合江佛手兩種香豆素含量測定及指紋圖譜研究

劉盼，雷素娟，何兵，田吉，*

（1.西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000）

佛手，為蕓香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥成熟果實[1]，又稱佛手柑、五指橘、五指柑等。據(jù)《本草綱目》[2]記載，佛手柑“下氣，除心頭痰水；煮酒飲，治痰多咳漱；煮湯，治心下氣痛?！狈鹗炙幨惩矗米魉幉耐?，經(jīng)加工還可制成多種保健食品（如蜜餞、果脯等）及保健飲料（如佛手茶、佛手蜜、佛手酒等）[3]。佛手主要成分為香豆素、黃酮類揮發(fā)油及橙皮苷等[4-6]，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗氧化[7]、抗抑郁[8]、祛痰平喘[9]、抗腫瘤及抗HIV活性[10-11]等多種作用。

在中國藥典2015版佛手項下收載了以藥材為對照的薄層鑒別、醇溶性浸出物和橙皮苷的含量測定項，而佛手中的另一類特征性香豆素類化合物卻未得到體現(xiàn)。近年來佛手在國內(nèi)外市場的需求量日益增大，但因藥材種類較多，來源復(fù)雜，造成目前品種混亂、質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)象?，F(xiàn)國內(nèi)佛手主流品種為廣佛手（廣州產(chǎn)）、川佛手（四川產(chǎn)）及金佛手（浙江產(chǎn)）[12-13]。四川省合江縣是川佛手的歷史產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量曾達到全省15%，是川佛手的重要組成部分。綜合評價合江佛手質(zhì)量，對于川佛手的質(zhì)量控制具有重要意義。為保證臨床用藥的準確性和安全性，提高佛手藥材的質(zhì)量控制標準，以四川合江產(chǎn)佛手為主要研究對象，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），同時測定合江佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素的含量，并建立合江佛手的HPLC指紋圖譜。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安（P680A）高效液相色譜儀（含四元泵，PDA-100二極管陣列檢測器，TCC-100柱溫箱，Chromeleon色譜工作站）：Dionex Softron GmbH；AS7240A超聲清潔機：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；XR 205SM-DR電子天平：瑞士Precisa公司。

1.2 試劑

5，7-二甲氧基香豆素對照品（批號：00003666-2423，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測純度在98%以上）：美國ChromaDex.Inc；6，7-二甲氧基香豆素對照品（批號：111740-200501，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測純度在98%以上）：中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純）：上海星可生化有限公司；水為重蒸餾水。

1.3 原料

原料來源見表1，所有原料經(jīng)西南醫(yī)科大學藥學院莊元春副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥成熟果實。

表1 佛手產(chǎn)地來源Table 1 The source information of FCS

2 方法與結(jié)果

2.1 5，7-二甲氧基香豆素與6，7-二甲氧基香豆素的含量測定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Besil C18-B（5 μm 250 mm×4.6 mm）；流動相：A-乙腈，B-水，梯度洗脫條件：0～11 min，B（55%），11 min～15 min，B（55%～5%），15 min～16 min，B（5%～55%），16 min～22 min，B（55%）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：326 nm；柱溫：30℃。在選定色譜條件下，佛手中5，7-二甲氧基香豆素峰、6，7-二甲氧基香豆素峰與其前后色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于4 000。同時取乙腈進樣，結(jié)果表明溶劑無干擾。對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）及樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substances（A）and sample（B）

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱定佛手樣品1 g，置錐形瓶中，依次加入50 mL、30 mL 75%甲醇，超聲 30 min，放冷過濾，合并兩次濾液，水浴蒸干，殘渣加入乙腈定容至10 mL。

2.1.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取5，7-二甲氧基香豆素及6，7-二甲氧基香豆素對照品適量，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻即得對照品儲備液（5，7-二甲氧基香豆素：0.534 mg/mL，6，7-二甲氧基香豆素：0.572 mg/mL）。精密量取5，7-二甲氧基香豆素貯備液1 mL及6，7-二甲氧基香豆素貯備液0.1 mL，加乙腈定容到5 mL，即得混合對照品溶液。（每1 mL含6，7-二甲氧基香豆素0.011 44 mg，5，7-二甲氧基香豆素0.106 8 mg）。

2.1.4 線性與范圍

精密量取2.1.3項下2種對照品儲備液，加乙腈制備出6份混合對照品溶液，每1 mL分別含5，7-二甲氧基香豆素 0.013 35、0.026 7、0.053 4、0.106 8、0.213 6、0.427 2 mg，含 6，7-二甲氧基香豆素 0.001 43、0.002 86、0.005 72、0.011 44、0.022 88、0.045 76 mg。分別精密吸取各濃度對照品溶液10 μL進樣，按2.1.1項下方法測定峰面積，以峰面積值A(chǔ)對進樣量C（μg）進行回歸，得出下列標準曲線方程。結(jié)果表明，6，7-二甲氧基香豆素進樣量在 0.014 3 μg～0.457 6 μg 范圍內(nèi)，5，7-二甲氧基香豆素進樣量在 0.133 5 μg～4.272 μg范圍內(nèi)，與峰面積值線性關(guān)系良好。

6，7-二甲氧基香豆素：A=23.688C+0.070 7，r=0.999 6；

5，7-二甲氧基香豆素：A=71.803C+2.206 8，r=0.999 9。

2.1.5 精密度試驗

精密量取混合對照品溶液（每1 mL含6，7-二甲氧基香豆素 0.01144mg，5，7-二甲氧基香豆素 0.1068mg）10 μL，重復(fù)進樣6次，測定兩香豆素峰面積值。結(jié)果5，7-二甲氧基香豆素與6，7-二甲氧基香豆素RSD分別為0.74%、1.48%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品佛手1#，照2.1.2項下方法制備6份供試品溶液，依次進樣10 μL，測定兩香豆素峰面積值并計算含量。結(jié)果5，7-二甲氧基香豆素與6，7-二甲氧基香豆素RSD分別為2.57%、2.72%，均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，室溫放置，分別在 0、1、2、4、8、10、24 h 進樣 10 μL，測定兩香豆素的峰面積值。結(jié)果5，7-二甲氧基香豆素與6，7-二甲氧基香豆素RSD分別2.19%、2.89%，均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的佛手樣品1#（分別含5，7-二甲氧基香豆素及6，7-二甲氧基香豆素0.092%、0.011%）9份，每份約0.5 g，分為三組，每組分別精密添加5，7-二甲氧基香豆素貯備液（0.534 mg/mL）0.7、0.85、1 mL，以及6，7-二甲氧基香豆素對照品儲備液（0.0572mg/mL）1.6、2、2.4 mL，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，照2.1.1項下條件進行測定，并以下式計算回收率。試驗結(jié)果表明，本法具有良好的回收率。結(jié)果見表2和表3。

表2 樣品中5，7-二甲氧基香豆素回收率試驗測定結(jié)果（n=9）Table 2 Recoveries of 5，7-dimethoxycoumarin in samples（n=9）

表3 樣品中6，7-二甲氧基香豆素回收率試驗測定結(jié)果（n=9）Table 3 Recoveries of 6，7-dimethoxycoumarin in samples（n=9）

2.1.9 含量測定

取10批合江佛手及其它產(chǎn)地佛手樣品，照2.1.2項下制備供試品溶液。分別精密量取混合對照品溶液和供試品溶液10 μL，照2.1.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表4。

表4 含量測定結(jié)果（n=2）Table 4 Content determination（n=2）

續(xù)表4 含量測定結(jié)果（n=2）Continue table 4 Content determination（n=2）

2.2 合江佛手HPLC指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Besil C18-B（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：A-乙腈，B-水，梯度洗脫條件：0～20 min，B（85%～30%），20 min～21 min，B（30%～10%），21 min～30 min，B（10%）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：326 nm；柱溫：30℃。在選定色譜條件下，佛手中5，7-二甲氧基香豆素峰與其前后色譜峰的分離度大于1.5，理論板數(shù)大于4 000。

2.2.2 供試品溶液的制備

按照2.1.2項下方法制備供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備

精密量取5，7-二甲氧基香豆素對照品儲備液1 mL，置5 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻即得（每1 mL含5，7-二甲氧基香豆素0.010 68 mg）。

2.2.4 精密度試驗

取佛手1#制成6份供試品溶液，照2.2.1項下條件連續(xù)進樣6次，測得其共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗

取佛手1#樣品制成6份供試品溶液，依次進樣10 μL，測得各共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均小于3%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取佛手1#供試品溶液在室溫下依次放置0、1、2、4、8、10、24 h 后進樣 10 μL，照 2.2.1 項下條件進行測定，測得各共有峰的相對保留時間及相對峰面積均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 合江佛手指紋圖譜的建立

將10批合江佛手（1#～10#）指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本），選擇S10為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，以5，7-二甲氧基香豆素峰為參照（S）進行多點校正，并生成合江佛手藥材原料指紋對照圖譜。見圖2、圖3。

圖2 5，7-二甲氧基香豆素對照品（A）及10批合江佛手原料（B）指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of reference substance（A）and 10 batches of FCS from Hejiang（B）

圖3 合江佛手藥材原料對照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprint of FCS from Hejiang

2.2.8 共有峰的標定

采用相對保留時間標定共有峰。據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》規(guī)定：單峰面積占總峰面積小于10%的共有峰，峰面積比值不作要求，但必須標定相對保留時間。10批合江佛手指紋圖譜中除5，7-二甲氧基香豆素參照峰外，其余峰面積均較小，不足總峰面積的10%，故僅標定共有峰的相對保留時間。將合江佛手原料的指紋圖譜進行匹配后，得12個共有峰，以5，7-二甲氧基香豆素色譜峰（S峰）的保留時間為1，計算各共有峰的相對保留時間。見表5。

表5 各共有峰相對保留時間Table 5 Relative retention time of common peaks

2.2.9 相似度計算

將10批合江佛手色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本）進行自動匹配，生成對照圖譜，系統(tǒng)將每批原料與對照圖譜進行相似度計算。另依次導(dǎo)入其余產(chǎn)地佛手指紋圖譜，以合江佛手原料對照指紋圖譜為參照圖譜，計算其余產(chǎn)地佛手與其的相似度。結(jié)果見表6、表7。

表6 合江佛手相似度Table 6 Similarity results of FCS from Hejiang

表7 不同產(chǎn)地佛手與合江佛手相似度Table 7 Similarity results of FCS in different areas

3 討論

已有的研究對廣佛手，金佛手的報道較多，從成分分析、含量測定到指紋圖譜均有涉及[14-18]，而川佛手研究相對較少，合江佛手的質(zhì)量標準及指紋圖譜研究目前還未見報道。中藥指紋圖譜具有整體性與模糊性的特點，本文采用HPLC法，將含量測定與指紋圖譜兩種分析方法相結(jié)合，即定量與定性的結(jié)合，能更全面地評價合江佛手，為其栽培和質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

3.1 含量測定結(jié)果分析

佛手中香豆素的主要成分為5，7-二甲氧基香豆素[16]，故選擇其作為含量測定的對照品和指紋圖譜的S峰。10批合江佛手的含量測定結(jié)果表明，5，7-二甲氧基香豆素的含量在0.059%～0.093%之間，變動幅度不大，可以作為佛手的含量測定指標，而6，7-二甲氧基香豆素含量在0%～0.006 4%之間，含量太低，變動較大，可為佛手質(zhì)量提供參考，但不宜作為質(zhì)控指標。各產(chǎn)地5，7-二甲氧基香豆素的含量有較明顯的差異，合江產(chǎn)地含量較高，云南產(chǎn)地含量較低，6，7-二甲氧基香豆素因變動較大看不出明顯差異。

3.2 指紋圖譜相似度結(jié)果分析

10批合江佛手原料與對照圖譜的相似度均在0.9以上，說明各批樣品之間差異不明顯，質(zhì)量較穩(wěn)定。各產(chǎn)地佛手與合江佛手間有顯著的差異，其中浙佛手與之相似度最低，為0.623～0.690；兩川產(chǎn)佛手（沐川、石棉）及廣佛手與合江佛手相似度相對較高，表明建立的指紋圖譜具有一定的代表性與實用性。

3.3 檢測波長的選擇

以5，7-二甲氧基香豆素，6，7-二甲氧基香豆素進樣，采用二極管陣列檢測器掃描，選擇了205、326、350 m 3個波長測定，結(jié)果在326 nm波長下峰形和分離度較好，故檢測波長選擇326 nm。

3.4 流動相的選擇

曾考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水等體系，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化調(diào)整后采用梯度洗脫條件，乙腈-水作為流動相的色譜圖分離效果最佳。

3.5 供試品的制備

試驗曾考察了不同濃度甲醇（25%、50%、75%、100%）的提取效果，在提取方式方面比較了超聲、回流提取及氯仿萃取等，最終發(fā)現(xiàn)以75%甲醇超聲提取兩次，每次30 min的樣品溶液峰面積較高且峰形較好。試驗還發(fā)現(xiàn)浸泡時間對提取率幾無影響。