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    滲透壓對林可霉素發(fā)酵效價影響的研究

    2024-03-31 13:10:08陳東郭佳馬思麗
    當代化工研究 2024年4期
    關鍵詞:林可霉素甜菜堿滲透壓

    *陳東 郭佳 馬思麗

    (寧夏泰益欣生物科技股份有限公司 寧夏 750205)

    林可霉素(Lincomycin)是一種林可胺類抗生素,是由林可鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。1962年,Mason等人從美國林肯市的土壤中發(fā)現(xiàn)了一種放線菌,并從該菌中分離得到了林可霉素。由于林可霉素對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性球菌及厭氧菌具有良好的抗性,因此在臨床治療中被廣泛應用[1]。

    林可霉素是由甲硫林可胺與丙基脯氨酸通過肽鍵鏈接而成的,包括林可霉素A、林可霉素B、林可霉素C、林可霉素D、林可霉素S和林可霉素K等,其化學結構式如圖1和表1所示。通常所說的林可霉素是指林可霉素A,其分子式為C18H34N2O6S,分子量為406.56。林可霉素A具有良好的抗菌效果且毒性較低,而林可霉素B因有較大毒性且抗菌活性低,因此常被用作評價林可霉素原料藥質量的一項重要指標[2]。

    表1 林可霉素組分結構一覽表

    表2 實驗儀器

    圖1 林可霉素結構圖

    目前國內外關于提高林可霉素A產(chǎn)量及降低林可霉素B含量的相關報道中,主要研究集中于培養(yǎng)基優(yōu)化,包括在發(fā)酵過程中直接添加前體、氨基酸、甲基化試劑等[3],但通過添加鹽調節(jié)滲透壓是否會提高林可霉素A產(chǎn)量及降低林可霉素B含量的報道相對較少。本研究通過添加不同質量分數(shù)的NaCl(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%)調節(jié)發(fā)酵液滲透壓,測定林可霉素A和林可霉素B效價,探究滲透壓對林可霉素發(fā)酵的影響,并在最適滲透壓條件下比較了甘油、脯氨酸和甜菜堿三種滲透壓保護劑對林可霉素效價的影響,以期確定提高林可霉素A效價及降低林可霉素B效價的最適滲透壓范圍和最適滲透壓保護劑及其質量分數(shù),為林可霉素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

    1.儀器與試劑

    (1)試劑

    葡萄糖、玉米漿、有機硅消泡劑、聚醚類消泡劑,均為工業(yè)級,國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、硫酸銨、氯化鈉,均為分析純,上海凌峰化學試劑有限公司;碳酸鈣,分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司;甘油,分析純,上海泰坦科技股份有限公司;甜菜堿、脯氨酸,均為分析純,Sigma;黃豆餅粉,工業(yè)級,實驗室自備。

    (2)儀器設備

    2.材料與方法

    (1)實驗材料

    林可鏈霉菌菌種由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

    (2)實驗方法

    高效液相色譜法(HPLC)測定林可霉素A與林可霉素B效價。

    3.結果與分析

    (1)滲透壓對林可霉素發(fā)酵的影響

    在生物發(fā)酵過程中,菌體會受到各種因素的刺激,如氧化還原、營養(yǎng)物質饑餓、高溫、低溫等,這些因素會影響菌體的生長、生產(chǎn)以及代謝過程[4]。已有研究顯示,一些與滲透響應有關的產(chǎn)物,若將培養(yǎng)基的滲透壓調至合適區(qū)間,則有助于目的產(chǎn)物的積累。目前相關研究主要是通過向發(fā)酵液中添加一定質量分數(shù)的NaCl、KCl和葡萄糖調控滲透壓。本研究是以NaCl為滲透壓調節(jié)劑,探究滲透壓對林可霉素發(fā)酵的影響。

    NaCl初始添加質量分數(shù)為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%,并進行10天的發(fā)酵,結果如表3所示,隨著NaCl質量分數(shù)的增加,發(fā)酵液滲透壓也逐漸增大,這說明滲透壓與鈉離子質量分數(shù)成正比。在NaCl質量分數(shù)為0~1.0%時,隨著滲透壓的增大,林可霉素A的效價逐漸上升,林可霉素B的效價逐漸下降,在NaCl質量分數(shù)為1.0%~2.5%時,隨著滲透壓的增大,林可霉素A的效價逐漸下降,林可霉素B的效價逐漸上升。因此,在NaCl質量分數(shù)為1.0%時(滲透壓1.082 Osmol/kg)效果最好,林可霉素A效價達到最大值11426μg/mL,較對照組10461μg/mL提高了9.22%,林可霉素B的效價達到最小值16μg/mL,較對照組26μg/mL降低了38.46%,在后續(xù)實驗中以1.0% NaCl作為滲透壓調節(jié)劑的最適添加質量分數(shù)。

    表3 不同質量分數(shù)的NaCl對林可霉素發(fā)酵的影響

    (2)滲透壓保護劑的選擇

    滲透壓保護劑是一種相容性溶劑,能有效保護微生物在極端滲透壓環(huán)境中膜的完整性和細胞結構的穩(wěn)定性,保證微生物在極端滲透壓環(huán)境中也能存活[5]。在高滲環(huán)境中,微生物可以通過滲透壓應激響應在細胞內合成滲透壓保護劑,也可以從環(huán)境中攝取部分滲透壓保護劑,使微生物細胞內外滲透壓達到平衡[6]。為了降低林可鏈霉菌在高滲環(huán)境中的不適,本研究分別向發(fā)酵液中添加了甘油、脯氨酸和甜菜堿這三種常見的滲透壓保護劑,并分析比較了這三種滲透壓保護劑對林可霉素A和林可霉素B效價的影響。

    甘油對林可霉素效價影響的結果如圖2所示,林可霉素A的效價隨甘油質量分數(shù)的增大呈先上升后下降的趨勢,在甘油質量分數(shù)為0.5%時,林可霉素A的效價最高為11978μg/mL,較CK組(10461μg/mL)提高了14.50%,較1.0% NaCl組(11426μg/mL)提高了4.83%,林可霉素B的效價隨甘油質量分數(shù)的增大呈先下降后上升的趨勢,在甘油質量分數(shù)為0.5%時,林可霉素B的效價最低為12μg/mL,較CK組(26μg/mL)降低了53.85%,較1.0% NaCl組(16μg/mL)降低了25.00%。上述結果表明0.5%甘油對提高林可霉素A產(chǎn)量和降低林可霉素B含量效果最優(yōu)。

    圖2 不同質量分數(shù)的甘油作為滲透壓保護劑對林可霉素發(fā)酵的影響

    脯氨酸是一種非常重要的胞內可溶性物質,除了在胞內自身合成外,還可以從外界環(huán)境中獲取,其生理功能主要包括增加細胞蛋白質和膜的穩(wěn)定性,作為共同氮源或碳源進入細胞代謝以及作為抵御外界高滲環(huán)境[7],因此選用脯氨酸作為林可霉素發(fā)酵過程中的滲透壓保護劑,研究其對林可霉素A和林可霉素B效價的影響,結果如圖3所示,林可霉素A的效價隨脯氨酸質量分數(shù)的增加呈先上升后下降的趨勢,在脯氨酸質量分數(shù)為0.25%時,林可霉素A的效價最大為12123μg/mL,較CK組(10461μg/mL)提高了15.89%,較1.0% NaCl組(11426μg/mL)提高了6.10%,林可霉素B效價隨脯氨酸質量分數(shù)增加呈先下降后上升的趨勢,在脯氨酸質量分數(shù)為0.25%時,林可霉素B的效價最小為11μg/mL,較CK組(26μg/mL)下降了57.69%,較1.0% NaCl組(16μg/mL)降低了36.36%,上述結果表明0.25%脯氨酸對提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量效果最優(yōu)。

    圖3 不同質量分數(shù)的脯氨酸作為滲透壓保護劑對林可霉素發(fā)酵的影響

    甜菜堿是一種氨基酸甲基取代物,存在于幾乎所有微生物體內且滲透效能很好,因此是常用的一種滲透壓保護劑[8]。結果如圖4所示,隨著甜菜堿質量分數(shù)的升高林可霉素A的效價呈先上升后下降的趨勢,在甜菜堿質量分數(shù)為0.25%時,林可霉素A的效價最高為11997μg/mL,較CK組(10461μg/mL)提高了14.68%,較1.0% NaCl組(11426μg/mL)提高了5.00%,林可霉素B的效價隨甜菜堿質量分數(shù)的增加呈先下降后上升的趨勢,在甜菜堿質量分數(shù)為0.25%時,林可霉素B效價最低為12μg/mL,較CK組(26μg/mL)降低了53.85%,較1.0% NaCl組(16μg/mL)降低了25.00%,上述結果表明0.25%甜菜堿對提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量效果最優(yōu)。

    圖4 不同質量分數(shù)的甜菜堿作為滲透壓保護劑對林可霉素發(fā)酵的影響

    4.結論

    本文以NaCl為滲透壓調節(jié)劑研究滲透壓對林可霉素發(fā)酵的影響,并在最適滲透壓條件下分析了甘油、脯氨酸和甜菜堿三種滲透壓保護劑對林可霉素效價的影響。結果表明,隨NaCl質量分數(shù)的增加,滲透壓逐漸增大,表明滲透壓與鈉離子質量分數(shù)成正比;林可霉素A的效價隨滲透壓的增大呈先上升后下降的趨勢,林可霉素B的效價隨滲透壓的增大呈先下降后上升的趨勢,且在滲透壓為1.082 Osmol/kg(1.0% NaCl)時,林可霉素A效價最高,林可霉素B效價最低。因此,以1.0% NaCl作為滲透壓保護劑的篩選條件,篩選最適滲透壓保護劑及質量分數(shù),發(fā)現(xiàn)在甘油質量分數(shù)為0.5%時林可霉素A效價顯著高于對照組,林可霉素B效價顯著低于對照組,脯氨酸和甜菜堿都是在0.25%時林可霉素A效價顯著高于對照組,林可霉素B效價顯著低于對照組。因此在適宜質量分數(shù)下三種滲透壓保護劑都可以有效提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量,且比較發(fā)現(xiàn)0.25%脯氨酸>0.25%甜菜堿>0.5%甘油。綜上所述,在1.0% NaCl+0.25%脯氨酸時可以有效提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量。

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