ω-3多不飽和脂肪酸對牙周炎SD大鼠骨細(xì)胞中TNF-α的影響

段金成1，徐麗麗，李 玲1， 公愛梅1， 劉 瑋1， 丁繼芬

(1 臨沂市人民醫(yī)院，山東 臨沂 276003；2 山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是人體必需脂肪酸，主要包括ω-6和ω-3系脂肪酸。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯(Eicosapntemacnioc acid，EPA) 是ω-3PUFAs中的兩個成員。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ω-3PUFAs可以調(diào)節(jié)機(jī)體的炎性反應(yīng)和免疫功能[1]，對人類的某些特異性疾病，尤其是一些以炎癥為主要致病機(jī)制的疾病有著較好的治療效果，如關(guān)節(jié)炎、牙周炎等[2-3]。本文采用實(shí)驗性牙周炎的大鼠模型，通過腹腔注射給與不同的實(shí)驗藥物，應(yīng)用免疫組化的技術(shù)方法評價PUFAs對大鼠牙周炎的治療作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗動物及分組 選用6～8周齡健康雄性SD大鼠30只(昆明醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)，體重180～220 g，將其按照隨機(jī)數(shù)字法分為3組：正常對照組(N組)、生理鹽水組(P組)、EPA組(E組)。分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一飲食攝水。

1.2牙周炎模型的建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在3%戊巴比妥納腹腔注射(1 ml/kg)全身麻醉下，對E、P組大鼠雙側(cè)上頜第2磨牙環(huán)牙頸部用5/0#慕斯絲線結(jié)扎，使絲線盡量位于齦溝內(nèi)，頰側(cè)打結(jié)。從結(jié)扎當(dāng)天開始，用菌液濃度為1.5×108CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis，P.g)隔日1次進(jìn)行接種，P.g菌液由云南省口腔醫(yī)院提供，每只大鼠口內(nèi)于齦溝內(nèi)種菌0.1 ml，連續(xù)用藥2周。N組大鼠不予任何處理。

1.3牙周炎模型的確立 隨機(jī)抽取P組大鼠，通過組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)牙齦結(jié)合上皮與牙體分離，牙周膠原纖維排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤，牙槽嵴頂吸收破壞，以此來確認(rèn)牙周炎動物模型的建立，見封三圖1。

1.4給藥方法 牙周炎模型成功后，N組不做任何處理；P組經(jīng)腹腔注射1 ml生理鹽水；E組給予EPA 1 ml(0.3 mg/ml)，每天1次。給藥4周。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1口腔檢查 給藥4周后，分別在3%戊巴比妥那全身麻醉下，檢測各組大鼠雙側(cè)第2磨牙牙周探診深度(Probing depth，PD)：采用自制大鼠牙周探針測量各組大鼠雙側(cè)上頜第2磨牙腭側(cè)近中、正中、遠(yuǎn)中3個位點(diǎn)的PD值，取兩側(cè)PD的均數(shù)作為該鼠的平均PD值。

1.5.2標(biāo)本采集 在麻醉狀態(tài)下，脫頸法處死大鼠，在上頜中線處將上頜骨分開，隨后將雙側(cè)上頜骨浸泡于4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，用于組織學(xué)的檢測。

1.5.3組織學(xué)檢測 取單側(cè)上頜骨，在0℃～4℃條件下置于4%多聚甲醛固定液固定24 h，15%EDTA脫鈣液脫鈣3～4周，每周更換脫鈣液2次，每日搖蕩脫鈣液1次，每次1 min，刀切法檢測脫鈣終點(diǎn)。系列乙醇脫水，二甲苯置換至石蠟包埋，近遠(yuǎn)中向連續(xù)5 μm厚石蠟切片，行TNF-α的免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1各組PD的比較 4周后，N組PD為(0.45±0.04)mm，P組為(0.82±0.08)mm，E組為(0.48±0.02)mm。3組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F=150.83，P<0.01)，兩兩比較顯示，P組與N、E組有統(tǒng)計學(xué)意義(q=20.32，22.11；P<0.05)，N組與E組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(q=1.79，P>0.05)。

2.2組織學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察，以TNF-α為第一抗體，陽性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)均被染成棕褐色或棕黃色，其余細(xì)胞胞漿均無棕色著色(見封三圖2a)，用PBS代替一抗作為陰性對照，陰性對照組所有的細(xì)胞胞漿均無棕色著色(見封三圖2b)。

2.2.1TNF-α的陽性表達(dá) 給藥4周后，炎癥區(qū)牙槽嵴頂處骨細(xì)胞中，P組陽性骨細(xì)胞表達(dá)較多，而且顏色較深，一般有12～16個表達(dá)的骨細(xì)胞；E組陽性骨細(xì)胞有少量表達(dá)，一般在5～7個左右(見封三圖3)。

2.2.2TNF-α陽性表達(dá)的光密度值變化 給藥4周后，各組大鼠炎癥區(qū)牙槽嵴頂處骨細(xì)胞中TNF-α陽性表達(dá)的光密度值，N組為(0.26±0.04)，P組為(0.65±0.06)，E組為(0.37±0.03)。3組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F=133.28，P<0.01)，兩兩比較顯示，P組與N、E組有統(tǒng)計學(xué)意義(q=19.64，20.34；P<0.05)，N組與E組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(q=0.70，P>0.05)。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，ω-3PUFAs具有抗炎功能和免疫調(diào)節(jié)作用，其作用方式主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及反應(yīng)活性、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和黏附分子的表達(dá)，其機(jī)制主要有：①抑制炎癥花生四烯酸類代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。EPA或DHA通過競爭脂質(zhì)過氧化酶(LPO)及環(huán)氧化酶(COX-1、2)減少來源于花生四烯酸的炎性遞質(zhì)的釋放。②增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[4]，抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用和黏附能力，同時增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞的功能[5]。③抑制核因子-κB(NF-κB)信號通路，降低促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的表達(dá)水平，從而影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6]。有研究表明，DHA或EPA與阿司匹林聯(lián)合使用可以在一定程度上改善牙周炎患者的臨床癥狀[7-8]。在本研究中，觀察到了EPA對牙周炎時牙周組織的炎癥有一定抑制作用，通過口腔臨床檢查、牙周PD及組織觀察結(jié)果均顯示：在相同的時間點(diǎn)，E組與P組相比較，牙周組織的炎癥有了較為明顯的改善。但其與阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用對牙周炎的治療效果還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗證實(shí)。

TNF-α在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，被稱為炎癥反應(yīng)的啟動因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)大量釋放。Sungurtekin等[9]研究證實(shí)，ω-3PUFAs可顯著降低促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的表達(dá)水平，從而達(dá)到抑制炎癥發(fā)生發(fā)展的作用。另外有研究表明，炎癥因子在骨吸收中有多重影響，其中TNF-α、IL-1、IL-8、IL-17 以及轉(zhuǎn)化生長因子可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，加重骨吸收的發(fā)生發(fā)展[10]。TNF-α還可以通過促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的巨噬細(xì)胞集落刺激因子和核因子-κB受體活化因子配體調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成，間接引起骨吸收[11]。而Flock等[12]研究證實(shí)，ω-3PUFAs能通過EPA競爭結(jié)合環(huán)氧化酶，從而抑制PGE誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α，減少骨吸收的發(fā)生。本研究免疫組化的結(jié)果顯示：給藥4周后，在牙槽骨組織炎癥區(qū)E組與N組的骨細(xì)胞中TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)的光密度值與P組相比較具有明顯差異。提示ω-3PUFAs可能是通過不同的途徑抑制了細(xì)胞因子TNF-α在骨細(xì)胞中的表達(dá)，從而進(jìn)一步減少了炎性介質(zhì)的釋放并影響了炎癥的發(fā)展。

綜上所述，ω-3PUFAs對動物實(shí)驗性牙周炎的臨床癥狀有一定的治療作用，并且對骨細(xì)胞中細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)有一定的抑制作用。由于上述觀點(diǎn)多源于動物實(shí)驗研究，人體與動物存在較大差別，臨床應(yīng)用較少，因此ω-3PUFAs對牙周病的作用機(jī)制及其治療效果仍有待于進(jìn)一步深入研究。