釀酒酵母中PiggyBac 轉(zhuǎn)座子篩選系統(tǒng)的構(gòu)建

周林希，柳藝石，趙神保，張慧杰，高曉冬，藤田盛久

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種可用于研究真核細(xì)胞系統(tǒng)中蛋白分泌和膜運(yùn)輸?shù)哪Ｊ缴颷1]。釀酒酵母具有穩(wěn)定維持單倍體形態(tài)的優(yōu)點(diǎn)，可以利用這一特性對酵母菌株進(jìn)行正向和反向的遺傳學(xué)分析。正向基因篩選經(jīng)常使用化學(xué)誘變或者物理誘變來獲取突變株，比如甲基磺酸乙酯和紫外誘變等[2-3]。鑒定導(dǎo)致突變的相關(guān)基因時需要表達(dá)質(zhì)?；匮a(bǔ)或者定位克隆，這些方法耗時長并且操作困難[4]。與傳統(tǒng)誘變方法相比，插入型誘變更具有優(yōu)勢。插入型誘變通過將一段DNA 插入基因，達(dá)到破壞基因功能的目的。引發(fā)突變的DNA 模塊上含有通用序列，可以用這個序列來檢測插入位點(diǎn)[5]，因此插入誘變能夠根據(jù)已知序列較容易地分析導(dǎo)致突變的相關(guān)基因。目前已有研究在釀酒酵母中使用基于轉(zhuǎn)座子的酵母突變基因組文庫進(jìn)行基因篩選[6]。在這個系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)座子在大腸桿菌中通過轉(zhuǎn)座酶被插入含有酵母基因組的質(zhì)粒文庫中。隨后將突變的質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)入酵母并替換染色體上的等位基因，由此引起突變[7]。盡管這一方法適用于在酵母體內(nèi)進(jìn)行遺傳篩選，但仍然存在一些問題，比如整合效率低，篩選覆蓋范圍有限以及突變文庫的保存比較困難。相比之下在酵母細(xì)胞內(nèi)使用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行突變比轉(zhuǎn)座子文庫更高效。酵母本身有一種內(nèi)源性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1 可以高效地進(jìn)行轉(zhuǎn)座，使用這種轉(zhuǎn)座子進(jìn)行插入型誘變的方法被稱為遺傳足跡法[8]。在這個系統(tǒng)中，大量的Ty1 轉(zhuǎn)座子在整個基因組范圍內(nèi)進(jìn)行插入突變。可以通過比較轉(zhuǎn)座子插入前后，細(xì)胞的生長狀況，來分析一些特殊的基因是否是細(xì)胞生長所必須的[9]。但是這個系統(tǒng)也存在一些缺陷，比如由于大量的Ty1 轉(zhuǎn)座子同時進(jìn)行插入突變，很難在全基因組范圍內(nèi)對于突變位點(diǎn)進(jìn)行精確的分析[8]。其他類型的轉(zhuǎn)座子如來源于鮭魚基因組的Sleeping Beauty（SB）轉(zhuǎn)座子，從初始位點(diǎn)移除并再插入其它位點(diǎn)后會在原始插入位點(diǎn)留下痕跡[10-12]，所以大多數(shù)的轉(zhuǎn)座子都不適用于在酵母體內(nèi)進(jìn)行突變。

PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子最初來源于鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）[13-14]。PB 轉(zhuǎn)座子通過一種“剪切和粘貼”機(jī)制進(jìn)行基因轉(zhuǎn)座[15]。在PB 轉(zhuǎn)座酶（PBase）的作用下，PB 轉(zhuǎn)座子從宿主DNA 位點(diǎn)被精準(zhǔn)地移除，并且這種移除不會留下任何痕跡[14-15]。同時被移除的PB 轉(zhuǎn)座子重新插入其他基因序列中的TTAA 位點(diǎn)。與其他轉(zhuǎn)座子方法相比，PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)效率更高，并且PB 在基因組中的插入位點(diǎn)分布比較均勻[16]。因此PB 轉(zhuǎn)座子可以作為一種篩選工具應(yīng)用于許多生物物種，包括原生動物，裂殖酵母，植物細(xì)胞，昆蟲和脊椎動物[17-18]。

本文在釀酒酵母中使用PB 轉(zhuǎn)座子構(gòu)建了一個篩選系統(tǒng)。本研究將3′PB-TEFp-HIS3-5′PB 轉(zhuǎn)座子插入酵母ADE2 基因編碼框中，PBase 基因則由另一個游離型質(zhì)粒上的半乳糖啟動子調(diào)控表達(dá)。在PB轉(zhuǎn)座酶的作用下，PB 轉(zhuǎn)座子可以從原始位點(diǎn)無痕移除并隨機(jī)插入新的基因位點(diǎn)。PB 轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座過程中保持單一拷貝數(shù)，在每個突變細(xì)胞中只有一個插入位點(diǎn)。使用限制性內(nèi)切酶酶切降解基因組，連接接頭并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，測序比對序列可快速檢測到PB 插入位點(diǎn)。通過對PB 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座效率進(jìn)行檢測，結(jié)果表明PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能很好地應(yīng)用于釀酒酵母菌株中，并可利用這一轉(zhuǎn)座工具進(jìn)行目的基因的篩選。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和酵母菌株

本文中所用到的質(zhì)粒如表1 所示。使用YW1和YW2 引物從pCMV-hyPBase 質(zhì)粒擴(kuò)增PBase 片段，將片段通過EcoR I 和Xho I 酶切位點(diǎn)插入pRS316-GAL1p 質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pRS316-GAL1p-PBase。使用YW5 和YW6 引物從pFA6a-HIS3MX6質(zhì)粒擴(kuò)增TEFp-HIS3 片段，將片段通過Nhe I 和Spe I 酶切位點(diǎn)插入pPB-R1R2-NP 質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pPB-TEFp-HIS3。

陳、莊二人詩歌高下之別的爭論發(fā)軔于二人詩歌特點(diǎn)尤其是莊昶詩歌用字特點(diǎn)的評論。成化二年（1466），陳獻(xiàn)章復(fù)游太學(xué)，與莊昶訂交并在詩學(xué)宗趣等方面開始趨于一致。二人對彼此詩歌特點(diǎn)互有點(diǎn)評，在給弟子講授詩法時，陳獻(xiàn)章常以莊昶詩歌為范，如批復(fù)弟子張詡詩歌時說：“概觀所論，多只從意上求，語句、聲調(diào)、體格尚欠工夫在。若論詩家，一齊要到。莊定山所以不可及者，用句、用字、用律極費(fèi)工夫?！保?］《批答張廷實(shí)詩箋》，75送別童子方祥慶時稱贊莊昶之詩，說自己“千煉不如莊定山”［6］《夜坐與童子方祥慶話別偶成》，546。陳獻(xiàn)章詩歌的特色，莊昶概括為“自然”，其《讀白沙先生詩集》云：

本文中所用釀酒酵母出發(fā)菌株為MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 BY4741，購買于Addgene。使用YW3 和YW4 引物從質(zhì)粒pPB-TEFp-HIS3 上擴(kuò)增3′PB-TEFp-HIS3-5′PB 片段。通過同源重組[19]，將3′PB-TEFp-HIS3-5′PB 轉(zhuǎn) 座 子 插 入 釀 酒 酵 母ADE2 基因編碼框，得到實(shí)驗(yàn)菌株MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ade2：：PB-HIS3 suc2Δ：：hphMX BY4741。

2）酵母基本培養(yǎng)基：SD（0.67%無氨基酵母氮源，2%葡萄糖以及需要的氨基酸），SG（0.67%無氨基酵母氮源，2%半乳糖以及需要的氨基酸）。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1）酵母完全培養(yǎng)基：YPAD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.003%腺嘌呤，2%葡萄糖）。

患者進(jìn)入高灌注和高濾過期通常在5年左右,40%~50%的患者在病程5~10年進(jìn)入運(yùn)動后微量蛋白尿的階段,糖尿病10~15年進(jìn)入持續(xù)微量蛋白尿階段,在病程15~25年時又有一半的患者進(jìn)入臨床蛋白尿期,然后逐步發(fā)展至終末期腎病。1型糖尿病發(fā)病時間相對明確,診斷5年后進(jìn)入每年的篩查,每年至少檢測微量蛋白尿。2型糖尿病起病相對隱匿,病程不明確,診斷之后就進(jìn)入每年的定期篩查。

學(xué)生是教育的主體，兒童是小學(xué)教育的主要參與者，戰(zhàn)時知識分子對兒童的成長也提出了種種建議，以使小學(xué)教育更好地適應(yīng)抗戰(zhàn)建國的需要。

研究中所用引物如表2 所示。

將質(zhì)粒pRS316-GAL1p-PBase 轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)菌株BY4741-ade2：：PB-HIS3-suc2Δ：：hphMX，得到篩選菌株。在尿嘧啶缺陷型葡萄糖選擇性培養(yǎng)基（SDUra）中接種篩選菌株，過夜培養(yǎng)。為使轉(zhuǎn)座酶有足夠的時間誘導(dǎo)PB 轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座，且使誘導(dǎo)后的酵母細(xì)胞仍處于對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)接0.025OD 細(xì)胞至25 mL 尿嘧啶缺陷型半乳糖選擇性培養(yǎng)基（SGUra），使起始OD 為0.001。30 ℃振蕩培養(yǎng)27 h 后，涂布至腺嘌呤和組氨酸缺陷型葡萄糖選擇性培養(yǎng)基（SD-Ade-His）。30 ℃靜置培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)明顯的酵母菌落，隨機(jī)挑取菌落并在含有5-氟乳清酸（5-FOA）的SD 培養(yǎng)基上再劃線，從而移除含有URA3 標(biāo)簽的PB 轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒，得到PB 插入型穩(wěn)定突變株。

SOB 培養(yǎng)基：2%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，0.05%（W/V）NaCl，2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2。

3）大腸培養(yǎng)基：2×YT/Amp 培養(yǎng)基：1.6%（W/V）胰蛋白胨，1%（W/V）酵母提取物，0.5%（W/V）NaCl。氨芐青霉素培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后的培養(yǎng)基中添加終濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素。

多模態(tài)隱喻觀認(rèn)為隱喻不只存在于語言中，還存在于其他媒介中，如聲音、音樂、色彩、線條等。“多模態(tài)隱喻”是指用兩種或兩種以上模態(tài)來體現(xiàn)源域和目標(biāo)域映射隱喻現(xiàn)象(Forceville＆Urios－Aparisi，2009)。多模態(tài)研究主要探討多種媒介下的圖像、音樂等非語言符號在表達(dá)意義時的互補(bǔ)性及規(guī)律性特征，探討模態(tài)和媒體的關(guān)系，以及第二外語課堂中多模態(tài)視覺和言語的協(xié)同性(Barthes 1977;Kress＆Van Leeuwen 2001;Royce 2002)。

SOC 培養(yǎng)基：1 L SOB 中添加10 mL 2 mol/L 葡萄糖溶液。

1.3 PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選方法

推薦理由:本書深度回顧了上海改革開放40年歷史進(jìn)程中的40個具有上海特色、全國影響，且涵蓋各歷史階段和各領(lǐng)域的重要事件，以講故事的形式，梳理背景、挖掘細(xì)節(jié)、分析意蘊(yùn)，生動展現(xiàn)上海波瀾壯闊、蕩氣回腸的改革開放歷程，立體刻畫上海“開放、創(chuàng)新、包容”的城市品格，揭示出改革開放何以成就上海。

1.4 巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證PB 插入位點(diǎn)

對于物理學(xué)科而言，我們學(xué)生糾錯更應(yīng)該關(guān)注于思維的過程，如力學(xué)問題的解決糾錯要從畫受力圖、運(yùn)動行程圖等入手.

1.5 生長曲線測定

已有研究報導(dǎo)PB 轉(zhuǎn)座子能在出芽酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)座[15]。其將PB 轉(zhuǎn)座子插入游離質(zhì)粒的URA3 編碼框中，用以分析PB 轉(zhuǎn)座活力。然而，在出芽酵母中使用PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行基因篩選還未有報導(dǎo)。為了在釀酒酵母中使用PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，本研究構(gòu)建了一個含有3’PB-TEFp-HIS3-5’PB 轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pPB-TEFp-HIS3，其中HIS3 基因由TEF 啟動子控制，位于兩段末端PB 反向重復(fù)序列之間（圖1）。以這個質(zhì)粒為模板，使用引物YW3 和YW4 擴(kuò)增PB 轉(zhuǎn)座子序列，通過同源重組技術(shù)，將PB 轉(zhuǎn)座子插入酵母ADE2 基因編碼框的TTAA 序列中（圖2）。同時構(gòu)建了表達(dá)PB 轉(zhuǎn)座酶（PBase）的質(zhì)粒，由GAL 啟動子調(diào)控PBase 的表達(dá)。

1.6 PB 轉(zhuǎn)座子移除率和再插入率計算

將篩選菌株接種于SG-Ura 液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)座酶在半乳糖啟動子誘導(dǎo)下表達(dá)，誘導(dǎo)PB 轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座。經(jīng)過一段時間誘導(dǎo)后，在3 種酵母基本培養(yǎng)基上分別涂布適量的酵母菌。SD 平板上生長的酵母菌包括所有未發(fā)生轉(zhuǎn)座及轉(zhuǎn)座子發(fā)生移除和再插入的菌株。當(dāng)PB 轉(zhuǎn)座子發(fā)生移除，離開原始插入位點(diǎn)ADE2 基因編碼框，這些酵母菌株能在腺嘌呤缺陷型葡萄糖選擇性培養(yǎng)基（SD-Ade）上生長。當(dāng)PB 轉(zhuǎn)座子發(fā)生移除并再插入新的基因位點(diǎn)時，這些酵母菌株能在SD-Ade-His 平板上生長。轉(zhuǎn)座子移除率及再插入率為

用酵母基因組DNA 純化試劑盒（上海生工）提取PB 突變株酵母基因組，樣品濃度大于2 μg。并使用Hae III（NEB，#R0108S）限制性內(nèi)切酶降解基因組DNA，37 ℃酶切反應(yīng)12～16 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，80 ℃反應(yīng)20 min 滅活Hae III 限制酶。使用梯度PCR 技術(shù)在95 ℃反應(yīng)5 min，之后每15 s 降溫1 ℃直至4 ℃，使接頭引物YW7 和YW8 形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。將處理后的接頭引物與降解的基因組DNA 在4 ℃條件下連接，反應(yīng)12～16 h。65 ℃加熱20 min 滅活T4 DNA 連接酶，將連接產(chǎn)物與溶膠液混合，使用柱式DNA 膠回收試劑盒（上海生工）純化連接產(chǎn)物。最終得到濃度為5～15 ng/μL 的DNA 產(chǎn)物。通過巢式PCR 技術(shù)來擴(kuò)增被PB 轉(zhuǎn)座子插入的基因片段。使用引物YW9 和YW10 進(jìn)行第一輪PCR，再用第1 輪PCR 的產(chǎn)物為模板，使用引物YW11 和YW12 進(jìn)行第2 輪巢式PCR。膠回收PCR 終產(chǎn)物，使用T4PNK 酶將擴(kuò)增的基因片段產(chǎn)物磷酸化。使用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工）純化磷酸化產(chǎn)物，之后將磷酸化產(chǎn)物與經(jīng)EcoRV 酶切并用堿性磷酸酶CIAP 處理后的載體pBluescript 相連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中培養(yǎng)以擴(kuò)增質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并送測序。根據(jù)測序結(jié)果，與NCBI 酵母基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，得到PB 插入位點(diǎn)的基因序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌株中構(gòu)建PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)

將質(zhì)粒pRS316-GAL1p-PBase 轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)菌株BY4741-ade2：：PB-HIS3-suc2Δ：：hphMX，得到篩選菌株。在SD-Ura 液體培養(yǎng)基中接種篩選菌株，30 ℃搖床過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接0.025OD 細(xì)胞至25 mL SG-Ura液體培養(yǎng)基，使起始OD 為0.001。分別選取0，7，14，24，27，30，34，38，49，55 h 作為取樣點(diǎn)。在OD660下測定培養(yǎng)液吸光度，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

圖1 PB轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the PB transposon

當(dāng)PB 轉(zhuǎn)座子插入ADE2 基因的編碼框后，ADE2 基因不能正常表達(dá)，在SD 平板上生長的釀酒酵母菌落會呈紅色。當(dāng)在含半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時PBase 被誘導(dǎo)表達(dá)，部分PB 轉(zhuǎn)座子可以從ADE2基因中移除，此時SD 平板上可以同時觀察到白色和紅色的菌落（表3 和圖3），其中白色酵母菌落中ADE2 基因可以正常表達(dá)。而在SD-Ade 平板上，只能觀察到白色的酵母菌落，說明3’PB-TEFp-HIS3-5’PB 轉(zhuǎn)座子從ADE2 基因編碼框移除。此外，由于其中一些白色酵母菌落中，被移除的3’PB-TEFp-HIS3-5’PB 轉(zhuǎn)座子又再插入到新的基因中，ADE2基因和HIS3 基因均可以正常表達(dá)，因此這些菌株還可以在SD-Ade-His 平板上生長（圖3）。這些結(jié)果說明誘導(dǎo)PBase 表達(dá)可使PB 轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座，并且通過在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，監(jiān)測轉(zhuǎn)座或突變狀態(tài)的酵母菌株十分簡便。證明研究中構(gòu)建的PB系統(tǒng)可以很好地應(yīng)用于釀酒酵母中。

圖2 釀酒酵母中PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Fig.2 PB transposon system in Saccharomyces cerevisiae

圖3 PB轉(zhuǎn)座子在釀酒酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)座Fig.3 Transposition of PB element in Saccharomyces cerevisiae

表3 菌株生長情況Table 3 Yeast cell growth condition

2.2 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中PB 移除率和再插入率

PB 轉(zhuǎn)座子可以在釀酒酵母菌株中靈活轉(zhuǎn)座，通過誘導(dǎo)PBase 表達(dá)，本研究進(jìn)一步檢測PB 轉(zhuǎn)座子被移除和再插入的效率。實(shí)驗(yàn)中分析了在SG-Ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母的生長曲線，以及3’PBTEFp-HIS3-5’PB 轉(zhuǎn)座子的移除率和再插入率（圖4）。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，取平均值。按照測定生長曲線的取樣點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)0，7，14，24，27，30，34，38，49 h，在每個時間點(diǎn)分別取300 個細(xì)胞涂布于SD 平板，SD-Ade 平板以及SD-Ade-His 平板。根據(jù)式（1）和式（2），計算轉(zhuǎn)座子移除率和再插入率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間增加，移除率持續(xù)上升（圖4（b））。當(dāng)PBase 誘導(dǎo)27 h 后，轉(zhuǎn)座子再插入率停止增加，之后一段時間內(nèi)再插入率出現(xiàn)下降，接著再逐漸增加（圖4（c））。作者推測已經(jīng)插入酵母基因組的轉(zhuǎn)座子在PBase 的作用下被再次從插入位點(diǎn)移除，導(dǎo)致再插入率出現(xiàn)下降。之后再次增加是因?yàn)楸辉俅我瞥霓D(zhuǎn)座子又被再次插入基因組，轉(zhuǎn)座子進(jìn)行二次轉(zhuǎn)座。根據(jù)曲線，當(dāng)PBase 誘導(dǎo)酵母生長27 h 時，移除率達(dá)到10.57%，再插入率達(dá)到2.59%。從酵母生長曲線可以看出，經(jīng)過27 h 誘導(dǎo)，酵母處于對數(shù)生長期，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且PB 轉(zhuǎn)座子未發(fā)生二次轉(zhuǎn)座。因此本研究可以選擇27 h 作為PB 轉(zhuǎn)座的誘變時間。

圖4 PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率Fig.4 Transposition efficiency of PB

2.3 轉(zhuǎn)座過程中PB 轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的檢測

根據(jù)PB 移除率和再插入率曲線，研究中選取27 h 作為菌株誘變時間。釀酒酵母中PBase 誘導(dǎo)PB轉(zhuǎn)座子發(fā)生插入突變后，作者在SD-Ade-His 平板上隨機(jī)挑取了PB 轉(zhuǎn)座子從原始位點(diǎn)移除并進(jìn)行再插入的43 個酵母菌落，提取每個菌株的基因組，用于檢查其中的PB 插入數(shù)以及插入基因位點(diǎn)。通過1.4 節(jié)中所述的巢式PCR 技術(shù)擴(kuò)增插入PB 轉(zhuǎn)座子的DNA 區(qū)域。核酸凝膠電泳結(jié)果顯示，從這些菌落基因組中可擴(kuò)增出多種不同大小的片段（圖5），說明PBase 誘導(dǎo)后PB 轉(zhuǎn)座子可再次隨機(jī)插入酵母基因組中。且每個基因組樣品均只能擴(kuò)增出一條DNA片段，說明PB 轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座過程中仍維持初始的單拷貝，不會發(fā)生復(fù)制。表4 列出了部分PB 轉(zhuǎn)座子插入的基因序列，其中近23%的PB 轉(zhuǎn)座子插入酵母基因編碼框中，影響基因功能正常表達(dá)，引起突變。且被PB 轉(zhuǎn)座子插入編碼框的8 個基因均為非必須基因，說明轉(zhuǎn)座子在誘變時更傾向插入非必須基因。其余77%的轉(zhuǎn)座子可插入基因啟動子區(qū)域或者終止子區(qū)域，通過影響基因表達(dá)量改變相應(yīng)性狀。在原始篩選菌株中，PB 轉(zhuǎn)座子位于第15 號染色體的ADE2 基因編碼框。經(jīng)過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座后，PB 轉(zhuǎn)座子可隨機(jī)插入酵母基因組其他染色體（表4）。這些結(jié)果說明使用本研究所構(gòu)建的PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行篩選時，在一個酵母菌株中只含有一個轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致的突變位點(diǎn)，且插入位點(diǎn)隨機(jī)，均勻分布于酵母基因組，并可快速檢測該插入基因，進(jìn)一步證明此系統(tǒng)可應(yīng)用于釀酒酵母菌株中的基因篩選。

圖5 PB插入位點(diǎn)擴(kuò)增片段Fig.5 Genomic amplified bands of PB insertion sites

表4 突變菌株中PB 插入位點(diǎn)Table 4 PB insertion sites in mutant strains

3 討論

來源于粉紋夜蛾的piggyBac 轉(zhuǎn)座子可以運(yùn)用在多種生物中，除了昆蟲細(xì)胞外，還可應(yīng)用于酵母，原生動物，植物和脊椎動物等[17]。PB 轉(zhuǎn)座子已被應(yīng)用為一種基因編輯方法，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因和基因突變。研究昆蟲和小鼠基因功能時，可使用PB 轉(zhuǎn)座子實(shí)現(xiàn)插入型突變[22-23]。已有研究報道運(yùn)用PB 轉(zhuǎn)座子在裂殖酵母中進(jìn)行基因篩選[24-25]。運(yùn)用PB轉(zhuǎn)座子和同屬PB家族來源于棕蝙蝠（Myotis lucifugus）的piggyBat 基因元件，可在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)體內(nèi)、外轉(zhuǎn)座[15，26]。此外，檢測PB 轉(zhuǎn)座子移除和插入的分析方法也簡便易行。然而，還沒有在釀酒酵母體內(nèi)用PB轉(zhuǎn)座子進(jìn)行目的基因篩選的報道。本研究在釀酒酵母中構(gòu)建了PB 轉(zhuǎn)座子篩選系統(tǒng)。首先將PB 轉(zhuǎn)座子插入釀酒酵母ADE2 基因編碼框，當(dāng)PB 轉(zhuǎn)座酶表達(dá)時，PB 轉(zhuǎn)座子從原始位點(diǎn)移除并再次插入基因組中的其他位置，發(fā)生轉(zhuǎn)座引起插入突變。作者隨機(jī)挑選了43 個被PB 轉(zhuǎn)座子插入突變的酵母單菌落，并檢測其基因組中PB 轉(zhuǎn)座子數(shù)目及插入位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有的酵母細(xì)胞只含有一個PB 插入位點(diǎn)且插入位點(diǎn)十分隨機(jī)。有研究表明，PB 轉(zhuǎn)座子在裂殖酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)座時，由于PB轉(zhuǎn)座發(fā)生在細(xì)胞分裂S期或者G2 期，8%的酵母細(xì)胞中PB 轉(zhuǎn)座子發(fā)生復(fù)制[25，27]。本研究構(gòu)建的系統(tǒng)中，原始PB 轉(zhuǎn)座子位于基因組中，在轉(zhuǎn)座過程中不會發(fā)生復(fù)制仍可維持單拷貝。由于在裂殖酵母的PB 系統(tǒng)中，PB 轉(zhuǎn)座子位于低拷貝的外源質(zhì)粒上，這一原始位點(diǎn)的差異很可能是造成PB 轉(zhuǎn)座子在兩個不同的菌株中拷貝數(shù)不同的原因。

利用本研究中構(gòu)建的PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)突變有以下優(yōu)勢：1）與傳統(tǒng)化學(xué)誘變相比，誘導(dǎo)PB轉(zhuǎn)座酶表達(dá)就可以使轉(zhuǎn)座發(fā)生，避免了化學(xué)誘變劑的使用，不會對細(xì)胞造成其他傷害。2）PB 轉(zhuǎn)座子在一個細(xì)胞基因組內(nèi)只有一個插入位點(diǎn)，突變基因單一有利于細(xì)胞突變型的鑒定和分析。3）PB 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的檢測通過PCR 技術(shù)和基因測序即可實(shí)現(xiàn)，簡便快速。而鑒定傳統(tǒng)誘變導(dǎo)致突變的相關(guān)基因需要使用文庫進(jìn)行質(zhì)?；匮a(bǔ)，耗時長并且操作復(fù)雜。4）與Sleeping beauty（SB）轉(zhuǎn)座子相比，PB 轉(zhuǎn)座子移除后在原始插入位點(diǎn)不留任何足跡，但SB 轉(zhuǎn)座子被移除后會在原始位點(diǎn)留下3 個堿基，產(chǎn)生移除痕跡[28]。5）在半乳糖啟動子的調(diào)控下，可以通過再次誘導(dǎo)表達(dá)PBase 轉(zhuǎn)座酶，使PB 轉(zhuǎn)座子從插入位點(diǎn)移除，回復(fù)突變。

4 結(jié)語

本研究中所構(gòu)建的釀酒酵母piggyBac 轉(zhuǎn)座子基因篩選系統(tǒng)，可有效應(yīng)用于釀酒酵母進(jìn)行相關(guān)基因篩選。后期可應(yīng)用該P(yáng)B 篩選系統(tǒng)對影響釀酒酵母中重要蛋白功能的基因進(jìn)行篩選。未來還可通過引入下代測序技術(shù)擴(kuò)大檢測范圍，在全基因組范圍內(nèi)驗(yàn)證突變位點(diǎn)。