透明質(zhì)酸酶的研究進(jìn)展

李 漫，劉建建，蘇江偉，張 燕，楊瑩瑩，吳萬(wàn)福，郭學(xué)平

（華熙生物科技股份有限公司，山東 濟(jì)南 260000）

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種廣泛存在于脊椎動(dòng)物組織細(xì)胞外基質(zhì)中的酸性黏多糖，在創(chuàng)傷愈合、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、調(diào)節(jié)電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮重要的作用。HA的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）大小影響其生理功能。目前，HA的降解主要有物理、化學(xué)、酶降解，通過(guò)物理或化學(xué)的方法反應(yīng)條件劇烈，往往會(huì)破壞單糖殘基結(jié)構(gòu)，且非特異性降解糖苷鍵，而酶可特異性降解糖苷鍵，反應(yīng)溫和。

透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase）是一類主要降解透明質(zhì)酸的糖苷酶。隨著人們對(duì)透明質(zhì)酸酶的生物學(xué)意義認(rèn)識(shí)不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明，其用途非常廣泛，鑒于國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，本文主要對(duì)其分類、應(yīng)用、不良反應(yīng)進(jìn)行綜述，以期為透明質(zhì)酸酶的研究提供交流。

1 透明質(zhì)酸酶的分類

根據(jù)氨基酸序列的同源性及來(lái)源、最適反應(yīng)pH值和透明質(zhì)酸酶作用機(jī)制，透明質(zhì)酸酶常被分為3類[1]。

根據(jù)目前的生產(chǎn)工藝及來(lái)源，分為動(dòng)物睪丸來(lái)源、動(dòng)物毒液、人工重組和微生物來(lái)源4大類，其中美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration， FDA）已批準(zhǔn)上市的藥品來(lái)自于動(dòng)物睪丸和人工重組，前者提取自牛、羊等動(dòng)物睪丸，后者則通過(guò)將人透明質(zhì)酸酶基因序列導(dǎo)入細(xì)胞系培養(yǎng)而獲得。微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶雖未作為藥品報(bào)批上市，但已在各類基礎(chǔ)研究中廣泛運(yùn)用。

1.1 動(dòng)物睪丸透明質(zhì)酸酶

哺乳動(dòng)物牛、羊睪丸是睪丸透明質(zhì)酸酶的主要來(lái)源。2004年至今，F(xiàn)DA相繼批準(zhǔn)了3種透明質(zhì)酸酶制劑：牛型透明質(zhì)酸酶、羊型透明質(zhì)酸酶和重組人型透明質(zhì)酸酶，適應(yīng)證包括與局部麻醉藥（主要是眼科用藥）聯(lián)用以增強(qiáng)藥物彌散，改善麻醉效果和維持時(shí)間及輔助皮下灌注。此外，國(guó)內(nèi)適應(yīng)證還包含骨關(guān)節(jié)炎的治療。雖未標(biāo)注用于透明質(zhì)酸填充術(shù)后的不良反應(yīng)治療，但其在透明質(zhì)酸填充術(shù)后所致不良反應(yīng)的治療中發(fā)揮了不可替代的作用。

1.2 人工重組透明質(zhì)酸酶

人類基因組包含6種透明質(zhì)酸酶，其中HYAL-1（HYAL，Gene of Hyaluronoglucosam inidase）、HYAL-2、HYAL-3、HYAL-4、HYAL-P1 和 PH20/SPAM1。目前關(guān)于人透明質(zhì)酸酶的研究主要集中在HYAL-1、HYAL-2及PH20[2]。

動(dòng)物組織提取的透明質(zhì)酸酶仍存在低純度、高免疫原性等問(wèn)題，限制了其癌癥治療中的研究和應(yīng)用。利用基因重組技術(shù)將人透明質(zhì)酸酶基因PH20整合到體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，成功表達(dá)了重組人透明質(zhì)酸酶rHuPH20（recombinant human hyaluronidase），純度高且降低了高免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。2005年12月，美國(guó)藥監(jiān)局批準(zhǔn)rHuPH20上市，適應(yīng)癥是作為佐劑增加其他注射藥物的分散和吸收[3]。但當(dāng)時(shí)的rHuPH20由于半衰期短，易被降解。聚乙二醇重組人透明質(zhì)酸酶PEGPH20的研制成功將rHuPH20的半衰期從不到3 min，延長(zhǎng)至10.3 h[4]。PEGPH20已于2016年上市，但國(guó)內(nèi)在人工重組透明質(zhì)酸酶制劑上仍為空白。2017年6月，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)rHuPH20與利妥昔單抗聯(lián)用于淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病的治療。目前，PEGPH20結(jié)合單抗藥物或其他抗腫瘤化療藥物的研究也有報(bào)道[5]。

國(guó)內(nèi)對(duì)于此酶的研究也從未停滯。姜廷等[6]探究rHuPH20促皮下注射藥物的擴(kuò)散能力，以臺(tái)盼藍(lán)模擬聯(lián)用藥物作為可視化示蹤劑，研究rHuPH20對(duì)皮下注射藥物擴(kuò)散速率的影響以及在替代藥物靜脈輸液方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

1.3 微生物透明質(zhì)酸酶

動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶是有限的，微生物發(fā)酵制備透明質(zhì)酸酶不受原料來(lái)源的限制。微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶雖暫未開發(fā)成藥品，但已應(yīng)用于寡聚透明質(zhì)酸和低分子透明質(zhì)酸的制備及各類基礎(chǔ)研究中。寡聚透明質(zhì)酸（Oligo-HA）是指Mr小于10×103的HA，低分子透明質(zhì)酸（LMW-HA）一般指Mr在104～106，均在醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

目前，市售的Oligo-HA或LMW-HA來(lái)源于化學(xué)法降解和酶解法，化學(xué)降解法反應(yīng)條件劇烈，對(duì)制得的產(chǎn)物生物活性有一定影響；酶解法條件溫和，不對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞。有報(bào)道將HA分離純化后加入透明質(zhì)酸酶降解，再經(jīng)膜過(guò)濾、乙醇沉淀、脫水干燥等，工藝復(fù)雜且微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液酶活性較低，發(fā)酵液最高酶活性約l02IU/ml，較難應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。郭學(xué)平等[7-9]發(fā)現(xiàn)了一種芽孢桿菌產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶，發(fā)酵液酶活性可達(dá)105IU/ml，純化后可以達(dá)到106～107IU/ml。利用此酶降解HA成功制備了Oligo-HA或LMW-HA。經(jīng)驗(yàn)證，此法生產(chǎn)的Oligo-HA或LMW-HA外用時(shí)可滲入皮膚表皮層，供給皮膚營(yíng)養(yǎng)和水分，防止皮膚老化，還能防止紫外線的傷害，修復(fù)曬傷的皮膚細(xì)胞，可用于化妝品中；口服時(shí)易于吸收，不僅可清除自由基，活化皮膚細(xì)胞，同時(shí)有良好的增強(qiáng)免疫功能和抗衰老功能，可用于食品和保健品中；此外，還有促血管生成、細(xì)胞免疫活化和促進(jìn)骨生成的作用，對(duì)治療細(xì)菌性角膜潰瘍也有良好的療效，可用于醫(yī)藥領(lǐng)域。此發(fā)明還提供了一種重組制備此透明質(zhì)酸酶的方法，利用此發(fā)明生產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶酶活性高、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性高，顯著降低生產(chǎn)成本，目前已實(shí)現(xiàn)了全球首家酶切法生產(chǎn)Oligo-HA及LMW-HA的產(chǎn)業(yè)化。

近年，學(xué)者對(duì)產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的微生物進(jìn)行了總結(jié)[10]。產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的菌株的研究多集中在節(jié)桿菌、巴斯德桿菌、獸疫鏈球菌、芽孢桿菌等[11-15]。為獲取編碼透明質(zhì)酸酶的基因序列，解析了一系列透明質(zhì)酸酶的氨基酸序列，研究相對(duì)透徹的是肺炎鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌分泌的透明質(zhì)酸酶[16-17]。有關(guān)芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的氨基酸序列也已被解析[7]。越來(lái)越多對(duì)細(xì)菌來(lái)源透明質(zhì)酸酶的結(jié)構(gòu)、機(jī)制、性質(zhì)等的基礎(chǔ)研究，為其下一步的研究和應(yīng)用提供了方向。

2 透明質(zhì)酸酶的臨床應(yīng)用

2.1 促進(jìn)其他注射藥物吸收和分布

最初，F(xiàn)DA批準(zhǔn)透明質(zhì)酸酶作為佐劑提高其他注射藥物的吸收和擴(kuò)散，皮下注射透明質(zhì)酸酶可降解皮下的透明質(zhì)酸，提高組織通透性，使皮下輸液的滲出液或局部蓄積的血液加快擴(kuò)散，降低局部藥物濃度，加速外滲藥物吸收，同時(shí)可減輕注射部位疼痛。

2.2 麻醉輔助劑

透明質(zhì)酸酶與局麻藥合用時(shí)，可加快麻醉的起效時(shí)間，減少局部浸潤(rùn)所致的腫脹；此外，還可能促進(jìn)局麻藥在體內(nèi)的擴(kuò)散和分布，增加局麻藥在體內(nèi)的吸收，從而增加全身反應(yīng)發(fā)生的幾率。

2.3 眼科方面的應(yīng)用

關(guān)于透明質(zhì)酸酶在眼科手術(shù)麻醉、白內(nèi)障、青光眼、玻璃體視網(wǎng)膜疾病等方面的應(yīng)用較多，總結(jié)為可減少局部麻醉藥物使用量，降低因此帶來(lái)的結(jié)膜水腫及眼壓升高的風(fēng)險(xiǎn)；可加速局麻藥物發(fā)揮效應(yīng)的時(shí)間，加大麻醉劑擴(kuò)散，增加手術(shù)安全性；白內(nèi)障手術(shù)時(shí)，使用HA保護(hù)角膜和眼內(nèi)組織，但術(shù)后常見(jiàn)暫時(shí)性眼壓升高，白內(nèi)障術(shù)中應(yīng)用透明質(zhì)酸酶，可預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生；在青光眼濾過(guò)術(shù)中穩(wěn)定眼壓；在玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)中，探討如何引導(dǎo)玻璃體液化，并較完全地后脫離以增加玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)安全性和成功率的研究已成為熱點(diǎn)，透明質(zhì)酸酶可使玻璃體液化，是輔助玻璃體切割最有應(yīng)用價(jià)值的酶之一；在其他眼病，如類固醇性高眼壓及甲狀腺相關(guān)眼病中，均有積極的治療作用[18]。透明質(zhì)酸酶一直是眼麻醉手術(shù)中常見(jiàn)的添加劑，但也有人質(zhì)疑其作為麻醉輔助劑在白內(nèi)障手術(shù)期間的使用的必要性，并評(píng)估了在不存在透明質(zhì)酸酶情況下麻醉結(jié)果的差異，提出為規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)，建議在白內(nèi)障手術(shù)進(jìn)行中不需要添加透明質(zhì)酸酶[19]。

2.4 醫(yī)學(xué)整形美容并發(fā)癥中的應(yīng)用

透明質(zhì)酸類注射填充劑在臨床上可用于皺紋、凹陷、萎縮等，是一種理想的軟組織填充劑。但當(dāng)HA填充不當(dāng)，則易引起炎性肉芽腫、皮下硬結(jié)、血管栓塞致組織壞死等[20]。透明質(zhì)酸酶作為特異性水解HA的藥物，在醫(yī)學(xué)整形美容方面主要用于治療注射HA術(shù)后并發(fā)癥，尤其是各類血管危象，血管危象最終導(dǎo)致的病理結(jié)果是微循環(huán)障礙，也就是血管栓塞。如HA一旦進(jìn)入眼動(dòng)脈，易造成視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈栓塞，眼球后注射透明質(zhì)酸酶，能降解血管內(nèi)及周圍組織的HA，臨床上也有成功的案例[21]。出現(xiàn)栓塞征兆，要第一時(shí)間合理處理，最重要在于快速診斷和即刻使用高劑量的透明質(zhì)酸酶[22]。Loh等[23]在發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)右眶下動(dòng)脈阻塞和皮膚壞死跡象時(shí)，立即實(shí)施高劑量透明質(zhì)酸酶脈沖用藥方案，成功阻止情況惡化，恢復(fù)了血管功能。

2.5 其他應(yīng)用

透明質(zhì)酸酶含量檢測(cè)有較高的靈敏度和特異性，可作為早期癌癥的診斷指標(biāo)[24]；透明質(zhì)酸酶可增強(qiáng)化療藥物的藥效，加速治療性抗體的吸收；促進(jìn)胰島素吸收；作用于神經(jīng)細(xì)胞，改善毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)等。王新宏等[25]探討鞘內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶治療結(jié)核性腦膜炎（TBM）療效，治療組加用鞘內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶治療，結(jié)果顯示治療組療效明顯優(yōu)于對(duì)照組。

此外，透明質(zhì)酸酶活性檢測(cè)可作為一種有效的判斷生育力的指標(biāo)[26]。精子頂體內(nèi)的透明質(zhì)酸酶在受精過(guò)程中起重要作用，影響男性生育力。馬曉萍等[27]分析88例精液標(biāo)本，透明質(zhì)酸酶的活性與精子P34H蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)性，男性不育患者精子P34H蛋白表達(dá)量減少，透明質(zhì)酸酶活性減弱。與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用也多有報(bào)道，崔穩(wěn)麗[28]對(duì)126例結(jié)腸炎所致的慢性盆腔疼痛患者使用透明質(zhì)酸酶聯(lián)合抗生素治療，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸酶能顯著提高抗生素對(duì)結(jié)腸炎所致盆腔疼痛的臨床療效。腫瘤疫苗一直是癌癥免疫治療研究中的熱點(diǎn)，將納米抗體與透明質(zhì)酸酶結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)抗腫瘤治療效率的增強(qiáng)，為癌癥免疫治療提供了一種簡(jiǎn)單而有效的策略[29]。新的用途也在不斷的被發(fā)現(xiàn)，Gomella[30]報(bào)道了第一例將透明質(zhì)酸酶用于腸造口脫垂，以幫助減少腸造口手術(shù)手動(dòng)按壓失敗后缺血性和阻塞性失禁。

3 透明質(zhì)酸酶的不良反應(yīng)

透明質(zhì)酸酶不良反應(yīng)發(fā)生率較低，不同的注射部位和注射劑量導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)不同。在對(duì)以往的透明質(zhì)酸酶相關(guān)文獻(xiàn)回顧總結(jié)中[31]，眼周麻醉時(shí)，注射局部過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率為0.05 %～0.69 %，主要癥狀有水腫、疼痛和瘙癢；施用高劑量透明質(zhì)酸酶（200 000 IU）時(shí)，過(guò)敏性并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)可升至31.3 %。Kim[32]報(bào)道了一例在矯正HA填充過(guò)量的注射部位的過(guò)敏反應(yīng)，注射部位紅斑和腫脹，這種副作用有別于常見(jiàn)的透明質(zhì)酸酶過(guò)敏反應(yīng)。張?jiān)牡萚33]探討透明質(zhì)酸酶治療HA過(guò)度填充引起填充物積貯而導(dǎo)致局部出現(xiàn)皮下腫塊或硬結(jié)的有效性及安全性，療效滿意，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)。不同生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶，也是過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的原因，如動(dòng)物組織提取來(lái)源相較于人工重組來(lái)源，雜蛋白含量高、免疫原性強(qiáng)，但目前臨床上使用的產(chǎn)品絕大多數(shù)是動(dòng)物組織來(lái)源。

為避免不良反應(yīng)發(fā)生，需考慮是否進(jìn)行過(guò)敏性皮試，透明質(zhì)酸酶注射液的配制、注射的層次、注射量、注射針頭的選擇，避免注射炎癥感染部位，與藥物聯(lián)用的注意事項(xiàng)、配伍禁忌、用藥史，注射后護(hù)理等問(wèn)題[20,33-34]。

4 展望

由于HA填充劑在醫(yī)療美容領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，透明質(zhì)酸酶在治療血管栓塞，尤其在栓塞致盲的案例中成功復(fù)明較罕見(jiàn)，臨床上透明質(zhì)酸酶如何與多種藥物聯(lián)合使用，如何處理此類狀況仍需研究。隨著對(duì)透明質(zhì)酸酶研究深入，透明質(zhì)酸酶在體內(nèi)參與了炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、毒素?cái)U(kuò)散、受精等，能特異性降解HA，因此開發(fā)酶抑制劑對(duì)于研發(fā)抗菌劑、抗腫瘤制劑、避孕藥等奠定基礎(chǔ)。此外，天然透明質(zhì)酸酶因其體內(nèi)循環(huán)半衰期短嚴(yán)重影響了藥效發(fā)揮，開發(fā)設(shè)計(jì)長(zhǎng)效透明質(zhì)酸酶也是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。