粉紅色和白色紫芽茶樹花SPME/GC-MS香氣成分分析

陳美伴，Dylan O' Neill Rothenberg，張凌云

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

茶（Camellia sinensis L.）樹花屬完全花，由花托、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊組成?；ㄝ嗌罹G，通常5片；花瓣通常5枚，多數(shù)為白色，少數(shù)呈粉紅色；花冠直徑一般為4～5 cm；雄蕊200～300枚［1-2］。茶樹花蕾一般6月形成，分化形成期一直延續(xù)到11月甚至更晚。開花期一般在9～12月，10月中旬至11月中旬為盛花期，南方茶區(qū)可延續(xù)到第2年2～3月［1］。茶樹花屬蟲媒花，基部有腺體，可以分泌蜜汁，散發(fā)芬芳的香氣引誘昆蟲采蜜而授粉。茶樹花具有花期長、花量多、結(jié)實(shí)少、壽命短的特點(diǎn)，是一種量大而利用率低的可再生資源。2017年全國茶園總面積305.5萬hm2，茶樹花生物量一般為1 722.8～2 199.2 kg/hm2［3］，每年全國茶園可產(chǎn)茶樹鮮花526.28～671.81萬t。

Lin等［4］研究表明，茶樹花與芽葉主要生化成分大體相同、含量有差異，茶樹花含較多的黃酮類、水溶性糖類、氨基酸，等量的兒茶素，較少的脂肪、咖啡堿［5-7］。王麗麗等［8］研究表明，初展茶樹花香氣成分主要為芳香醇類、萜烯醇類、脂肪醇類和芳香酮類化合物，其中苯乙酮、a-苯乙醇、2-戊醇、2-苯乙醇、芳樟醇為茶樹花的主要香氣成分。傅麗亞等［9］對(duì)超臨界CO2萃取的茶樹花萃取物進(jìn)行分析，鑒定出97種化合物，分別是烷烴類33.85%、酯類8.49%、醛類2.35%、酮類5.95%、醇類2.86%、羧酸類31.18%、萜烯類8.16%及其他7.16%，香氣成分主要有壬醛、2，4-庚二烯醛、癸醛、苯乙酮、芳樟醇、α-紫羅酮、β-紫羅酮、2-庚酮、苯乙醇、己酸。游小清等［10］指出茶樹花精油中的主要揮發(fā)性成分為2-戊醇、2-庚醇、苯甲醛、芳樟醇及其氧化物、苯乙酮、香葉醇、a-苯乙醇等，并發(fā)現(xiàn)在開花過程中，其芳樟醇類、香葉醇以及橙花醇的含量都有十分明顯的變化，但砧烯指數(shù)變化較小。Joshi等［7］研究指出茶花揮發(fā)性風(fēng)味成分芳樟醇、香葉醇、芳樟醇氧化物、苯乙酮、戊二烯醛、苯甲醛、己酸含量較高，且在花瓣綻放初期含量最高。

基于茶樹花優(yōu)質(zhì)的內(nèi)含成分和揮發(fā)性成分，越來越多的人關(guān)注茶樹花資源的利用，如開發(fā)含茶樹花成分的飲品、化妝品、香精油、食品、保健產(chǎn)品等。研究表明，植物的芳香性揮發(fā)物質(zhì)具有較高的藥用價(jià)值，不僅可以醒腦提神、平和心緒，還能有助于神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等疾病的治療［11］。因此對(duì)茶樹花揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)一步研究很有必要。目前，有關(guān)茶樹花不同開花階段的揮發(fā)性成分變化研究較少，而關(guān)于粉紅色茶樹花揮發(fā)性成分的研究尚未見報(bào)道。SPME/GC- MS（頂空固相微萃取 - 氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用）技術(shù)是目前在香氣成分或揮發(fā)性成分檢測(cè)中常用的新型萃取分離技術(shù)，該技術(shù)可有效提高香氣成分的檢測(cè)準(zhǔn)確度，并詳細(xì)分析出不同種類食品主要的呈香組分［12］。本研究通過對(duì)5種不同開花程度的粉紅色和白色紫芽茶樹花分別進(jìn)行SPME/GC-MS揮發(fā)性成分分析，以了解茶樹花開花過程中的香氣變化，并了解白色和粉紅色茶樹花香氣成分的區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶樹種植于惠州，采集時(shí)間為2017年12月3～4日，白色花茶樹（記為W）為紫鵑茶樹品種（大葉種，茶花白色，紫色嫩梢），粉紅色花茶樹（記為R）為惠州當(dāng)?shù)夭铇淙后w種（小葉種，茶花紅色，紫色嫩梢），按花蕾、露白、含苞待放、盛開、衰敗5種不同程度開放狀態(tài)（分別記為1，2，3，4，5，圖1，彩插一）采摘。采后用液氮處理，放入-80℃冰箱保存。

試驗(yàn)主要儀器：Agilent 7890B/5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱HP-5MS（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；萃取裝置：SPME 手動(dòng)進(jìn)樣手柄；萃取頭65 μm PDMS/DVB。

2.2 試驗(yàn)方法

萃取條件：稱取1.5 g樣品于20 mL三角頂空瓶，70℃水浴萃取45 min。

解析條件：250℃，3 min。

色譜柱條件：進(jìn)樣口250℃，柱溫50℃；He流速 1 mL/ min；不分流。

升溫程序：起始50℃，2 min→以5℃/min上升至130℃后保持5 min→以8℃/min上升至235℃后保持5 min→以15℃/min上升至280℃后保持1 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)量掃描范圍35.00～450.00 amu，離子源70eV，溫度230℃；四級(jí)桿溫度250℃；輔助加熱器280℃。

萃取頭老化條件：丙酮浸泡30 min，250℃老化30 min。

2.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)檢索并與圖譜庫NIST14.L的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)圖譜進(jìn)行對(duì)照分析，物質(zhì)的相對(duì)含量采用峰面積歸一法分析，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步確認(rèn)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱，并采用Excel 2013軟件和SPSS 19軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹花感官形態(tài)比較

通過感官對(duì)比發(fā)現(xiàn)，除花瓣顏色明顯不同外，白色茶樹花和粉紅色茶樹花的其他形態(tài)特征相似，如花冠大小、雄蕊色澤、花萼與花瓣為5枚。通過鼻嗅發(fā)現(xiàn)，兩種茶樹花香氣區(qū)別明顯，白色茶樹花香氣清雅、清甜，粉紅色茶樹花香氣較濃郁，蜜甜含花香，層次豐富。在田間發(fā)現(xiàn)粉紅色茶樹花招來采蜜的蜜蜂更多。

2.2 SPME∕GC-MS茶樹花香氣成分分析

2.2.1 粉紅色茶樹花香氣成分分析 從R1檢測(cè)到50種香氣物質(zhì)，總相對(duì)含量為67.54%；R2，43種，57.29%；R3，44種，71.68%；R4，43種，82.43%；R5，68種，86.43%（表1）。從表2可以看出，粉紅色茶樹花香氣類型含量較多的有醇類、酯類、酮類、烯烴類（圖2）。醇類除3階段外各階段含量都多，4、5階段相對(duì)1、2階段較多（主要因芳樟醇含量變化引起），其中醇類主要是苯乙醇、芳樟醇、香葉醇、苯甲醇、a-甲基苯甲醇（圖3），花果香型醇類含量隨開花進(jìn)程先減少后增加，3階段時(shí)最低。醇類分布具有低沸點(diǎn)青氣型醇類趨于1、2階段，高沸點(diǎn)花果香型醇類趨于4、5階段的特點(diǎn)。酯類在1、2階段含量多，3、4、5階段含量明顯少，酯類主要是水楊酸甲酯，具有冬青油香，其含量變化趨勢(shì)是1、2階段含量多，之后顯著下降（圖4）。酮類主要是苯乙酮，只在3階段含量較高（圖5）。烷烴類含量在3、5階段含量少。烯烴類在3、4、5階段含量較高。其他香氣類型含量較少，但也呈現(xiàn)一定規(guī)律：雜氧類、含氮類、萘/苯類在3階段增加后平緩保持。醛類含量較少，且在3階段進(jìn)一步減少并波動(dòng)保持?？偟膩碚f，具有花果香味的物質(zhì)在3階段或4階段顯著增加，之后平緩增加；具有青氣味的物質(zhì)則在3階段顯著降低，之后平緩保持。

表1 粉紅色和白色茶樹花各階段香氣種類及總相對(duì)含量（%）

表2 粉紅色茶樹花香氣類型及相對(duì)含量（%）

圖2 粉紅色茶樹花香氣類型含量變化

圖3 粉紅色茶樹花醇類物質(zhì)含量變化

圖4 粉紅色茶樹花水楊酸甲酯含量占比

圖5 粉紅色茶樹花苯乙酮含量占比

2.2.2 白色茶樹花香氣成分分析 從W1檢測(cè)到57種香氣物質(zhì)，總相對(duì)含量為86.79%；W2，60種，91.25%；W3，53種，79.81%；W4，33種，79.81；W5，27種，84.76種（ 表1）。白色茶樹花的香氣類型含量較多的有醇類、酮類、烯烴類（表3，圖6）。醇類在5個(gè)階段都保持高含量，且在4、5階段明顯增加（主要因芳樟醇含量變化引起），主要成分是芳樟醇、香葉醇，其含量隨開花進(jìn)程先減少后增加，2階段時(shí)最低（圖7）。在5個(gè)開花階段，酯類含量少，變化不大（圖8）。酮類主要成分是苯乙酮，在1、2、3階段都有高含量，4、5階段含量明顯減少，其含量變化呈先升高后減少的變化趨勢(shì)，在2階段時(shí)最高（圖9）。

表3 白色茶樹花香氣類型及相對(duì)含量（%）

圖6 白色茶樹花香氣類型含量變化

圖7 白色茶樹花醇類物質(zhì)含量變化

圖8 白色茶樹花水楊酸甲酯含量占比

圖9 白色茶樹花苯乙酮含量占比

2.2.3 粉紅色和白色茶樹花香氣成分比較 從表4可知，粉紅色茶樹花主要揮發(fā)性物質(zhì)有水楊酸甲酯、苯乙酮、苯乙醇、芳樟醇、香葉醇、苯甲醇、α-甲基-苯甲醇、α-金合歡烯、大根香葉烯、摩勒烯、依蘭烯、8-Isopropyl-1-methyl-3-methylenetricyclo［4.4.0.02，7］decanerel； 白 色茶樹花主要揮發(fā)性物質(zhì)有水楊酸甲酯、苯乙酮、芳樟醇、香葉醇、2，2，6-三甲基-6-乙烯基四氫-2氫-吡喃-3-醇、吉瑪烯。粉紅色茶樹花與白色茶樹花香氣成分比較，具有成分相似、含量差別大的特點(diǎn)。粉紅色茶樹花相對(duì)白色茶樹花含量顯著較多的有：1、2階段酯類（圖10），3、5階段烯烴類（圖11），3、4、5階段萘/苯類；顯著較少的有：醇類，1、2階段酮類。粉紅色茶樹花醇類含量雖然比白色茶樹花少（圖12），但是其醇類種類更多且閾值更低，花果香型酯類又能補(bǔ)充醇類的不足；粉紅色茶樹花的苯乙酮含量明顯比白色茶樹花少（圖13）。總體上看：粉紅色茶樹花在1～5階段都有高含量的花果香型醇類香氣成分，1、2階段有高含量的水楊酸甲酯，3階段有高含量的苯乙酮成分。白色茶樹花在1～5階段都有高含量的花果香型醇類香氣成分，1～3階段有高含量苯乙酮成分。即對(duì)粉紅色和白色茶樹花香氣成分差異最大的是苯乙酮、水楊酸甲酯以及萜烯類醇類的含量。另外發(fā)現(xiàn)粉紅色茶樹花3階段是個(gè)特殊階段，體現(xiàn)為花果香型物質(zhì)醇類和酯類含量少、苯乙酮含量多的特點(diǎn)。

表4 粉紅色和白色茶樹花的主要香氣成分

圖10 兩種茶樹花酯類和水楊酸甲酯含量對(duì)比

圖11 兩種茶樹花烯烴類含量對(duì)比

圖12 兩種茶樹花醇類含量對(duì)比

圖13 兩種茶樹花酮類和苯乙酮含量對(duì)比

2.3 系統(tǒng)聚類分析

對(duì)粉紅色茶樹花R1～R5和白色茶樹花W1～W5共10個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析，將距離接近或性質(zhì)接近的兩類合并為一類，再從n-1類中找到最接近的兩類合并，以此類推，直到所有樣品被合并為一類，聚集在一個(gè)集群的樣品香型接近。

由表5可知，當(dāng)把10個(gè)樣品分3個(gè)集群時(shí)（表 5），分類情況為 R1R2、R3R4R5、W1W2W3W4W5等3個(gè)集群；當(dāng)分為4個(gè)集群時(shí)，則為 R1R2、R3R5、R4、W1W2W3W4W5等4個(gè)集群；當(dāng)分為5個(gè)集群時(shí)，則為R1R2、R3、R4、R5、W1W2W3W4W5等5個(gè)集群，顯然兩種茶樹花沒有交集，白色茶樹花總是聚為一個(gè)群集，可見粉紅色茶樹花香氣成分差異大，情況較復(fù)雜。從樹狀圖（圖14）進(jìn)一步看出白色茶樹花內(nèi)分類情況為W1W2、W4、W3W5；而R4最容易被單獨(dú)歸為一個(gè)集群，是差異最大的?？偟膩碚f相較于不同開花階段的影響，粉紅色和白色茶樹花香氣成分受茶樹品種影響較大；也說明了粉紅色茶樹花相對(duì)白色茶樹花各階段香氣成分差異大。

表5 系統(tǒng)聚類分析群集結(jié)果

圖14 10個(gè)茶樹花樣品的聚類結(jié)果樹狀圖

3 結(jié)論

本研究對(duì)粉紅色和白色紫芽茶樹花從花蕾、露白、含苞待放、盛開、衰敗5種不同程度的開花狀態(tài)進(jìn)行香氣成分分析，結(jié)果表明粉紅色茶樹花在1、2、4、5階段都有高含量醇類（但都比相應(yīng)階段白色花少），主要是芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、苯甲醇、a-甲基苯甲醇；1、2階段有高含量酯類，主要是水楊酸甲酯；醇類、酯類的主要物質(zhì)成分有明顯花果香；僅在3階段有高含量苯乙酮。白色茶樹花在1～5階段都有高含量醇類，主要是芳樟醇、香葉醇，物質(zhì)成分有明顯花果香；1～3階段有高含量苯乙酮，具明顯青味。粉紅色茶樹花聞起來更芬芳或招惹蜜蜂更多的原因主要是含有較少的苯乙酮，另外有較高含量的水楊酸甲酯，以及更多種類的花果香型醇類組合?？傮w上表現(xiàn)出粉紅色茶樹花比白色茶樹花更芬芳的特點(diǎn)。前人對(duì)茶樹花（白色）香氣成分研究也顯示苯乙酮含量多、水楊酸甲酯偏少的特點(diǎn)［13-15］。聚類分析結(jié)果表明，相較不同程度開花階段，粉紅色和白色茶樹花香氣成分受茶樹花品種影響更大；還體現(xiàn)了粉紅色茶樹花相對(duì)白色茶樹花在不同程度開花階段香氣成分差異大的特點(diǎn)。