南豆腐加工過程中品質(zhì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化

趙 雷，朱 杰*，蘇恩誼，楊浩文，胡卓炎，李 琳*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，廣東 東莞 523808）

南豆腐又稱石膏豆腐，與北豆腐相比，其質(zhì)地軟嫩、細膩，色澤偏白亮，是我國傳統(tǒng)的大豆制品，具有豐富的營養(yǎng)價值和獨特的風(fēng)味，深受消費者歡迎。作為傳統(tǒng)中式食品，目前工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)單元操作逐漸取代家庭作坊式的生產(chǎn)模式，豆腐工業(yè)化加工單元操作與傳統(tǒng)家庭式的操作工藝稍有不同，主要工序包括原料大豆的浸泡、磨漿、過濾、點腦、蹲腦和成型等，最終豆腐產(chǎn)品為大豆蛋白的凝膠產(chǎn)物[1]。

到目前為止，國內(nèi)外學(xué)者已對大豆理化指標(biāo)、豆腐加工工藝及豆腐凝膠形成進程的變化與豆腐品質(zhì)關(guān)聯(lián)等方面進行了一定的研究。在大豆理化指標(biāo)方面，不同品種大豆中蛋白質(zhì)含量[2-3]、油脂含量[4]、植酸含量[5]、7S亞基與11S亞基的比例[6]、7S亞基和11S亞基含量[7]等與豆腐的得率、品質(zhì)等指標(biāo)之間存在著密切的聯(lián)系。在加工工藝優(yōu)化方面，豆腐的產(chǎn)量、質(zhì)地、口感、外形、色澤等都受到成型工序的影響，李小雅等發(fā)現(xiàn)當(dāng)磨漿料液比為1∶7、凝固溫度80 ℃、0.6 mol/L MgCl2溶液添加量為18 mL/L、凝固時間為20 min時，豆腐出品率和保水性均最高[8]。吳超義等發(fā)現(xiàn)在MgCl2溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量為7 U/g時，全豆鹽鹵充填豆腐成型完好，凝膠強度較高[9]。劉昱彤等發(fā)現(xiàn)，全豆豆?jié){在加熱至90 ℃、保溫10 min時，全豆豆腐凝膠強度最佳[10]。在豆腐凝膠方面，大豆蛋白的變性和凝膠體系的形成是影響豆腐品質(zhì)的關(guān)鍵因素，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能特性，尤其是蛋白質(zhì)的亞基和二級結(jié)構(gòu)。大量研究者提出凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是密切相關(guān)的[11]，同時蛋白質(zhì)亞基的組成和數(shù)量亦影響膠體的質(zhì)構(gòu)特性[12-13]，從而決定了產(chǎn)品的最終品質(zhì)。

綜上所述，目前針對北豆腐加工工藝的優(yōu)化及產(chǎn)品品質(zhì)之間關(guān)聯(lián)的報道較多，而針對南豆腐則鮮見報道。為了探尋南豆腐加工工藝與品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，及大豆蛋白在加工過程中結(jié)構(gòu)的變化，本研究采用傳統(tǒng)的南豆腐加工方法，以豆腐得率、保水性、質(zhì)構(gòu)特性和色差為評定指標(biāo)，探討凝固劑（CaSO4）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蹲腦時間和壓型力度對南豆腐品質(zhì)的影響。在此基礎(chǔ)上，探討大豆蛋白在不同加工操作過程中結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，以期為南豆腐標(biāo)準(zhǔn)化工業(yè)生產(chǎn)提供有效的技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆產(chǎn)地為黑龍江省伊春市，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.80%、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.87%，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.24%。

CaSO4（食品級） 湖北美基制品有限公司；無水檸檬酸（食品級） 浙江仁和生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3K30臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell 4-gelhandcasting system 美國BIO-RAD公司；Wizard 2.0真空冷凍干燥機 美國VirTis公司；CR-300色差計 日本Minolta公司；Tensor 37傅里葉變換紅外光譜儀 美國Bruker公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 豆腐制作工藝及影響因子

浸泡：將清洗后的干豆與水以質(zhì)量比1∶2于常溫下充分浸泡8～10 h；磨漿：每份樣品濕豆質(zhì)量約200 g，加入550 mL水，磨漿3 min；帶渣蒸煮：倒出生漿和豆渣于鍋內(nèi)，漿渣同煮至熟，煮漿過程中不斷攪拌并將產(chǎn)生的泡沫棄去；過濾：用紗布對熟漿進行2～3 次過濾，直到漿液濾干；升溫點腦：將過濾后的熟豆?jié){升溫至85 ℃，并立即與溶解后的凝固劑（CaSO4）以約45°對沖相撞混合，攪拌至均勻狀態(tài)；蹲腦：靜置凝固桶內(nèi)的豆腐腦，在靜置過程中不要碰撞或移動豆腐腦以免其蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，影響豆腐成型；壓制成型：將蹲腦后的豆腐腦倒入壓型模具內(nèi)（14 cm×14 cm×8 cm），壓出多余的黃漿水。

選取凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%～3.0%）、蹲腦時間（10～50 min）、壓型力度（2.0～7.0 g/cm2）為加工因素（水平），探討不同加工工藝對豆腐品質(zhì)的影響。選取凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為變量因素時，固定蹲腦時間30 min、壓型力度3.0 g/cm2；選取蹲腦時間為變量因素時，固定凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%、壓型力度3.0 g/cm2；選取壓型力度為變量因素時，固定凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%、蹲腦時間20 min。

1.3.2 豆腐得率測定

參考Liu等[14]的方法并加以修改，稱量每組豆腐樣品所用的濕豆質(zhì)量（m1），豆腐成品制作完成后靜置8 min，稱量并記錄成品濕質(zhì)量（m2），按公式（1）計算得率。

1.3.3 保水性測定

參考Urbonaite等[15]的方法加以修改，精確稱取兩份4 g豆腐成品，其中一份放入105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，質(zhì)量差為其所含水分質(zhì)量（m1）；另一份放入帶有脫脂棉的離心管中，1 000 r/min離心10 min后稱質(zhì)量，質(zhì)量差為流失水分的質(zhì)量（m2）；按公式（2）計算保水率。

1.3.4 豆腐全質(zhì)構(gòu)測定

將豆腐切成邊長為20 mm的正方體并放在載物平臺上，將探頭對準(zhǔn)樣品中心位置。測定參數(shù)為：探頭P/0.5、測前速率1.00 mm/s、測試速率0.50 mm/s、返回速率1.00 mm/s、壓縮深度10.00 mm、觸發(fā)應(yīng)力5 g、壓縮形變率30%。測定參數(shù)為硬度、彈性和咀嚼性。

1.3.5 色澤的測定

使用色差計測定豆腐樣品表面色差。使用前先進行自動黑白板校正，每塊豆腐表面隨機測定3 個位置，每次取樣重復(fù)3 次。記錄L*值、a*值、b*值：其中L*值代表亮度，L*＝0為黑色，L*＝100為明亮；a*值代表紅綠色度，＋60為紅色，－60為綠色；b*值代表黃藍色度，＋60為黃色，－60為藍色。

1.3.6 蛋白質(zhì)提取

大豆：取脫脂豆粉2 g與0.03 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液50 mL充分混合1 h（每10 min漩渦振蕩一次），在4 ℃、11 000 r/min下離心30 min，棄去沉淀，保留大豆蛋白上清液，透析48 h后真空濃縮，冷凍干燥后得到大豆蛋白粉末，4 ℃保存待測；生漿、熟漿：取生漿（熟漿）10 mL與0.03 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液15 mL充分混合，后續(xù)操作同大豆蛋白提取方法；豆腐腦、豆腐、豆渣：脫脂并冷凍干燥得到粉末，后續(xù)操作同大豆蛋白提取方法。

傅里葉變換紅外光譜信息的收集方式為衰減全反射（attenuated total ref l ectance，ATR）模式，ATR的晶體材料為ZnSe。采用OPUS 6.5軟件進行掃描，測定參數(shù)為：掃描范圍：4 000～400 cm－1；掃描次數(shù)：256 次；分辨率：4 cm－1。本實驗以空ATR晶體的傅里葉變換紅外光譜圖為背景，并扣除CO2和空氣中的水蒸氣。每個樣品的光譜基線校正采用Zhao Lei等[16]的方法，確保在1 800 cm－1處吸收值為0，基線相對平整。

所有樣品的圖譜采用Peak Fit v4.12軟件進行分析。傅里葉去卷積參數(shù)的選定要確保足夠多的譜帶變窄，從而能在酰胺I帶中完全顯示出來。去卷積過濾常數(shù)和平滑常數(shù)分別取值為：44%和16%。酰胺I帶中各個吸收峰的位置采用二級導(dǎo)數(shù)計算得到。

1.3.8 SDS-PAGE檢測

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參考Weng Wuyin等的方法[17]并有改動。配制4 mg/mL樣品溶液，樣品緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（15.1 g Tris、94 g 甘氨酸、5.0 g SDS和800 mL去離子水定容至1 L）。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，上樣量10 μL。濃縮膠階段電壓59 V，分離膠階段電壓90 V。使用考馬斯亮藍R-250染色50 min后脫色。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗中所有數(shù)據(jù)都是3 次測定的平均值，用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Duncan’s新復(fù)極差法評價樣品平均值之間的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工工藝條件對南豆腐得率及品質(zhì)的影響

2.1.1 凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖1 凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對南豆腐得率和保水性的影響Fig.1 Effect of coagulant content on the yield and water-holding capability of southern tofu

CaSO4是一種較好的凝固劑，其制作出的南豆腐得率較高，且質(zhì)感柔嫩。從圖1中可以明顯看出，隨著凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，南豆腐的得率有明顯的改變，當(dāng)凝固劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.0%～1.8%之間時，南豆腐的得率相對較高，都在110.0%以上，其中最高可達到119.5%。而繼續(xù)增加其質(zhì)量分?jǐn)?shù)則會造成豆腐得率的下降，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到2.0%時豆腐得率最低，只有98.9%。而保水性也有類似的趨勢，當(dāng)凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到1.2%時，豆腐的保水率達到最大值83.4%，隨著凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進一步增加，保水性雖然也呈現(xiàn)下降趨勢，但是其變化不明顯。CaSO4作為一種南豆腐加工過程中典型的凝固劑，其作用機理主要是在生漿加熱的過程中導(dǎo)致大豆蛋白發(fā)生變性、解離、聚集等，而蛋白亞基卻通過靜電引力、疏水性、氫鍵和二硫鍵共同作用使蛋白質(zhì)分子重新排列，從而形成可溶的蛋白-脂肪或蛋白-蛋白復(fù)合蛋白；而鈣離子的加入降低了蛋白質(zhì)的電荷，促進大豆蛋白發(fā)生疏水膠凝，形成南豆腐。研究發(fā)現(xiàn)豆腐凝膠的硬度和咀嚼性與凝固劑的添加量及豆?jié){中蛋白質(zhì)顆粒濃度相關(guān)，凝固劑添加量越高，豆?jié){中蛋白質(zhì)顆粒濃度越高，兩者越容易結(jié)合形成網(wǎng)絡(luò)狀的三維結(jié)構(gòu)，增強豆腐凝膠的強度。一旦凝固劑添加量過高，則容易在蹲腦過程中形成體積較大的豆腐凝膠，使其不能充分進入到豆?jié){底部，從而使底部的一部分豆?jié){沒有參與凝固，包漿現(xiàn)象較為明顯，凝膠體系不完整，造成咀嚼性下降；同時也會在最后的壓型過程中造成這部分沒有參與凝固的蛋白質(zhì)隨黃漿水流失，導(dǎo)致豆腐得率較低，保水率降低[18]。這就解釋了當(dāng)凝固劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1.2%時豆腐的保水性下降的原因。

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表1 凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對南豆腐質(zhì)構(gòu)特性和色澤的影響Table1 Effect of coagulant content on texture properties and color of southern tofu

從表1中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時，南豆腐成型性較差，其硬度、彈性和咀嚼性都相對較低且易碎，不能滿足豆腐的基本特性。隨著凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，豆腐的硬度呈現(xiàn)增加的趨勢，當(dāng)凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到3.0%時，硬度可以達到167.53 g；與此相反，彈性則呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時彈性最高，為0.89。從豆腐色澤中發(fā)現(xiàn)，凝固劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對豆腐的L*值影響較小，而a*值和b*值發(fā)生一定的變化，但是沒有明顯的規(guī)律性。當(dāng)凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%時，a*值達到3.90，而b*值較低，為11.13。

凝固劑的添加對豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)有一定的影響，適當(dāng)增加凝固劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.0%～1.8%之間）可以提高豆腐的得率和保水性，同時隨著鈣離子含量的增加，蛋白分子間靜電斥力減小，疏水相互作用、氫鍵等作用力增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)合速率和凝膠強度增加，豆腐的硬度和咀嚼性都有明顯的增強[19]。一旦凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大，則可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的凈電荷為正，分子斥力增大，質(zhì)構(gòu)特性下降，在壓型過程中壓榨出的黃漿水增多，從而導(dǎo)致色度的變化。綜上所述，對于南豆腐來講，“細”、“嫩”的質(zhì)構(gòu)為其主要的特征，因此當(dāng)凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%時，制作出的豆腐得率和保水性較好，亦具有一定的硬度和咀嚼性。

2.1.2 蹲腦時間

圖2 蹲腦時間對南豆腐得率和保水性的影響Fig.2 Effect of coagulation time on the yield and water-holding capacity of southern tofu

如圖2所示，隨著蹲腦時間的延長，南豆腐的得率和保水率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)蹲腦時間為40 min時得率可以達到126.5%；蹲腦時間為30 min時，保水率達到最高，為83.3%。如表2所示，南豆腐的硬度和咀嚼性會隨著蹲腦時間的延長而增大，而彈性則呈下降趨勢。色澤中L*值變化較小，a*值和b*值都隨著蹲腦時間的延長而總體呈增大趨勢。當(dāng)蹲腦時間達到最大值50 min時，a*值和b*值也分別達到4.30和11.87。在一定的蹲腦時間范圍（30 min）內(nèi)，隨著蹲腦時間的延長，可形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的變性蛋白分子數(shù)目增多，從而導(dǎo)致豆腐網(wǎng)絡(luò)致密性提高，蛋白網(wǎng)絡(luò)鏈條粗、分布均勻，網(wǎng)絡(luò)鏈條之間作用力大[20]，使其失水率減小、得率增大，同時硬度和咀嚼性較好，從而達到南豆腐相對較高的得率和保水性，且硬度合適、色澤偏白，符合南豆腐本身“嫩”的特征。如果繼續(xù)延長蹲腦時間，蛋白分子上的巰基發(fā)生氧化[21]，形成凝膠的巰基含量減少，導(dǎo)致凝膠強度、得率和保水性降低，且內(nèi)部粗糙，造成硬度和咀嚼性過高、色澤偏深，達不到較好的南豆腐品質(zhì)。綜上所述，蹲腦時間為20 min時，南豆腐的得率、保水性較高，硬度、彈性和咀嚼性較好，色澤偏白。

表2 蹲腦時間對南豆腐質(zhì)構(gòu)和色澤的影響Table2 Effect of coagulation time on texture characteristics and color of southern tofu

2.1.3 壓型力度

圖3 壓型力度對南豆腐得率和保水性的影響Fig.3 Effect of pressure on the yield and water-holding capacity of southern tofu

從圖3中可以明顯看出，壓型力度越大，南豆腐的得率越低，而保水率則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)壓型力度為7.0 g/cm2時，得率僅為102.3%，而保水率也降低到80%以下。

表3 壓型力度對南豆腐質(zhì)構(gòu)和色澤的影響Table3 Effect of pressure on texture characteristics and color of southern tofu

從表3中可以發(fā)現(xiàn)，壓型力度對南豆腐質(zhì)構(gòu)的影響較大。隨著壓型力度的增加，南豆腐的硬度、彈性和咀嚼性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)壓型力度達到4.5 g/c m2時，其分別達到最大值11 5.8 0 g、0.8 4和6 6.1 0。而色澤的變化主要集中在b*值上，壓型力度達到4.5 g/c m2時，南豆腐的b*值偏高。壓型操作的目的是對豆腐腦施加一定的壓力，將多余的黃漿水壓出，促使豆腐腦緊密結(jié)合，最終成為豆腐成品，從而減少存放過程中豆腐的脫水收縮作用。壓型力度過小時，大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)周圍的水分無法完全釋放，這樣導(dǎo)致豆腐的成型不均勻，并且容易發(fā)生脫水收縮；壓型力度過大時，豆腐的凝膠結(jié)構(gòu)遭到較大的破壞，黃漿水損失過多，而豆腐的保水性與黃漿水的損失量呈負相關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)在黃漿水中溶解有一定量的可溶性蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，因此一旦壓型過程中黃漿水流失過多，豆腐的營養(yǎng)價值就會降低[22]。

在傳統(tǒng)的南豆腐加工操作過程中，當(dāng)凝固劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.20%、蹲腦時間為20 min、壓型力度為3.0 g/cm2時，豆腐得率和保水率分別達到119.5%和83.1%，所形成的豆腐具有較高的得率和保水性，硬度和咀嚼性較好，色澤偏白，品質(zhì)較好。

2.2 南豆腐加工過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化2.2.1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

大豆蛋白質(zhì)凝膠體系是決定豆腐品質(zhì)最重要的因素之一。研究發(fā)現(xiàn)豆腐凝膠形成過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生了重要的變化，尤其是其二級結(jié)構(gòu)的變化；也有觀點認(rèn)為凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)具有密切的關(guān)聯(lián)性[11,23]。因此，本研究利用傅里葉變換紅外光譜追蹤加工操作過程中蛋白質(zhì)的變化，構(gòu)建傅里葉去卷積處理后的圖譜。

圖1 經(jīng)過不同加工階段后大豆蛋白酰胺I帶傅里葉去卷積后高斯曲線擬合的譜圖Fig.1 Fourier-deconvoluted amide I spectra by Gaussian curve fi tting of soybean protein at different stages of tofu processing

如圖4所示，對于大豆蛋白，酰胺I帶中經(jīng)過去卷積擬合后有13 個峰出現(xiàn)，說明大豆蛋白二級結(jié)構(gòu)相對比較復(fù)雜，而這主要是大豆蛋白成分的多樣性造成的。其中最大的峰出現(xiàn)在1 652 cm－1處，是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)；其次是位于1 631 cm－1和1 661 cm－1處的兩個峰，分別為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。經(jīng)過不同加工操作處理后，蛋白質(zhì)酰胺I帶發(fā)生了明顯的變化，生漿中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中1 628 cm－1處（β-折疊）峰值明顯增大，熟漿中1 616 cm－1處（分子間β-折疊）峰消失，而加入凝固劑后的豆腐腦和豆腐中1 616 cm－1處（分子間β-折疊）峰重新出現(xiàn)。

表1 經(jīng)過不同加工階段后大豆蛋白中酰胺I帶中不同峰的位置、含量及二級結(jié)構(gòu)歸屬Table1 Analysis of secondary structure contents of soybean protein at different stages of tofu processing

為了更加明確地表示大豆蛋白在加工操作過程中二級結(jié)構(gòu)的變化，根據(jù)文獻[24-25]分別對酰胺I帶去卷積后高斯曲線擬合圖譜中各個峰進行指紋識別。如表4所示，未經(jīng)處理的大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，其含量可以達到46.36%，其余依次為β-轉(zhuǎn)角（18.48%）和無規(guī)卷曲（15.45%），含量最低的為α-螺旋，僅為11.27%左右，這與Li Huijing等的結(jié)論[26]相似，顯示出大豆蛋白較為緊密的結(jié)構(gòu)。大豆經(jīng)過浸泡、磨漿加工后得到生漿，從生漿中蛋白的二級結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，1 631 cm－1（β-折疊）和1 685 cm－1（反平行β-折疊）兩處峰消失，導(dǎo)致了β-折疊含量從46.36%下降到40.38%；與此同時，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量增加。Georget等的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在不同水分含量的體系下，由于大量氫鍵的存在會導(dǎo)致其二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量下降[27]。同時，在磨漿的過程中，物理破碎和擠壓同樣對大豆蛋白的結(jié)構(gòu)造成一定的破壞，這樣就造成了生漿中蛋白質(zhì)由收縮的緊密結(jié)構(gòu)逐漸呈現(xiàn)為展開狀態(tài)。與生漿相比，熟漿中β-折疊含量又呈現(xiàn)上升趨勢，尤其是在1 632 cm－1處峰的出現(xiàn)導(dǎo)致β-折疊含量上升至44.21%。這主要是由于豆?jié){中7S球蛋白的變性溫度為（70±2）℃，11S球蛋白的變性溫度為（90±2）℃[28]，而煮漿的溫度要超過蛋白質(zhì)的變性溫度；變性后大豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)進一步展開，隨著分子間次級鍵和共價鍵的作用，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，這就是大豆蛋白的熱聚集行為[29]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在加熱的狀態(tài)下，11S球蛋白的堿基亞基和7S球蛋白的β-亞基以及少量的α、α’亞基之間發(fā)生相互作用，二硫鍵是聚集體形成的主要作用力[30]，從而影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

加入凝固劑后，鈣離子的加入可以降低蛋白質(zhì)電荷數(shù)量，促進大豆發(fā)生疏水凝膠作用，在疏水鍵、離子鍵、氫鍵的共同作用下，蛋白質(zhì)分子發(fā)生重排，形成網(wǎng)絡(luò)狀的凝膠體系，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進一步改變，其中最為明顯的是無規(guī)卷曲的含量從熟漿中的11.85%上升至豆腐腦中的20.46%，而同時α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和谷氨酰胺側(cè)鏈含量下降。這些現(xiàn)象表明蛋白質(zhì)在形成凝膠的過程中，結(jié)構(gòu)逐漸展開，分子發(fā)生重新排布，造成了無序結(jié)構(gòu)的增加。豆腐腦還需經(jīng)壓型操作后才可得到成型的南豆腐，最終的豆腐中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進一步改變，經(jīng)過物理擠壓后，β-折疊含量進一步升高至55.02%，而無規(guī)卷曲含量則下降到12.24%，說明無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化為β-折疊，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由無序向有序轉(zhuǎn)變。這主要是由于壓型操作過程中擠壓出了多余的黃漿水，使凝膠結(jié)構(gòu)進一步穩(wěn)定，并減少豆腐的脫水收縮作用。對于經(jīng)過蒸煮后變性的大豆蛋白，水分的降低反而可以起到增加其結(jié)構(gòu)緊密性的作用。豆渣中的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與熟漿中類似。

在整個南豆腐加工過程中，浸泡、打漿處理會導(dǎo)致β-折疊含量下降、β-轉(zhuǎn)角含量增加，蛋白質(zhì)由收縮的緊密結(jié)構(gòu)逐漸呈現(xiàn)為展開狀態(tài)；而在工藝后期，經(jīng)點腦、蹲腦以及加壓處理后，大豆蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)含量不斷回升，無序結(jié)構(gòu)減少，蛋白二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象較為穩(wěn)定，從微觀上闡述了加工過程對大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

2.2.2 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量

圖5 經(jīng)過不同加工階段后大豆蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE of soybean protein at different stages of tofu processing

從圖5中可以明顯看出，大豆蛋白的組成主要為7S、11S球蛋白。其中7S球蛋白由β（45～52 kDa）、α（57～68 kDa）、α′（57～72 kDa）3 種亞基通過非共價作用組成，而11S球蛋白由6 個堿性亞基B（約20 kDa）和6 個酸性亞基A（約38 kDa）通過二硫鍵連接組成。

在加工過程中，大豆蛋白（II）與生漿蛋白（III）的條帶類似，沒有明顯的變化，說明大豆經(jīng)過浸泡、磨漿操作后對其亞基幾乎沒有影響。而生漿經(jīng)加熱后得到熟漿（IV），其條帶灰度加深，尤其位于44.3 kDa附近的β亞基條帶灰度加深明顯，表明豆?jié){中的蛋白質(zhì)大聚集物受熱分解成小分子的可溶性蛋白[31]。熟漿法制作南豆腐，豆?jié){經(jīng)加熱后再進行過濾操作，豆渣樣品（V）的電泳條帶灰度明顯淺于過濾后的熟漿樣品（IV），這與Li Meng等的實驗結(jié)果[13]相似，證明經(jīng)熟漿法制作的豆制品可以保留較高的蛋白質(zhì)含量。過濾后的豆?jié){在一定溫度下與凝固劑混合、靜置凝固、蹲腦，豆腐腦樣品（VI）與南豆腐樣品（VII）的電泳條帶灰度變淺，在凝固劑的作用下，7S亞基發(fā)生變性，大豆蛋白的α和α′等亞基解離而聚集生成大分子聚合物。蹲腦過程中，大豆蛋白相互結(jié)合形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠，蛋白結(jié)構(gòu)也因此發(fā)生改變。但經(jīng)壓榨成型后的南豆腐樣品（VII）的A亞基條帶和B亞基條帶比豆腐腦樣品（VI）加深，加壓作用使得大豆蛋白中的一部分大分子聚合物再次發(fā)生解離。成型后的南豆腐還含有一定量的7S亞基以及11S亞基，說明在加工過程中蛋白質(zhì)的保持率較好。

3 結(jié) 論

在傳統(tǒng)南豆腐制作加工過程中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%的凝固劑（CaSO4）、蹲腦時間20 min和壓型力度為3.0 g/cm2時，豆腐得率和保水率分別達到119.5%和83.1%，且硬度和咀嚼性較好，色澤偏白，符合南豆腐的特性。在加工操作過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)隨著工藝過程而變化，尤其大豆蛋白二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)從有序到無序再到有序的變化特性，而大豆蛋白亞基變化程度相對較小，蛋白質(zhì)在加工過程中保持率較好。本研究從宏觀與微觀上闡明了南豆腐形成過程中主要品質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為南豆腐的標(biāo)準(zhǔn)化工業(yè)生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持和理論依據(jù)。