酶標(biāo)儀法測定微孔板發(fā)酵液中林可霉素

余飛 秦艷飛 王洲 孫俊峰 張敏 薛正蓮,*

(1 安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，蕪湖 241000；2 新宇藥業(yè)股份有限公司，宿州 234000)

林可霉素屬于林可胺類抗生素[1]，對于革蘭陽性菌(藤黃八疊球菌、肺炎鏈球菌等)及支原體等引起的感染具有較好的治療效果，目前已成為臨床主要抗生素之一[2-5]。關(guān)于林可霉素的測定，近年來國內(nèi)外有膠體金免疫層析法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、流動注射-化學(xué)發(fā)光分析法、旋光法等[6]。但以上方法大多成本高、周期長、操作復(fù)雜，不宜用于大批量樣品的檢測。

酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)滿足吸光物質(zhì)濃度在一定波長下與吸光度成線性相關(guān)的規(guī)律，是實(shí)驗(yàn)室常用的設(shè)備，都適用于物質(zhì)的檢測定量分析[7-9]。但分光光度計(jì)相對于酶標(biāo)儀定量檢測物質(zhì)操作復(fù)雜，效率低，試劑用量大，尤其是大批量樣品的快速檢測[10]。

林可霉素是由林肯鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，菌種生產(chǎn)能力的提升主要通過誘變技術(shù)獲得，誘變所獲得的大量的突變株經(jīng)微孔板發(fā)酵后如何快速、準(zhǔn)確的測定發(fā)酵液中林可霉素含量也是制約高產(chǎn)菌株高通量選育的重要因素。目前關(guān)于酶標(biāo)儀法測定微孔板發(fā)酵液中林可霉素含量方面的研究尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過酶標(biāo)儀法測定微孔板發(fā)酵液中林可霉素的含量，并利用Origin 8.6軟件與分光光度計(jì)法進(jìn)行了擬合，顯示兩種方法具有很好的一致性，為后續(xù)高通量選育林可霉素高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀；常溫室壓等離子誘變系統(tǒng)(ARTP)，北京思清源生物科技有限公司；單道、八道手動可調(diào)移液器，Sartorius；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HTS-T008 Canvic甘薇深孔板搖床，上海甘薇生物科技有限公司。

1.2 藥品和試劑

林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品(含量為96.2%，批號：1604312x)，新宇藥業(yè)股份有限公司；氯化鈀(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；水為蒸餾水。

0.02 mol/L氯化鈀溶液：稱取氯化鈀0.3547g，用1mol/L鹽酸溶解并定容至100mL，避光保存。

5mg/mL林可霉素工作液(I)：稱取林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品500mg，加蒸餾水溶解，用容量瓶定容至100mL。

5mg/mL林可霉素工作液(II)：稱取林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品500mg，加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基溶解，用容量瓶定容至100mL；8000r/min離心5min，吸取上清液待用。

1.3 菌種

林肯鏈霉菌：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：淀粉20、豆粉20、葡萄糖15、硫酸銨1.5、碳酸鈣4、玉米漿30，pH7.0。115℃，滅菌25min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：淀粉20、葡萄糖90、豆粉20、氯化鈉4、硝酸鈉8、硫酸銨7、玉米漿3、碳酸鈣8、磷酸二氫鉀0.25，pH7.0。115℃，滅菌25min。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 檢測波長的選擇

吸取5mg/mL林可霉素工作液150μL置于1.5mL EP管中，加入0.02mol/L氯化鈀溶液150μL，用1mol/L鹽酸定容至1mL，放置30min，吸取反應(yīng)液100μL至酶標(biāo)板，以不含林可霉素同法配制的溶液作為空白對照，使用全波長酶標(biāo)儀在200～900nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行吸收圖譜掃描。

1.5.2 林可霉素測定原理及方法

實(shí)驗(yàn)原理：在酸性條件下林可霉素與氯化鈀能夠形成有色絡(luò)合物，隨著林可霉素濃度的增大該絡(luò)合物的顏色逐漸加深，在一定的波長下可以使用酶標(biāo)儀定量檢測林可霉素的濃度[11]。

分光光度計(jì)法：參考文獻(xiàn)[12]測定樣品中林可霉素含量。

酶標(biāo)儀法：吸取發(fā)酵液150μL，依次加入0.02mol/L氯化鈀溶液150μL，用1mol/L鹽酸定容至1mL，放置30min，吸取反應(yīng)液100μL至酶標(biāo)板，以不含林可霉素空白溶液為對照，在380nm波長處測定其吸光度。

1.5.3 0.02mol/L氯化鈀溶液添加量的影響

5mg/mL林可霉素工作液分別取50、100、150、200和250μL，0.02mol/L氯化鈀溶液取值為0、25、50、100、150、200、250、300和350μL，用1mol/L鹽酸定容至1mL，放置30min，吸取反應(yīng)液100μL至酶標(biāo)板，以不含林可霉素空白溶液為對照，在380nm波長處測定其吸光度。

1.5.4 1mol/L鹽酸添加量的影響

5mg/mL林可霉素工作液分別取50、150和250μL，加入0.02mol/L氯化鈀溶液150μL，分別用0、0.5、1、1.5和2mol/L鹽酸定容至1mL，放置30min，吸取反應(yīng)液100μL至酶標(biāo)板，以不含林可霉素空白溶液為對照，在380nm波長處測定其吸光度。

1.5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別吸取用蒸餾水和發(fā)酵培養(yǎng)基制備的5mg/mL林可霉素工作液(I、II)50、100、150、200和250μL，按優(yōu)化后的方法在380nm波長下酶標(biāo)儀檢測吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線1、2。比較標(biāo)準(zhǔn)曲線1和2差異。

1.5.6 精密度試驗(yàn)

取已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液，分為2份，分別加入5mg/mL林可霉素工作液75和225μL，制備待測溶液，按優(yōu)化后的方法在380nm波長下酶標(biāo)儀檢測吸光度值，計(jì)算林可霉素含量。

1.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取5mg/mL林可霉素工作液150μL，置于1.5mL EP管中，按優(yōu)化后的方法，放置0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0h，在380nm波長處測定其吸光度。

1.5.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液，分為5份，分別加入5mg/mL林可霉素工作液25、75、125、175和225μL，制備待測溶液，按優(yōu)化后的方法在380nm波長下酶標(biāo)儀檢測吸光度值，計(jì)算回收率。

1.5.9 兩種方法的擬合驗(yàn)證

按優(yōu)化后的方法在380nm下，分別使用酶標(biāo)儀和紫外可見分光光度計(jì)測定由ARTP誘變所獲得的25株突變株經(jīng)48孔板發(fā)酵后其中的林可霉素含量，并用Origin 8.6軟件對兩種方法進(jìn)行擬合分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

按方法“1.5.1”項(xiàng)所測得的結(jié)果見圖1。由圖1可見，林可霉素與氯化鈀形成的絡(luò)合物在380nm波長處有最大吸收，故選擇380nm為檢測波長。

2.2 氯化鈀溶液添加量的影響

按方法“1.5.3”項(xiàng)所測得的結(jié)果見圖2。如圖2所示，當(dāng)林可霉素濃度為250～1250μg/mL時，A值隨著氯化鈀溶液量的增加而遞增，當(dāng)氯化鈀溶液的添加量達(dá)到150μL時，A值達(dá)到最大，繼續(xù)增加氯化鈀溶液的量，A值保持不變，因此當(dāng)林可霉素濃度為250～1250μg/mL時，實(shí)驗(yàn)確定添加0.02mol/L氯化鈀溶液150μL。

圖1 林可霉素紫外吸收圖譜Fig.1 UV absorption spectra of lincomycin

圖2 氯化鈀溶液添加量對吸光度的影響Fig.2 The in fluence of palladium chloride on absorbance

2.3 鹽酸添加濃度的影響

按方法“1.5.4”所測得的結(jié)果見圖3。如圖3所示，含相同濃度林可霉素的反應(yīng)體系中，反應(yīng)后的吸光度隨著鹽酸添加濃度的增加而增大，當(dāng)鹽酸添加濃度為1mol/L時，吸光度達(dá)到最大，繼續(xù)增大鹽酸添加濃度，吸光度幾乎保持不變，因此在反應(yīng)體系中可直接用1mol/L鹽酸定容。

圖3 鹽酸添加濃度對吸光度的影響Fig.3 The in fluence of hydrochloric acid on absorbance

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按方法“1.5.5”繪制林可霉素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線1和2，結(jié)果見圖4。由標(biāo)準(zhǔn)曲線1和2可知，林可霉素的濃度在250～1250μg/mL范圍內(nèi)，測定的吸光度與濃度線性關(guān)系良好，可以用于林可霉素濃度的測定；且由表1可知，含相同濃度林可霉素的水溶液與培養(yǎng)基溶液，其A380差值均小于0.1，表明培養(yǎng)基成分干擾較小。

2.5 精密度試驗(yàn)

按方法“1.5.6”所測得的精密度結(jié)果見表2。由表2可知，各組在低濃度和高濃度的RSD均小于0.5%，表明該方法測定林可霉素含量精密度高。

圖4 林可霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線1與2對比Fig.4 Comparison of lincomycin standard curve 1 and 2

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線1與2差異比較Tab. 1 Comparison of lincomycin standard curve 1 and 2

表2 精密度試驗(yàn)Tab. 2 Accuracy examinations

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按方法“1.5.7”項(xiàng)所測得的穩(wěn)定性結(jié)果見表3。從表3可知，林可霉素工作液在3.0h內(nèi)吸光度基本保持不變，穩(wěn)定性良好。

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

按方法“1.5.8”項(xiàng)所測得的回收率結(jié)果見表4。從表4可知，平均回收率為96.84%，RSD為0.91%。結(jié)果表明，采用酶標(biāo)儀法測定林可霉素加樣回收率較高。

表3 林可霉素工作液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 The stability test of lincomycin working solution

表4 加標(biāo)回收率Tab. 4 Recoveries of spiked sample

2.8 擬合曲線的建立

按“1.5.9”項(xiàng)優(yōu)化后的方法在380nm下，分別使用酶標(biāo)儀和紫外可見分光光度計(jì)測定25株突變株孔板發(fā)酵液中林可霉素的含量，并利用Origin 8.6軟件驗(yàn)證兩種方法的相關(guān)性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶標(biāo)儀法與分光光度計(jì)法的擬合曲線Fig.5 Thefitting curve of the enzyme-labelling and spectrophotometer measuring instrument

相關(guān)強(qiáng)度由相關(guān)系數(shù)的絕對值決定，相關(guān)系數(shù)的正負(fù)系數(shù)是相關(guān)方向。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)家提出了相關(guān)性強(qiáng)度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將R2=0.7000作為一個較高的相關(guān)關(guān)系[13]。由圖5可知，擬合曲線的R2=0.9551，表明酶標(biāo)儀法與分光光度計(jì)法具有很好的正相關(guān)性，可以利用酶標(biāo)儀法快速、高效的測定較多發(fā)酵樣品中林可霉素的含量。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)儀法檢測微孔板發(fā)酵液中林可霉素的含量并優(yōu)化了該方法的主要影響因素，同時檢測了該方法的精密度，結(jié)果顯示該方法對于檢測微孔板發(fā)酵液中林可霉素的含量具有很好的可靠性；本實(shí)驗(yàn)還利用Origin 8.6軟件對酶標(biāo)儀法與分光光度計(jì)法測定發(fā)酵液中林可霉素的含量進(jìn)行曲線擬合，顯示兩種方法具有很好的相關(guān)性；酶標(biāo)儀法可以用于大批量樣品的快速檢測，為后續(xù)高通量選育林可霉素高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。