存率，暗示明礬可能是增加易感目標(biāo)群體，如老人的免疫應(yīng)答的一個有效的策略。

6 展 望

在人類中，PRR刺激配體(如LPS，poly-IC)或促炎細(xì)胞因子的應(yīng)用導(dǎo)致誘導(dǎo)“流感樣”癥狀，限制了它們在治療疾病中的應(yīng)用。類似地，siRNA據(jù)報導(dǎo)誘導(dǎo)高水平的促炎細(xì)胞因子，提出關(guān)于他們在治療病理狀態(tài)的系統(tǒng)性使用的考慮[16]。poly-IC和Pam2Cys因為他們作為疫苗佐劑的翻譯能力獲得了更多的關(guān)注。詳細(xì)了解免疫興奮劑的保護(hù)作用的機制及流感感染在不同宿主、不同條件或并發(fā)癥、不同病毒株中的復(fù)雜的炎癥反應(yīng)是需要的。同時，開發(fā)調(diào)節(jié)先天免疫力的療法必須考慮有效的病毒清除與誘導(dǎo)免疫病理和疾病之間的微妙的平衡。