酪蛋白磷酸肽檢測(cè)方法研究進(jìn)展

邵琪，魏麗娜，張東麗，張麗茹，王為，屈巖峰，*

（1.黑龍江東方學(xué)院 食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150066；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010011；3.呼倫貝爾雙娃乳業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古呼倫貝爾162750）

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP），是酪蛋白經(jīng)過特定的蛋白酶水解、分離純化后得到的含有成簇的磷酸絲氨酸的生物活性肽，其生物活性中心可表示為-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-[1]，這種結(jié)構(gòu)的磷酸肽分子中帶有高濃度的負(fù)電荷，對(duì)于CPP發(fā)揮其生理功能是必不可少的。由于CPP具有這種特殊的核心結(jié)構(gòu)，既能抵抗消化道中各種酶的攻擊免遭水解，又可以與鈣離子結(jié)合形成可溶性絡(luò)合物，從而有效地防止鈣在小腸pH值呈中性或弱堿性環(huán)境下形成磷酸鈣沉淀，從而促進(jìn)鈣在小腸中吸收[2-4]。除鈣外，CPP還可促進(jìn)鐵、錳、鋅、硒等礦物質(zhì)的吸收，因此被譽(yù)為“礦物質(zhì)載體”[5-7]。經(jīng)過國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的大量研究表明，CPP也具有防齲齒、促進(jìn)牙齒、骨骼中鈣的沉積和鈣化、提高繁殖性能、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及促進(jìn)體內(nèi)益生菌增殖等營(yíng)養(yǎng)功能[8-11]。

目前，CPP的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，主要應(yīng)用于適合兒童、老人、孕婦等不同人群食用的各種保健食品[12]，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 14880-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》指出CPP可應(yīng)用于嬰幼兒配方食品、糧食和糧食制品、飲料等，并對(duì)使用量作了明確的規(guī)定[13]。日本和德國(guó)等國(guó)早已把CPP作為功能性食品，我國(guó)多家企業(yè)也將CCP作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加在嬰幼兒奶粉和保健食品中。

近年來，關(guān)于食品中CPP含量的測(cè)定方法有很多種，但迄今國(guó)內(nèi)尚無權(quán)威的、統(tǒng)一的檢測(cè)方法。本研究針對(duì)國(guó)內(nèi)外CPP檢測(cè)技術(shù)的研究情況、存在的問題和研究方向分別進(jìn)行闡述，不僅為食品中CPP含量測(cè)定方法的研究提供借鑒，而且對(duì)于指導(dǎo)同類產(chǎn)品中CPP含量的檢測(cè)具有一定參考價(jià)值。

1 酪蛋白磷酸肽檢測(cè)方法研究現(xiàn)狀

目前，研究較多的CPP檢測(cè)方法主要有氯化鋇-乙醇沉淀法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法等。這些方法均具有各自的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也有著一定的不足。

1.1 氯化鋇-乙醇沉淀法

氯化鋇-乙醇沉淀法是在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H值條件下，CPP分子間可通過鋇離子（Ba2+）形成橋連，加入一定濃度的乙醇即可使橋連狀的CPP分子團(tuán)沉淀下來，將得到的CPP沉淀進(jìn)行分離、干燥，稱重后即可得出產(chǎn)品中CPP含量[14-15]?，F(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)GB 31617-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑酪蛋白磷酸肽》[16]中采用此方法對(duì)CPP含量進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確度差，效果并不理想。

陳雪香等[17]對(duì)來自8個(gè)不同公司樣品中CPP含量進(jìn)行測(cè)定（樣品純度較低），分別采用氯化鋇-乙醇沉淀法、氮磷比（N/P）法及高效液相色譜法。其中氯化鋇-乙醇沉淀法利用鹽酸調(diào)節(jié)樣液的pH值至4.6使蛋白質(zhì)溶解度降低而形成沉淀，5℃4000 r/min離心30 min，取上清液加入氯化鋇溶液使CPP分子形成橋連，再加入乙醇后得到CPP沉淀。經(jīng)分離、干燥后測(cè)定8個(gè)樣品中CPP含量，比較8種樣品測(cè)定結(jié)果得出，樣品中CPP含量最低為19.43%，最高為38.01%，與N/P的結(jié)果和實(shí)際值相差較大，得出對(duì)于CPP純度較低的樣品而言，添加的其它成分導(dǎo)致最后測(cè)定結(jié)果有較大偏差。

張帥等[18]采用氯化鋇-乙醇沉淀法測(cè)定鈣片中CPP含量，參照陳雪香的方法并在此的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，把離心機(jī)參數(shù)調(diào)整為8000 r/min離心15 min，同時(shí)為使CPP沉淀更完全，增加了靜止的時(shí)間，測(cè)定的5個(gè)樣品中CPP回收率均高于220%。該方法操作繁瑣費(fèi)時(shí)，受pH值、沉淀時(shí)間及樣品中其它可以和Ba2+離子絡(luò)合的組分的影響，導(dǎo)致回收率有較大程度偏高，不適用于添加了各種組分的保健品中CPP含量測(cè)定。

1.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法

毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（capillary zone electroporesis，CZE）是毛細(xì)管電泳中最簡(jiǎn)單、也是目前應(yīng)用相對(duì)較多的一種分離方式[19-21]。其分離機(jī)理是在緩沖溶液中帶電粒子在電場(chǎng)的作用下以各自不同速度向其所帶電荷極性相反方向移動(dòng)形成電泳，電泳的移動(dòng)和電滲流結(jié)合而使分子分離。

Adamson等[22]利用CZE分析了多組分CPP。嘗試將CPP的絕對(duì)電滲流與其物理化學(xué)性質(zhì)聯(lián)系起來，從蛋白質(zhì)消化液中選擇性沉淀多個(gè)含磷?；碾?，使用C8（5 μm，4.6 mm×220 mm）反相高效液相色譜分離純化后，樣品經(jīng)0.1%的三氟乙酸（1 mg/mL）溶解，用CZE對(duì)多組分進(jìn)行分析，通過測(cè)定與中性內(nèi)標(biāo)的相對(duì)遷移時(shí)間確定了各種肽段的絕對(duì)電滲流，獲得了良好的線性關(guān)系（R2=0.993）。

王利民等[23]利用兩種規(guī)格石英毛細(xì)管，不同的檢測(cè)波長(zhǎng)、緩沖液及pH值不同的緩沖液，在工作電壓30 kV、柱溫25℃的條件下測(cè)定CPP的含量，研究發(fā)現(xiàn)在使用50 cm×70 μm i.d.石英毛細(xì)管柱，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為200 nm，用pH 9.2的四硼酸鈉緩沖液CPP會(huì)得到理想的分離效果。該方法操作簡(jiǎn)便、分離和測(cè)定速度快、分辨率高、重現(xiàn)性好、樣品及緩沖液用量少、自動(dòng)化程度高。但由于一些食品中的蛋白質(zhì)和鹽類成分會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果造成干擾，故該法僅適合一些CPP制劑產(chǎn)品的含量測(cè)定[24]。

牟光慶等[25]用CZE對(duì)CPP進(jìn)行了分離和測(cè)定。在Adamson等[20]人的基礎(chǔ)上略加改動(dòng)，樣品經(jīng)0.1%的濃度為50 mg/L三氟乙酸溶解，在工作電壓30 kV、柱溫25℃、毛細(xì)管長(zhǎng)度50 cm、內(nèi)徑70 μm、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm、緩沖液為pH 9.2的硼酸緩沖液條件下測(cè)定，得到不同N/P樣品的CPP。結(jié)果表明，N/P可以反映出CPP肽鏈的長(zhǎng)短和磷酸基的密度，N/P越小，CPP含量越高，但前處理過程復(fù)雜，受pH值及溫度影響。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liq－uid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS）是目前比較成熟的一種聯(lián)用技術(shù)，它將高效液相色譜可以分離不穩(wěn)定組分和質(zhì)譜對(duì)被測(cè)組分高度的鑒別能力結(jié)合起來[26-28]，即使在檢測(cè)復(fù)雜樣品時(shí)，也具有良好的分離效果及較高的靈敏度[29]。

賴奕堅(jiān)等[30]用HPLC-MS法，以選擇離子模式分別測(cè)定CPP標(biāo)準(zhǔn)樣品、空白樣品以及添加1.0%CPP標(biāo)樣的樣品，根據(jù)掃描結(jié)果選取了離子質(zhì)荷比為454.3分離效果較好、不受雜質(zhì)峰干擾的特征峰作為CPP的代表，用上述方法對(duì)4批次CPP樣品進(jìn)行分析，檢出限為 1 μg/mL，在 1 μg/mL～100 μg/mL 范圍內(nèi)線性回歸方程為y=3 074.6x+684.6，R2=0.999，回收率在96%～104%之間。該法前處理簡(jiǎn)便，專屬性好，靈敏度高，可用于測(cè)定鈣強(qiáng)化食品中CPP的含量，但是由于不同廠家的樣品各異，會(huì)導(dǎo)致標(biāo)志峰存在差異，且未對(duì)該特征峰作為CPP的代表做進(jìn)一步的分析。

胡蓓等[31]利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)確定酪蛋白氨基酸序列信息，通過高分辨質(zhì)譜篩選出CPP原料中具有特異性的肽段，再通過多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式對(duì)CPP特征肽進(jìn)行定量測(cè)定，依據(jù)CPP原料與CPP特征肽含量折算系數(shù)，采用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法確定出樣品中CPP的含量。該方法在10 mg/100 g～150 mg/100 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999，回收率在96.2%～100.2%之間。與鋇鹽沉淀法、CZE法比較，具有前處理簡(jiǎn)單，分析速度快，靈敏度高，定量結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，然而其定量限為1 mg/100 g，僅適用于低含量CPP的檢測(cè)，并需要使用較為大型、昂貴的儀器，測(cè)試成本較高。

1.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是以液體作為流動(dòng)相，色譜柱為固定相，待測(cè)樣品在流動(dòng)相的攜帶下進(jìn)入色譜柱，并基于被測(cè)組分在兩相間具有不同的吸附能力來達(dá)到分離的目的[32-34]。目前，對(duì)于CPP的分離檢測(cè)技術(shù)，高效液相色譜法應(yīng)用比較普遍。比如，張帥等[16]還用HPLC法分析了鈣片中CPP的含量，樣品處理后，以三氟乙酸（TFA）水溶液及含有機(jī)相為5%～35%的TFA乙腈溶液為流動(dòng)相梯度淋洗，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，選用C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱和紫外檢測(cè)器測(cè)定。在此條件下，CPP分離效果良好，檢出限為6.81 μg/mL，回收率為96.75%～104.07%，說明HPLC法準(zhǔn)確度和靈敏度較高。

Miquel[35]等利用高效液相色譜儀對(duì)CPP中可能影響礦物質(zhì)利用的磷酸絲氨酸殘基序列鑒定，色譜柱為C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），樣品能得到較好的分離效果，對(duì)β-酪蛋白水解產(chǎn)生的CPP能夠準(zhǔn)確的定量。Kosalkova[36]等也試圖采用HPLC法對(duì)食品中CPP含量的檢測(cè)方法進(jìn)行研究。

田隨安等[37]用HPLC對(duì)保健食品中CPP含量進(jìn)行測(cè)定。以乙腈和0.1%冰乙酸溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫25℃，色譜柱為Diam onsil C18250mm×4.6mm，由于樣品在240 nm和280 nm下都有紫外吸收，對(duì)比發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)不易受流動(dòng)相干擾，并在此最佳波長(zhǎng)下測(cè)定樣品，得到最低檢出限為10 μg/mL，回收率在91%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%，適用于保健食品中CPP含量的測(cè)定。

劉玉娟等[38]把經(jīng)過溫水溶解的乳粉樣品超聲提取、離心后用高效液相色譜分析。采用ODS（125 mm×4.0 mm）色譜柱分離，并對(duì)經(jīng)常使用的兩種流動(dòng)相有乙腈-0.1%乙酸水溶液或乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%乙酸水溶液作流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，峰型較好，故選用該流動(dòng)相，用紫外檢測(cè)器對(duì)樣品檢測(cè)。檢出限為6.25 mg/kg，線性范圍為5.0 μg/mL～100.0 μg/mL，加標(biāo)回收率為 71.4%～94.2%，方法樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果符合定性定量要求，適合奶粉中CPP含量的檢測(cè)。

梁艷等[39]以CPP原料作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過測(cè)定樣品中CPP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來確定CPP的含量。樣品經(jīng)提取、凈化后，采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以一定比例的乙酸-甲醇溶液和乙酸-水溶液進(jìn)行梯度洗脫，在紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為280 nm的最佳條件下測(cè)定乳制品CPP含量。兩種樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.68%和1.89%，回收率為96.0%和97.1%，該方法能將樣品中的CPP較好的分離出來，準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性良好，適用范圍廣。

1.5 其他分析方法

龐廣昌等[40]為找到適合不同層次CPP含量測(cè)定的方法，對(duì)直接定磷法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）法及聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（isoelectric focusing electrophoresis，IFE）法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這3種方法在不同的情況下，都可以測(cè)定CPP含量。直接定磷法前處理簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，適用于產(chǎn)業(yè)CPP含量測(cè)定，但由于一些含有磷酸的肽也包含在內(nèi)，會(huì)得到一個(gè)偏高的結(jié)果，故用此方法前必須要測(cè)定樣品中的無機(jī)磷及非蛋白磷；SDS-PAGE法操作較為復(fù)雜，且電泳圖譜中含磷帶與不含磷帶無明顯分界，在切下含磷帶時(shí)往往會(huì)混入其它肽，導(dǎo)致CPP含量較高，僅適用于CPP組分測(cè)定，但不需測(cè)定樣品中的無機(jī)磷及非蛋白磷；IFE法測(cè)定CPP含量，準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好，適用于較精確的測(cè)定，但需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備及藥品。

2 酪蛋白磷酸肽檢測(cè)面臨的困難與發(fā)展方向

2.1 食品成分復(fù)雜

食品的種類多樣，其組成基質(zhì)復(fù)雜，除碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，大多數(shù)添加CPP的產(chǎn)品中還含有鹽類、無機(jī)磷及少量非蛋白質(zhì)含磷物等多種化學(xué)物質(zhì)，對(duì)檢測(cè)過程中樣品（尤其是鈣強(qiáng)化食品）的準(zhǔn)確定量造成了一定程度上的干擾。

2.2 檢測(cè)技術(shù)的局限性

雖然CPP含量的檢測(cè)方法有很多種，但由于CPP產(chǎn)品成分復(fù)雜，有些方法在應(yīng)用到食品中CPP的測(cè)定存在一定的局限性。氯化鋇-乙醇沉淀法中一些非CPP的組分也可以和Ba2+結(jié)合形成絡(luò)合物，專屬性差，使測(cè)定值高于實(shí)際值，只能用于單一CPP產(chǎn)品含量測(cè)定；CZE法在適當(dāng)?shù)臈l件下可以得到很好的分離效果且有良好的重現(xiàn)性，但受蛋白質(zhì)和鹽類物質(zhì)干擾較大；CPP經(jīng)酶水解制得，無固定分子量，HPLC-MS法對(duì)CPP含量的監(jiān)測(cè)存在一定難度。

2.3 CPP檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向

相對(duì)于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、氯化鋇-乙醇沉淀法等檢測(cè)技術(shù)，HPLC法克服了食品成分復(fù)雜的局限性，具有前處理簡(jiǎn)單、快速、專屬性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用中仍然有較多問題。就添加了CPP的嬰幼兒配方奶粉而言，測(cè)定過程中無市售標(biāo)準(zhǔn)品，需要以CPP原料為對(duì)照品對(duì)CPP含量進(jìn)行測(cè)定，由于樣品生產(chǎn)廠家有所不同的，會(huì)導(dǎo)致不同樣品的標(biāo)志峰及其含量會(huì)存在差異。雖然使用HPLC法檢測(cè)部分產(chǎn)品CPP含量受到標(biāo)準(zhǔn)品的限制，但鑒于CPP的定性定量檢測(cè)都優(yōu)于以上方法，可以作為未來CPP檢測(cè)研究方向。

3 結(jié)論

CPP在食品工業(yè)的應(yīng)用中具有廣闊的前景，作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一具有促進(jìn)鈣吸收作用的活性肽，多用于嬰幼兒配方食品、乳制品、保健品等食品中。目前，CPP在我國(guó)還屬于新興行業(yè)，生產(chǎn)CPP原料的企業(yè)很少且尚未達(dá)到規(guī)模，檢測(cè)技術(shù)的研究也存在一定程度上的難度，從而使CPP在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到了限制。但隨著人們生活水平日益提高，在食品中添加一定量的CPP越來越會(huì)受到消費(fèi)者的重視，并將成為一種趨勢(shì)，故研究CPP的定量檢測(cè)技術(shù)在保證食品安全方面具有十分重要的意義。雖然目前國(guó)內(nèi)外CPP含量的檢測(cè)方法有很多種，但大多存在操作復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確度不高及設(shè)備昂貴等問題。而HPLC法作為一種現(xiàn)代儀器分析手段有方便、快捷、準(zhǔn)確度和靈敏度高等其他方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，在食品中CPP的定量測(cè)定中運(yùn)用日趨廣泛并得到了一些學(xué)者的認(rèn)可，可以較好的滿足CPP含量的測(cè)定需要，所以只要對(duì)阻礙HPLC法發(fā)展的適于不同食品測(cè)定的CPP標(biāo)準(zhǔn)品加以開發(fā)利用，則可作為未來研究開發(fā)食品中統(tǒng)一的CPP檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展方向。