燕麥麩皮中燕麥膠的提取純化工藝優(yōu)化及純度測定

王振強，賈俊偉，王浩

（1.黃河水利職業(yè)技術學院，河南開封475003；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

燕麥屬禾本科植物，是世界上主要農(nóng)作物之一， 國際上主要產(chǎn)于俄羅斯、加拿大、美國及歐洲；我國則以裸燕麥為主，主要產(chǎn)于內(nèi)蒙、山西、甘肅、青海等地[1-2]。燕麥是一種可溶性纖維，具有較高的營養(yǎng)價值，含有一系列葡萄糖分子聚合而成的β-葡聚糖，擁有多種保健功能[3]。燕麥膠是燕麥中β-葡聚糖提取后的存在形式，β-葡聚糖可以增強免疫力，吞噬細胞活力，快速殺滅病菌、真菌和病原微生物，幫助遠離感染性疾病[4]?？梢韵w內(nèi)惡性細胞，對肝癌、乳腺癌抑制率很高，沒有任何副作用，有一定的防癌抗癌功效[5]。專家研究顯示，患有高血壓的患者每天吃3 g～4 g β-葡聚糖，能有效的降低膽固醇發(fā)病機率[6]。國際上對燕麥的營養(yǎng)、保健作用研究認識比較早，在食品、化妝品、藥品生產(chǎn)上廣泛的應用。我國生產(chǎn)的燕麥產(chǎn)品成本低，品質(zhì)好，在國際市場上有很強的競爭力[7]。隨著人們對燕麥食品營養(yǎng)保健作用的不斷認識，燕麥食品也越來越受到世界人民的青睞，燕麥食品開發(fā)有著廣闊的前景[8]。因此，從燕麥麩皮中提取純化燕麥膠，并進行純度測定具有重要的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：市售；耐熱 α-淀粉酶（1 800 U/mL）、瓜兒膠：北京奧博星生物技術責任有限公司；乙醇：天津市文達稀貴試劑化工廠；苯酚：天津市北方醫(yī)化制劑廠；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250：聯(lián)星生物制劑廠。

1.2 儀器與設備

80-2B型低速離心機：上海安亭科學儀器廠；FA1604S電子天平：上海天平儀器廠；TDA8002電子恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；DG404真空電熱干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；CHNO6O型pH計：美國奧立龍公司；722E分光光度計、RE-2000旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHZ-88型臺式水浴恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 燕麥預處理

取一定量的燕麥麩與75%乙醇溶液混溶，80℃下回流攪拌4 h，冷卻到30℃，除去上清液，再與純乙醇混溶攪拌15 min，過濾除去乙醇，35℃脫溶30 h，得到燕麥麩處理物，備用[9]。

1.3.2 提取得率測定

式中：C1為提取得到的β-葡聚糖質(zhì)量，g；M1為燕麥原料總質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取溫度對提取效果的影響

將處理好的燕麥麩皮料液比為1∶10（質(zhì)量比），分別于 30、40、50、60、70、80 ℃下提取試驗，提取 3 次，時間120 min，以燕麥膠提取得率為標準，確定提取溫度對提取效果的影響。

1.3.3.2 提取時間對提取效果的影響

將處理好的燕麥麩皮料液比為1∶10（質(zhì)量比），溫度 70 ℃，分別提取 30、60、90、120、150、180 min，提取3次，以燕麥膠提取得率為標準，確定提取時間對提取效果的影響。

1.3.3.3 料液比對提取效果的影響

將處理好的燕麥麩皮料液比分別為1∶5、1∶10、1 ∶15、1∶20、1 ∶25（質(zhì)量比），溫度 70 ℃，時間 120 min進行提取，提取3次，以燕麥膠提取得率為標準，確定料液比對提取效果的影響。

1.3.3.4 提取次數(shù)對提取效果的影響

將處理好的燕麥麩皮料液比為1∶10（質(zhì)量比），溫度 70 ℃，時間 120 min，分別提取 1、2、3、4、5 次，以燕麥膠提取得率為標準，確定提取次數(shù)對提取效果的影響。

1.3.4 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選取提取溫度、料液比、提取次數(shù)為正交試驗因素水平，做L9（34）正交試驗，正交試驗條件因素水平如表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factor level table

1.3.5 燕麥膠純化工藝

1.3.5.1 淀粉脫除方法

用耐熱α-淀粉酶去除燕麥膠中的淀粉。α-淀粉酶是耐高溫酶，反應溫度90℃。酶活力是1 800 U/mL，稀釋100倍后是17.70 U/mL。將提取好的燕麥膠分為8份，每份 25mL。用量分別為 3、6、12、15、18、21、24U，作用時間分別為 10、20、30、40、50、60、70、80 min，以碘液與反應液作用其產(chǎn)生的顏色為判斷標準，確定淀粉去除情況[10-11]。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)脫除方法

采用等電點法去除燕麥膠中的蛋白質(zhì)。用鹽酸將燕麥膠的 pH 值分別調(diào)至 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，4 ℃低溫靜置過夜，離心，沉淀為蛋白質(zhì)。上清液用乙醇沉淀，加入乙醇時要少量緩慢的加入并不斷攪拌，過濾離心，沉淀物干燥，計算得率（由于量較少在干燥時與濾紙一起干燥，用干燥后的總重量減去濾紙重量得到燕麥膠重量）[12]。蒸餾水溶解、定容，測定純度，確定最佳pH值。

1.3.6 燕麥膠純度測定

1.3.6.1 糖含量測定標準曲線

取105℃干燥恒重的葡萄糖20 mg，精密稱重，溶解，定溶至 500 mL。分別取溶液 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 加水定容至 2 mL，加 1 mL 苯酚，搖勻后迅速加濃硫酸5 mL，放置10 min，搖勻后再放置20 min。以蒸餾水為空白樣，在490 nm處測定其吸光度，分別以溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖得到硫酸-苯酚法標準曲線[13]。得到標準曲線的回歸方程為 y=0.016x-0.025 2，R2=0.999 3。

1.3.6.2 蛋白質(zhì)標準液配制

配制考馬斯亮藍G-250蛋白試劑：取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL乙醇（90%）中，再加入85%的磷酸100 mL，加水定容至1 000 mL。

配制蛋白質(zhì)標準液：稱取100 mg牛血清蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，制成1 000 μg/mL的儲備液。再按表2和表3比例配制成2套不同濃度的溶液，以備制作標準曲線[14]。

表2 蛋白質(zhì)濃度為100 μg/mL～1 000 μg/mL數(shù)據(jù)表Table 2 The data sheet of protein concentration on 100 μg/mL-1 000 μg/mL

表3 蛋白質(zhì)濃度為0～100 μg/mL數(shù)據(jù)表Table 3 The data sheet of protein concentration on 0-100 μg/mL

1.3.6.3 蛋白質(zhì)含量的測定標準曲線

表2的數(shù)據(jù)適用于蛋白質(zhì)含量為100 μg/mL～1 000 μg/mL的標準曲線。各取溶液0.1 mL加5 mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，混勻，2 min后以蒸餾水為空白樣，在595 nm處測其吸光度。分別以溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖得到考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量標準曲線。得到曲線公式和R2值，要求R2值在0.990以上。

表3的數(shù)據(jù)適用于蛋白質(zhì)含量為0～100 μg/mL的標準曲線。各取溶液0.5 mL加5 mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，混勻，2 min后以蒸餾水為空白樣，在595 nm處測其吸光度，分別以溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖得到考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量標準曲線[13]。得到曲線公式和R2值，要求R2值在0.990以上。

1.3.6.4 糖含量計算

用硫酸-苯酚法測定糖含量。分別取不同pH值的燕麥膠2 mL加1 mL苯酚，搖勻后迅速加濃硫酸5 mL，放置10 min，搖勻后再放置20 min。以蒸餾水為空白樣，在490 nm處測定其吸光度。用標準曲線得到的公式可根據(jù)吸光度算出對應溶液的濃度，即得到糖含量[14-15]。

1.3.6.5 蛋白質(zhì)含量計算

用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。試驗測定燕麥膠樣品中的蛋白質(zhì)含量很少，濃度范圍適用于用表2數(shù)據(jù)的標準曲線。分別取不同pH值的燕麥膠0.5 mL加5 mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，混勻，2 min后以蒸餾水為空白樣，在595 nm處測吸光度，用標準曲線得到的公式可根據(jù)吸光度算出對應溶液的蛋白濃度，即得到蛋白質(zhì)含量[14-15]。

2 結果與分析

2.1 提取溫度的確定

將處理好的燕麥麩皮料液比為1∶10（質(zhì)量比），分別于 30、40、50、60、70、80 ℃下提取，提取 3 次，時間120 min，燕麥膠提取得率如圖1。

圖1 提取溫度對燕麥膠提取效果的影響Fig.1 Effect of extracting temperature on extraction of oat gum

由圖1可知，隨著提取溫度的增加，燕麥膠提取得率逐漸增大，當達到70℃時，提取得率達到最大，再提高提取溫度，提取得率逐漸減小，因此提取溫度為70℃比較合適。

2.2 提取時間的確定

將處理好的燕麥麩皮料液比為1∶10（質(zhì)量比），溫度 70 ℃，分別提取 30、60、90、120、150、180 min，提取3次，燕麥膠提取得率如圖2。

圖2 提取時間對燕麥膠提取效果的影響Fig.2 Effect of extracting time on extraction of oat gum

由圖2可知，隨著提取時間的延長，燕麥膠提取得率逐漸提高，當提取時間達到120 min時，提取得率增加速度緩慢。提取時間越長，試驗耗能越大，提取時間120 min比較合適。

2.3 料液比的確定

將處理好的燕麥麩皮料液比分別為1∶5、1∶10、1 ∶15、1∶20、1∶25（質(zhì)量比），溫度 70℃，時間 120 min進行提取，提取3次，燕麥膠提取得率如圖3。

圖3 料液比對燕麥膠提取效果的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction of oat gum

由圖3可知，隨著料液比的提高，燕麥膠提取得率也相應提高，當料液比為1∶10（質(zhì)量比）時，在增加料液比，提取得率增加的緩慢，考慮到提取液濃度越小，越不利于燕麥膠的提取效果，料液比選用1∶10（質(zhì)量比）比較合適。

2.4 提取次數(shù)的確定

將處理好的燕麥麩皮料液比為1∶10（質(zhì)量比），溫度 70 ℃，時間 120 min，分別提取 1、2、3、4、5 次，燕麥膠提取得率如圖4。

由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，燕麥膠提取得率逐漸增加，當提取次數(shù)達到3次時，再增加提取次數(shù)，提取得率增加的比較緩慢。提取次數(shù)越多，試驗耗能越大，提取次數(shù)3次比較合適。

圖4 提取次數(shù)對燕麥膠提取效果的影響Fig.4 Effect of extracting times on extraction of oat gum

2.5 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，選取提取溫度、料液比、提取次數(shù)為正交試驗因素水平，做L9（34）正交試驗，結果如表4，方差分析結果如表5。

表4 正交試驗結果Table 4 The results of orthogonal experiments

表5 方差分析結果Table 5 The results of variance analysis

由表4、表5可知，提取燕麥膠的影響因素的重要性為C>A>B，即提取次數(shù)>提取溫度>料液比；C即提取次數(shù)極顯著的（P<0.01）影響得率，A即提取溫度顯著的（P<0.05）影響得率，B即料液比影響不顯著；最佳提取條件是A3B1C3，即提取溫度70℃，料液比1∶10（質(zhì)量比），提取次數(shù)3次。在最佳提取條件下進行驗證試驗，燕麥膠提取得率為4.57%。

2.6 純化效果

2.6.1 淀粉脫除效果

用耐熱α-淀粉酶去除燕麥膠中的淀粉，脫除效果試驗結果如表6。

表6 淀粉脫除效果結果Table 6 The results of starch removal effect

由表6可以看出，從用量和脫除淀粉效果方面考慮，耐熱α-淀粉酶的最佳用量6 U，水解反應40 min能完全脫除燕麥膠提取液中淀粉。

2.6.2 蛋白質(zhì)脫除效果

將調(diào)至不同pH值的燕麥膠溶液4℃低溫過夜，過濾離心，干燥后溶解，定溶到100 mL，確定最佳pH值，見表7。

表7 燕麥膠重量結果Table 7 The results of weight on oat gum

由表7可以看出，等電點沉淀法能有效脫除燕麥膠溶液中的蛋白質(zhì)，溶液pH值為4.5時，得到燕麥膠質(zhì)量最大，脫除蛋白質(zhì)效果最佳。

2.7 純度測定

2.7.1 糖含量測定標準曲線

硫酸-苯酚法測定燕麥膠樣品中糖含量標準曲線如圖5。

由圖5可知，標準曲線的回歸方程為y=0.016x-0.025 2，R2=0.999 3。

圖5 測定糖含量標準曲線Fig.5 The standard curve line of determining sugar content

2.7.2 蛋白質(zhì)含量測定標準曲線

考馬斯亮藍法測燕麥膠樣品中蛋白質(zhì)含量在100 μg/mL～1 000 μg/mL 范圍的標準曲線如圖 6。

圖6 測定蛋白質(zhì)含量標準曲線（100 μg/mL～1 000 μg/mL）Fig.6 The standard curve line of determining protein content（100 μg/mL-1 000 μg/mL）

由圖6可知，標準曲線的回歸方程為y=0.000 5x+0.049 2，R2=0.998 3?？捡R斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量在0～100 μg/mL范圍的標準曲線如圖7。

圖7 測定蛋白質(zhì)含量標準曲線（0～100 μg/mL）Fig.7 The standard curve line of determining protein content（0-100 μg/mL）

由圖7可知，標準曲線的回歸方程為y=0.002 5x+0.044 3，R2=0.993 5。

2.7.3 純度測定結果

硫酸-苯酚法測定燕麥膠樣品中糖含量結果及其吸光度數(shù)據(jù)如表8，考馬斯亮藍法測定燕麥膠樣品中蛋白質(zhì)含量結果及其吸光度數(shù)據(jù)如表9。

表8 硫酸-苯酚法測定糖含量結果及其吸光度數(shù)據(jù)Table 8 The result of sulphuric acid-phenol method and it’s absorbance data for determining sugar content

表9 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量結果及其吸光度數(shù)據(jù)Table 9 The result of of coomassie brilliant blue method and it’s absorbance data for determining protein content

由表8、表9可看出測定燕麥膠樣品中糖含量和殘留蛋白質(zhì)含量的最佳pH值是4.5；燕麥膠樣品中糖含量為60.518%，殘留的蛋白質(zhì)含量為3.584%。

3 結論

1）由單因素試驗和正交試驗結果可知，燕麥膠提取的影響因素的重要性為C＞A＞B，即提取次數(shù)＞提取溫度＞料液比；由方差分析結果可知，提取次數(shù)極顯著的（P＜0.01）影響得率，A 即提取溫度顯著的（P＜0.05）影響得率，B即料液比影響不顯著；優(yōu)化提取最佳工藝條件是A3B1C3，即為提取溫度70℃，料液比1∶10（質(zhì)量比），提取次數(shù)3次，提取時間120 min，最優(yōu)提取條件下進行驗證試驗，燕麥膠提取得率為4.57%。

2）耐熱α-淀粉酶能有效的水解脫除提取液中的淀粉，脫除淀粉效果的最佳條件：耐熱α-淀粉酶的最佳用量為6 U，水解反應40 min能完全脫除燕麥膠提取液中淀粉；等電點沉淀法能有效脫除燕麥膠溶液中的蛋白質(zhì)，最佳脫除溶液pH值為4.5。

3）硫酸-苯酚法能夠準確測定燕麥膠樣品中糖含量，考馬斯亮藍法能準確測定麥膠樣品中殘留蛋白質(zhì)含量，測定樣品液的最佳pH值是4.5；燕麥膠樣品中糖含量為60.518%，殘留的蛋白質(zhì)含量為3.584%。