側(cè)柏葉HPLC 指紋圖譜建立及4 種成分測(cè)定

宗珊珊， 蘇本正， 石典花，?， 戴衍朋， 孫立立， 張學(xué)順

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟(jì)南250355； 2. 山東省中醫(yī)藥研究院， 山東 濟(jì)南250014； 3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 山東 濟(jì)南250011）

側(cè)柏葉來源于柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis （L.） Franco 的枝梢及葉， 多在夏、 秋兩季采收、 陰干， 其氣清香、 味苦澀， 歸肺、 肝、 脾經(jīng)， 具有涼血止血、 化痰止咳、 生發(fā)烏發(fā)的功效，主要用于吐血、 衄血、 咯血、 便血、 崩漏下血、 肺熱咳嗽、 血熱脫發(fā)、 須發(fā)早白［1］， 化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類［2-4］、 黃酮類［5-8］、 鞣質(zhì)類［9-10］等， 主要為黃酮類［11］， 其中總黃酮具有抑制α-糖苷酶、 抗RBC 氧化損傷、 激活毛母細(xì)胞、 促進(jìn)血液循環(huán)、養(yǎng)發(fā)、 生發(fā)作用； 楊梅苷具有收縮血管、 降血糖、抗氧化、 保肝、 利膽、 抗炎、 抗突變、 抗腫瘤［12］、鎮(zhèn)痛作用［13］； 槲皮苷具有止咳平喘、 抗炎、 抗過敏、 解痙、 強(qiáng)心、 降血壓、 擴(kuò)張冠脈、 降血脂、 抗心律失常、 抗血小板聚集、 抗氧化、 抗腫瘤作用［14］； 穗花雙黃酮具有抗炎、 抗氧化、 抗微生物、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用， 可減輕腦損傷， 提高神經(jīng)可塑性， 改善神經(jīng)退行性疾?。?5］。

目前， 《中國藥典》 及文獻(xiàn)報(bào)道側(cè)柏葉含有量測(cè)定的指標(biāo)成分大多為槲皮苷［16］， 為進(jìn)一步有效控制其質(zhì)量， 本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上建立了異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮的TLC 鑒別、 HPLC指紋圖譜及含有量測(cè)定的方法， 為進(jìn)一步有效提升該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［17］提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mettler XS205DU 電子天平（十萬分之一， 瑞士Mettler-Tolodo 公司）； 超聲處理機(jī)（濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠）； 紫外儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）； 水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）； 鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； 硅膠G 板（青島海洋化工廠）； UitiMate3000 高效液相色譜儀（配置UV 檢測(cè)器）、 Waters 2695 高效液相色譜儀（配置Waters 2996 DAD 檢測(cè)器） （美國Waters公司）。

1.2 試藥 楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮對(duì)照品均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（ 批 號(hào) PRF8031443、 PRF8030703、 16022001、PRF7122043）。 10 批側(cè)柏葉為課題組于不同時(shí)間、地點(diǎn)采集后晾干凈制， 分別為濟(jì)南燕子山（1 號(hào)、5 號(hào)）、 濟(jì)南南部山區(qū)（2 號(hào)、 4 號(hào)）、 濟(jì)南佛慧山（3 號(hào)）、 臨沂東山（6 號(hào)）、 臨沂洪山（7 號(hào)）、 臨沂西北山（8） 號(hào)、 臨沂費(fèi)縣（9 號(hào)） 和濟(jì)南章丘（10 號(hào)）， 經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林惠彬研究員鑒定為正品。 甲醇、 磷酸、 乙腈均為色譜純； 水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別 取側(cè)柏葉粉末1 g， 加70% 甲醇20 mL 超聲30 min， 過濾， 濾液蒸干， 加甲醇2 mL溶解， 作為供試品溶液。 取異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮對(duì)照品適量， 加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.1、 1、 0.1 mg／mL 的混合對(duì)照品溶液。 按照薄層色譜法（通則0502）， 吸取供試品、 對(duì)照品溶液各3 μL， 分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上， 以乙酸乙酯-甲醇-水 （100 ∶17 ∶13） 為展開劑， 展至約3 cm， 取出， 晾干， 再以甲苯（水飽和） -甲酸乙酯-甲酸（4.5 ∶4.5 ∶1） 為展開劑， 展開， 取出，晾干， 噴以1%三氯化鋁試液， 100 ℃加熱5 min，置紫外光燈（365 nm） 下檢視， 結(jié)果見圖1， 表明10 批側(cè)柏葉在與穗花雙黃酮、 槲皮苷、 異槲皮苷對(duì)照品色譜的相應(yīng)位置上均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2 側(cè)柏葉HPLC 指紋圖譜

圖1 10 批樣品TLC 圖譜（365 nm）Fig.1 TLC chromatogram of ten batches of samples（365 nm）

2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 乙腈（A） -0.1%磷酸（B） 為流動(dòng)相， 梯度洗脫（0～30 min， 10% ～20%A； 30～50 min， 20% ～40%A； 50 ～90 min， 40% ～70%A； 90～110 min， 70% ～100%A）； 柱溫30 ℃；體積流量1 mL／min； 檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm； 進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 供試品溶液 取側(cè)柏葉粉末1 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加甲醇25 mL， 稱定質(zhì)量，超聲處理30 min， 放冷， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 過濾， 取續(xù)濾液， 過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取楊梅苷、 槲皮苷、異槲皮苷、 穗花雙黃酮對(duì)照品適量， 加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為97.4、 10.03、 120、 13.34 μg／mL 的對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.3.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（3 號(hào)）， 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次， 測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.1%， 相對(duì)峰面積RSD＜5%， 表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（3 號(hào)）， 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、 2、 4、 8、 12、 24 h進(jìn)樣， 測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.13%，相對(duì)峰面積RSD＜5%， 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取3 號(hào)樣品6 份， 按“2.2.2.1” 項(xiàng) 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液， 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.1%， 相對(duì)峰面積RSD＜5%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 指紋圖譜建立

2.2.4.1 色譜峰歸屬 按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備10 批供試品溶液， 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 記錄峰面積， 將指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2.0 版” 進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2， 標(biāo)定了18 個(gè)共有峰， 見圖3。 與對(duì)照品色譜圖（圖4） 保留時(shí)間比較， 確定第3、 4、6、 12 號(hào)色譜峰分別為楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮。 圖3 中， 6 號(hào)槲皮苷峰前后無雜質(zhì)峰干擾， 分離度較高， 峰形較好， 峰面積相對(duì)穩(wěn)定， 故將其確定為參照峰， 各特征峰相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。s

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of ten batches of sample

2.2.4.2 相似度 將10 批樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件， 生成對(duì)照?qǐng)D譜， 經(jīng)多點(diǎn)校正、 色譜峰匹配計(jì)算相似度， 結(jié)果見表1。 由表可知， 10批樣品指紋圖譜相似度均在0.98 以上， 表明不同時(shí)間、 地點(diǎn)采集的側(cè)柏葉的質(zhì)量差異不大。

圖3 10 批樣品共有峰Fig.3 Common peaks of ten batches of samples

圖4 對(duì)照品色譜峰Fig.4 Chromatographic peaks of reference substances

表1 10 批樣品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

2.3 側(cè)柏葉含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Phenomenex Gemini 色譜柱（250 mm×4.60 mm， 5 μm）； 乙腈（A） -0.1%磷酸（B） 為流動(dòng)相， 梯度洗脫（0～20 min， 17%A；20～60 min， 17% ～50%A）； 柱溫35 ℃； 體積流量1 mL／min； 檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 供試品溶液 取側(cè)柏葉粉末1 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加甲醇25 mL， 稱定質(zhì)量，超聲處理30 min， 放冷， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 過濾， 取續(xù)濾液， 0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取楊梅苷、 槲皮苷、異槲皮苷、 穗花雙黃酮對(duì)照品適量， 加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.974、 0.100、 1.20、 0.133 mg／mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按照高效液相色譜法（2015 版 《中 國 藥 典》 四 部 通 則0512）， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下精密吸取對(duì)照品、 供試品溶液各10 μL 進(jìn)樣。結(jié)果， 對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同保留時(shí)間有相應(yīng)峰形， 峰形對(duì)稱， 無拖尾現(xiàn)象， 見圖5～6。

2.3.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL， 置10 mL 量瓶中， 甲醇溶解并定容至刻度，搖勻， 精密吸取0、 2、 4、 6、 8、 10、 15 μL， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮回歸方程分別為Y ＝33.394X ＋0.060 4（R2＝0.999 7）、 Y ＝0.027 4X＋0.053 6（R2＝0.995 3）、 Y ＝0.029 8X-0.055 1 （R2＝0.999 8）、 Y ＝4.622 9X ＋0.188 3（R2＝0.999 9）， 分別在0 ～1.461 0、 0 ～150.45、0～1 800、 0～50.1 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖5 對(duì)照品HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of reference substances

圖6 側(cè)柏葉HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of Platycladi Cacumen

2.3.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（3號(hào)樣品）， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次， 每次10 μL， 測(cè)得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮峰面積RSD 分別為0.16%、0.14%、 0.09%、 0.07%， 表明儀器精密度良好。

2.3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取3 號(hào)樣品供試品溶液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、 2、 4、 6、8、 10、 12、 24 h 進(jìn)樣， 測(cè)得楊梅苷、 異槲皮苷、槲皮苷、 穗花雙黃酮峰面積RSD 分別為0.48%、0.56%、 0.59%、 0.62%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.2.1” 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液5 份 （3 號(hào)樣品）， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 測(cè)得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮含有量RSD 分別為1.92%、 1.54%、 1.61%、 1.84%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的3 號(hào)樣品0.5 g， 精密稱定5 份， 置于具塞錐形瓶中，分別加入1 mL 適宜濃度的上述4 種對(duì)照品溶液，再加入甲醇21 mL， 稱定質(zhì)量， 超聲30 min， 放冷， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 過濾， 濾液過0.45 μm微孔濾膜， 得供試品溶液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 測(cè)得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮的平均加樣回收率分別為101.77%、107.73%、 101.75%、 105.95%， RSD 分 別 為2.93%、 1.50%、 2.74%、 1.35%。

2.3.3.7 樣品含有量測(cè)定 取10 批樣品， 按“2.3.2.1” 項(xiàng) 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見表2。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在TLC 鑒別中通過展開系統(tǒng)的優(yōu)選，最終確定采用二次展開， 此時(shí)槲皮苷、 異槲皮苷、穗花雙黃酮3 種成分均分離完全、 斑點(diǎn)清晰， 故可將其作為側(cè)柏葉藥材或飲片TLC 鑒別的指標(biāo)性成分。

然后， 考察了甲醇-水、 乙腈-水、 甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等系統(tǒng)， 結(jié)果表明乙腈-磷酸系統(tǒng)中雜質(zhì)峰干擾較少， 分離度較高， 峰形較好， 峰面積較穩(wěn)定， 故選用其進(jìn)行梯度洗脫。 再建立了側(cè)柏葉HPLC 特征指紋圖譜， 并進(jìn)行方法學(xué)考察， 在18個(gè)共有特征峰中辨識(shí)出槲皮苷、 異槲皮苷、 楊梅苷、 穗花雙黃酮， 其中槲皮苷峰無雜質(zhì)峰干擾， 分離度高， 峰形良好， 峰面積穩(wěn)定， 故確定其為參照峰。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝2）

含有量測(cè)定結(jié)果表明， 10 批樣品中4 種黃酮類成分存在一定差異， 這可能與產(chǎn)地、 采收時(shí)間及生長(zhǎng)年限有關(guān)。 結(jié)合2015 年版《中國藥典》 側(cè)柏葉項(xiàng)下槲皮苷含有量限度， 初步將其中4 種黃酮類成分的含有量限度設(shè)定為平均值下浮50% （楊梅苷不得少于0.10%， 異槲皮苷不得少于0.01%，槲皮苷不得少于0.20%， 穗花雙黃酮不得少于0.03%）。

綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)建立的側(cè)柏葉TLC 鑒別、HPLC 指紋圖譜及楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、穗花雙黃酮含有量測(cè)定方法均簡(jiǎn)便可行， 可用于控制該藥材質(zhì)量， 進(jìn)而保障其臨床療效。 今后，將繼續(xù)研究在指紋圖譜中或建立一測(cè)多評(píng)法測(cè)定上述成分含有量， 以期在提高標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)節(jié)省成本和資源。