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    加替沙星和司帕沙星的光動力抗菌研究

    2019-01-30 06:49:20李圩田王佳雯洪閣毛麗娜劉天軍
    中國抗生素雜志 2019年1期
    關(guān)鍵詞:喹諾酮孵育波長

    李圩田 王佳雯 洪閣 毛麗娜 劉天軍,*

    (1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所,天津 300192;2 天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193)

    光動力抗菌化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)[1]是一種新型的物理化學(xué)細(xì)菌滅活方法,目前已經(jīng)成為針對細(xì)菌、真菌和病毒感染特別是耐藥菌感染最有前途的新的治療方式之一[2-4],其關(guān)鍵是光敏劑。光敏劑[5]是一類具有光吸收能力強(qiáng)、較高的三線態(tài)轉(zhuǎn)移效率,可與氧通過能量轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生活性氧的化合物。它可以選擇性地富集在特定的組織,在可見光或紫外光的激發(fā)下,產(chǎn)生光動力殺傷作用,從而起到殺菌的功效。并非所有的光敏劑具有抗菌活性,只有光敏劑進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部才能通過光動力殺菌。喹諾酮類藥物[6-8]作為抗菌藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,它的抗菌機(jī)制是通過選擇性地抑制細(xì)菌DNA促旋酶起到抑菌殺菌作用,然而臨床數(shù)據(jù)揭示其抗菌效果的同時其光敏毒副作用常被提及,那么喹諾酮類藥物是否真的有光敏抗菌活性?若有將會是一件好事,尤其在細(xì)菌耐藥性[9-12]的報道日益增多的今天。本文將以臨床用藥GFLX和SPFX為例探索喹諾酮類化合物的光敏抗菌活性。

    1 實驗部分

    1.1 材料與試劑

    GFLX購于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司;SPFX購于源葉生物公司,以上化合物純度均≥98%;二甲基亞砜購于Sigma(美國);胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂均購于Oxoid(英國);氯化鈉購于天津市江天化工技術(shù)有限責(zé)任公司,肉湯培養(yǎng)基用相應(yīng)試劑由本實驗室配制。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    超凈工作臺(SW-CJ-IFD蘇州);激光器(7404 Intense,美國);Maisheng Dc Power Supply(MP6010D,中國);多功能酶標(biāo)儀(Thermo 3001,美國);離心機(jī)(MIRRO22,英國);Millipore 純水儀(Mili-Q Biocel,美國);細(xì)菌培養(yǎng)箱(SANY,日本);立式高溫高壓滅菌鍋(MJ-78A 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司);恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-103B,上海智誠)。

    1.3 實驗菌株

    本實驗所用MRSA(臨床分離菌株)作為革蘭陽性菌的代表,P. aeruginosa(臨床分離菌株),E. coli(臨床分離提取)作為革蘭陰性菌的代表,均來自解放軍304醫(yī)院。

    1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)

    1.4.1 液體培養(yǎng)基的配置

    蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、氯化鈉5g、蒸餾水500mL攪拌溶解,經(jīng)121℃高壓滅菌30min后,在0~4℃冷暗處備用。

    1.4.2 固體培養(yǎng)基配置

    瓊脂粉7.5g、蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、氯化鈉5g、蒸餾水500mL攪拌溶解經(jīng)121℃高壓滅菌30min后,放冷后,在無菌超凈工作臺上,將混合溶液倒入固體培養(yǎng)基,每個培養(yǎng)基大約是15~20mL,使之均勻分布,待冷卻后,將其放入冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 喹諾酮類化合物的的紫外吸光譜研究

    分別移取GFLX、SPFX的母液50μL置于不同的5mL容量瓶中,各自用0.01mol/L的鹽酸溶液定容至5mL并超聲分散,分別得到相應(yīng)濃度為0.01mmol/L的GFLX、SPFX化合物待測液。各待測液室溫靜置,在波長200~700nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描,并選擇其合適的光照波長。

    1.6 照射光波長的影響

    光源:650nm激光器, 450nm LED,365nm LED,白光來源于日光燈。實驗前所有光源的光功率經(jīng)過功率計核準(zhǔn)。用LB液體培養(yǎng)基,通過二倍濃度稀釋法將藥物配置成相應(yīng)梯度濃度,37℃下與菌液(106CFU/mL)在暗處孵育30min,然后用不同波長的光照射(650nm、450nm、365nm,白光),光照功率均為1.5mW,光照時間30min作為光毒組(暗毒組不進(jìn)行光照),通過測定GFLX、SPFX化合物的MIC與MBC,評價其光動力抗菌活性與有效工作波長。

    首先,在37℃無菌搖床條件下避光孵育30min,然后在相應(yīng)光照條件下光照30min(暗毒組,不進(jìn)行光照)。然后,分別吸取100μL該96孔微量測試板中不同梯度濃度藥物和細(xì)菌的混合液,將混合液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。隨后,將LB固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱條件下避光孵育,24h后評估,菌落數(shù)與對照組相比明顯減少且空白組沒有菌落生長為MIC,菌落個數(shù)小于等于5的為MBC。MIC、MBC的數(shù)值越小說明藥物的抗菌活性越好。

    MIC和MBC的測量方法具體如下:以GFLX為例子。首先在96孔平底板中,分別向每個孔中加入180μL不同梯度濃度的GFLX和20μL的MRSA并混合均勻??瞻捉M為200μL的液體培養(yǎng)基,對照組為180μL的LB液體培養(yǎng)基和20μL的MRSA混合液,進(jìn)行了3組獨立實驗。首先,在37℃無菌搖床條件下避光孵育30min,然后在相應(yīng)光照條件下光照30min(暗毒組,不進(jìn)行光照)。然后,分別吸取100μL該96孔微量測試板中不同梯度濃度藥物和細(xì)菌的混合液,將混合液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。隨后,將LB固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱條件下避光孵育,24h后評估,菌落數(shù)與對照組相比明顯減少且空白組沒有菌落生長為MIC,菌落個數(shù)小于等于5的為MBC。MIC、MBC的數(shù)值越小說明藥物的抗菌活性越好。

    1.7 SPFX、GFLX單線態(tài)氧的測定

    據(jù)文獻(xiàn)報道[13-15],喹諾酮類化合物可以產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì),包括1O2、O2-、OH-等其中單線態(tài)氧在人體中有非常重要的化學(xué)反應(yīng)活性。我們基于文獻(xiàn)方法[16-18],以1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)作為單線態(tài)氧捕獲劑,測定了SPFX、GFLX在的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。

    具體步驟為:(1)分別配置好0.02mmol/L DPBF和相應(yīng)藥物;(2)將配置好的藥物(100μL)和DPBF(100μL)混合,并設(shè)計兩個對照組;(3)光照單獨對DPBF的消耗影響及對藥物的影響,以及光照對DPBF與藥物混合溶劑影響;(4)檢測不同光照時間對DPBF在410nm處吸收光度值影響。

    1.8 光照功率的影響

    1.8.1 GFLX抗菌MIC、MBC值的能量依賴性

    用LB液體培養(yǎng)基,通過二倍濃度稀釋法將藥物配置成相應(yīng)梯度濃度,37℃下與菌液(106CFU/mL)暗孵育30min,選用450nm的光,在1.5、3、4.5和6mW等不同功率下,分別光照30min,測定GFLX的MIC與MBC,評價喹諾酮類化合物的光動力抗菌活性,選擇合適的光照功率。

    1.8.2 GFLX在MIC值處不同光能量密度對MRSA的PACT作用

    取對數(shù)生長期的MRSA細(xì)菌,進(jìn)行離心,并用PBS洗菌,然后重懸細(xì)菌,用紫外分光光度計測定其A值,直到A600=0.7,然后稀釋菌液10倍,取稀釋的菌液100μL,和配置好的GFLX溶液100μL,使得混合后藥物濃度為0.62μg/mL。37℃下,在96孔板暗孵育30min。用450nm LED燈照射,光照能量密度分別為1、2、4、6和8J/cm2,然后分別吸取不同能量密度下的藥物與菌液混合液,進(jìn)行10倍梯度稀釋,分別取稀釋度為10-4、10-5、10-6和10-7的藥物與菌液的混合液,并迅速涂固體培養(yǎng)基,每個梯度下涂3塊板,37℃烘箱下培養(yǎng),24h后菌落計數(shù)。來表征不同激光能量密度對MRSA的PACT作用。

    1.9 GFLX、SPFX對3T3細(xì)胞毒性

    據(jù)文獻(xiàn)報道[19],研究GFLX、SPFX對3T3細(xì)胞毒性是非常有意義的,因此收集對數(shù)生長期的3T3細(xì)胞,在DMEM(含10%的血清)培養(yǎng)液中以1×104個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;隨后吸出培養(yǎng)液,分別將不同濃度的GFLX和SPFX加入到每孔中,于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min。隨后將其分組進(jìn)行光毒性與暗毒性研究。光照組采用波長為650nm的光(P=2.3mW、30min、4J/cm)照射96孔板30min;暗毒組在相同條件下避光30min;隨后將光毒性與暗毒性的細(xì)胞96孔板分別置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。然后每孔中加入50μL MTT溶液(1mg/mL),于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中作用4h。除去上清液,每孔中加入DMSO溶液150μL,震蕩搖勻,通過酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測各孔吸光度(A)值。3T3細(xì)胞存活率按以下公式計算:細(xì)胞的存活率(%)=給藥組A值/對照組的A值×100%。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 GFLX、SPFX的紫外吸光譜研究

    圖1給出了GFLX、SPFX的吸收光譜,它們在275~300nm處有很強(qiáng)的吸收峰,GFLX在374nm處也有一個較強(qiáng)的紫外吸收峰。全波長光譜對GFLX、SPFX在光照波長選擇上有一定的指導(dǎo)作用,因此,在“2.2”項中,本文探討了365、450、650nm、白光及暗毒組等不同波長條件下GFLX、SPFX的抗菌活性。

    2.2 GFLX、SPFX在不同波長光照射下的MIC、MBC值

    圖1 GFLX、SPFX紫外吸收圖譜Fig.1 GFLX, SPFX UV absorption spectrum

    由于SPFX藥物在365nm有較強(qiáng)的吸收,本研究探討了SPFX在365nm的光動力滅菌活性,結(jié)果表明在365nm光的照下空白對照組的A600=0.4,而暗毒組的A600=0.7,說明365nm處光照已經(jīng)具有殺菌作用。紫外光(200~400nm)可以獨立滅菌,同時對細(xì)胞也具有一定的殺傷作用,在此區(qū)間進(jìn)行研究意義不大,因此我們的研究選取可見光區(qū),包括藍(lán)光(450nm),紅光(650nm)以及白光(長波混合光)進(jìn)行研究,盡管在此區(qū)間GFLX與SPFX的吸收光子能力較弱且相互間有差異,這會致使其光動力抗菌活性的差異,但研究結(jié)果具有一定的借鑒意義。

    本文探討了450nm、650nm和白光等不同光照條件下,SPFX、GFLX對MRSA、P. aeruginosa、E.coli的抗菌活性(表1~2),結(jié)果表明,在光照條件下,喹諾酮的抗菌活性的確有一定程度的提高,遠(yuǎn)優(yōu)于暗毒組;且用不同波長的光照射,對于同一種細(xì)菌其MIC/MBC值均有一定的差別。表1說明GFLX在450nm的光照下其抗菌活性略優(yōu)于其它光照條件下。由于GFLX為第四代喹諾酮類抗菌藥物,為新一代抗菌喹諾酮藥物。因此,本文選擇450nm處光照條件下進(jìn)行下近一步深入研究。

    2.3 GFLX、SPFX單線態(tài)氧測定

    圖2表明,伴隨著光照時間的延長,光照對DPBF的影響與光照對藥物SPFX、GFLX產(chǎn)生單線態(tài)氧對DPBF的影響趨勢一樣,說明了光照SPFX、GFLX產(chǎn)生較弱的單線態(tài)氧。這與表1~2的實驗結(jié)果一致,即光照可以增加喹諾酮藥物的抗菌活性,但提升有限。

    2.4 GFLX抗菌MIC、MBC的值的能量依賴性

    表1 GFLX在不同波長下的抗菌MIC、MBC的值/(μg/mL)Tab. 1 Antibacterial MIC and MBC values of GFLX at different wavelengths/(μg/mL)

    表2 SPFX在不同波長下的抗菌MIC、MBC的值/(μg/mL)Tab. 2 Antibacterial MIC and MBC values of SPFX at different wavelengths/(μg/mL)

    圖2 DPBF作為單線態(tài)氧捕獲劑在不同溶液狀態(tài)下隨時間變化圖Fig.2 Graph of DPBF as a singlet oxygen trap over time in different solution states

    表3 GFLX在450nm波長下的抗菌MIC和MBC(μg/mL)Tab. 3 Antibacterial MIC and MBC of GFLX at 450nm wavelength(μg/mL)

    圖3 GFLX在450 nm波長下光穩(wěn)定性研究Fig.3 Photostability study of GFLX at 450nm wavelength

    表3是GFLX在450nm光照射下對于3種細(xì)菌的MIC、MBC隨著光照能量的變化,結(jié)果表明隨著光照能量的增大。對于革蘭陽性菌MRSA和革蘭陰性菌E. coli,其MIC、MBC值都有一定程度的增大,對于革蘭陰性菌P. aeruginosa,MIC值略有增加,而MBC總體減小。這與強(qiáng)光敏抗菌藥物的行為有很大差異。這種差異可能源于GFLX的濃度減少,然而圖3表明GFLX在12J/cm2以內(nèi)照射光譜變化不大,對于光照保持良好的穩(wěn)定性,并無光分解,因而藥物濃度相對穩(wěn)定。因而本文認(rèn)為MIC和MBC的反常變化源于喹諾酮類藥物弱的光敏抗菌活性以及光照引起細(xì)菌培養(yǎng)液的溫度少幅度提升帶來細(xì)菌的增殖,這進(jìn)一步表明GFLX不適合光敏抗菌用。

    2.5 GFLX在MIC值處不同激光能量密度對MRSA的PACT作用結(jié)果

    進(jìn)一步探究光能量密度對于細(xì)菌的菌落數(shù)量的影響,圖4說明了能量密度由2~4J/cm2光照后,細(xì)菌存活數(shù)量迅速減少,起到了強(qiáng)烈的光動力抗菌活性;隨著能量密度的增大,在能量密度為4J/cm2,細(xì)菌的菌落數(shù)保持一定的數(shù)量基本不在減少,這一說明喹諾酮類藥物的光動力滅菌效能不高,盡管臨床上這類藥物有一定的光敏毒副作用,還不足以用于臨床殺菌。

    2.6 SPFX、GFLX對3T3細(xì)胞毒性

    圖5的MTT結(jié)果表明,當(dāng)GFLX、SPFX藥物濃度小于20μg/mL,光照對3T3細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性,且光照組與暗毒組沒有明顯的差異,而藥物的抗菌MIC、MBC值遠(yuǎn)小于20μg/mL,因此,在此條件下光動力抗菌是安全的。

    圖4 不同光照能量密度對MRSA的PACT作用Fig.4 PACT effects of different light energy densities on MRSA

    圖5 GFLX、SPFX對3T3細(xì)胞毒性圖Fig.5 GFLX and SPFX to 3T3 cytotoxicity

    3 結(jié)論

    通過SPFX,GFLX對MRSA、P.aeruginosa、E. coli光動力研究,對比了不同光照條件與暗毒組抗菌活性結(jié)果,得出光動力手段可以一定程度上增加GFLX和SPFX的抗菌活性,但提升有限,在此區(qū)間其光敏毒副作用有限,這類藥物不會傷及細(xì)胞,因而喹諾酮類藥物在臨床上不足以作為光敏抗菌藥物使用,相對安全。

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