鞘內注射IGFBP-3慢病毒載體緩解大鼠骨癌痛的實驗研究

顧本進，秦寶瑩，倪俊林，陳 誠，丁 健

（如皋市人民醫(yī)院骨科，江蘇226500）

癌癥轉移最常見的部位之一是骨骼,據(jù)統(tǒng)計30%以上晚期癌癥患者發(fā)生骨轉移,尤其常見于肺癌、前列腺癌及乳腺癌。骨轉移誘導的疼痛稱為骨癌痛（cancer-inclued bone pain,CIBP）,是癌痛中最常見、最劇烈且難以控制的疼痛,嚴重影響患者的生活質量。目前治療骨癌痛的方法有限,盡管世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥疼痛治療指南推薦“三階梯療法”,但仍有約45%患者骨癌痛未得到有效控制。進一步深入研究骨癌痛機制,尋找新的更有效緩解骨癌痛的靶點,具有重要的臨床意義。

大鼠骨癌痛模型能模擬人類骨癌痛的疼痛學行為,有助于骨癌痛發(fā)病機制及治療的研究。骨癌痛是獨特的疼痛類型,包含炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛成分,但又不是兩者簡單的總和。骨轉移癌時破骨細胞破壞骨質增加,同時激活的成骨細胞釋放Ⅰ型胰島素樣生長因子（insulin 1ike growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ）,IGF-Ⅰ通過其受體介導的信號傳導通路,致使外周神經(jīng)纖維辣椒素受體（TRPV1）上調,TRPV1能整合誘發(fā)痛覺的化學和熱刺激信號,導致骨癌痛的發(fā)生。血清類胰島素生長因子結合蛋白-3（IGFBP-3）與IGF-1的親和力高于IGF-1與其受體的親和力,推測骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion,DRG）細胞內IGFBP-3可以通過與IGF-1受體競爭,阻滯IGF-1與受體結合,從而緩解骨癌痛。本實驗通過建立大鼠骨癌痛模型,采用von Frey測痛儀測量大鼠機械性痛反應閾值,探討鞘內注射IGFBP-3過表達慢病毒后大鼠痛閾的變化,為臨床緩解骨癌痛探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只健康雌性SD大鼠（南通大學實驗動物中心提供）,體重160～210 g。飼養(yǎng)的條件：飼養(yǎng)室室溫（22±2）℃,濕度 40%～60%,通風良好,大鼠自由進食、飲水。隨機分為骨癌痛組、假手術組、IGFBP3慢病毒載體治療組、空載慢病毒對照組。

1.2 實驗材料和儀器 麻醉用乙醚,水合氯醛,電動剃刀,醫(yī)用生理鹽水,手術用顯微器材（上海市手術器械廠）,25 μL、10 μL 微量移液器（鎮(zhèn)海玻璃儀器廠）,吸頭,醫(yī)用防護鏡（美康）,5 mL無菌注射器,醫(yī)用膠水1.0mL（科峰醫(yī)療器械有限公司）,醫(yī)用縫合絲線（科峰醫(yī)療器械有限公司）,癌細胞株Walker256（上海博格隆生物）。IGFBP3過表達慢病毒（滴度109TU·mL-1）及空載慢病毒（上海吉瑪制藥技術有限公司）。vonFreyfilament全套機械疼痛測定細絲（天津醫(yī)工所）,有機玻璃觀察箱（120 cm×25 cm×35 cm）,細鐵絲網(wǎng)格操作平臺。

1.3 骨癌痛模型建立 實驗前將大鼠放置于行為實驗架和盒子中適應3天,每天1～2小時。大鼠吸入乙醚麻醉,取仰臥位,剃刀剃除左側脛骨近端毛發(fā),碘伏消毒。在脛骨近端作長約0.5 cm切口,撐開皮膚切口顯露脛骨近端。用粗針頭（5號注射器）向下斜向旋轉穿刺進入骨髓腔,換用微量注射器將10 μL Walker 256乳腺癌細胞懸液（2×107細胞）沿穿刺孔緩慢注射,骨蠟封閉穿刺孔,縫合傷口。假手術組大鼠按照上述方法注射10 μL生理鹽水于骨髓腔。

1.4 實驗動物鞘內注射[1]癌痛大鼠吸入乙醚麻醉,取俯臥位,背側皮膚剃毛、碘伏消毒,選擇腰5/腰6椎間隙穿刺進針,進入蛛網(wǎng)膜下腔時有“落空”感,能回抽出清亮的腦脊液,注入IGFBP3慢病毒4 μL?？蛰d慢病毒對照組鞘內注入相同容量的慢病毒。待其自然蘇醒后在正常環(huán)境中適應10 min,進行痛敏閾值檢測,然后選不同時間點進行疼痛行為學檢測。

1.5 大鼠機械痛閾檢測

1.5.1 實驗動物篩選：大鼠對機械痛的刺激行為反應存在個體差異,在正式實驗前應篩選疼痛行為反應相當?shù)拇笫?。采用von Frey filament機械痛測量細絲進行痛閾測定,選用粗細不同的測量細絲以垂直方向針刺大鼠腳掌皮膚,根據(jù)大鼠抬足、舔足等行為進行判定。根據(jù)Chaplan等[2]報道,測定大鼠痛閾采用“up and down”方法。von Frey細絲（1 g～26 g）觸壓大鼠患肢腳掌中心部,漸進加力直至測量細絲折曲超過原有長度1 cm為止,每間隔5～10 s進行下一次,反復5次,5次中如果大鼠出現(xiàn)3次或以上抬足、舔足等行為即可判定為陽性,表明大鼠對這一強度的細絲機械性刺激敏感。如果大鼠無反應,則采用克數(shù)較大的下一級細絲重復實驗,每次實驗間隔至少15秒,直到大鼠出現(xiàn)抬足、舔足等陽性反應。當大鼠出現(xiàn)陽性反應時,換上一級克數(shù)較小的細絲再次進行實驗。整個過程重復5次,大鼠機械性痛敏閾值即為誘發(fā)大鼠出現(xiàn)陽性結果的最低von Frey纖維絲力度。記錄最后的filament,按表1換算機械痛閾值（見表1）。去除與樣本均數(shù)相差大的大鼠,選用疼痛行為相當?shù)拇笫筮M行正式實驗。

表1 纖維細絲刺激機械痛閾值換算表

1.5.2 機械痛閾檢測：在大鼠接種腫瘤細胞前1天、接種后第7天、14天、21天,采用von Frey測痛儀測量大鼠左后肢的機械性痛反應閾值,方法同上。

1.6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示,組間差異性比較采用t檢驗,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 接種后各組模型大鼠的體征和行為表現(xiàn) 接種后2～3天,大鼠外觀、行為等方面無明顯異常。接種后第4～5天,假手術組大鼠能正常攝食,動作迅捷,體重增長較快,但接種癌細胞的大鼠逐漸攝食量減少、步行緩慢,體重不再增加,行走時患肢有避免負重等現(xiàn)象。接種后14天,腫瘤接種組大鼠體重明顯減輕,毛色嵴沉,反應遲鈍,神情呆滯,患側腿輕碰觸即可誘發(fā)躲避等疼痛表現(xiàn)。3周左右接種癌細胞組大鼠的狀態(tài)很差,精神萎靡,對外界刺激反應遲鈍,患肢常懸空,局部腫脹明顯,行走時基本不肯著地或拖行,此時大鼠開始出現(xiàn)死亡。

2.2 放射影像學檢查 造模成功第1天行X線攝片,提示骨癌痛組大鼠脛骨近端骨組織未見明顯的病理性改變,但周圍組織密度增高,提示周圍軟組織腫脹可能。造模成功第14天、21天時,X線檢查可見脛骨近端骨質密度不均勻,有骨膜反應,嚴重者見周圍骨質破壞,軟組織腫脹,部分大鼠甚至出現(xiàn)脛骨近端病理性骨折。而假手術組在術后第7天、14天、21天X線影像學檢查均無明顯異常改變。

2.3 腫瘤細胞接種后大鼠機械痛閾值變化 接種前、接種后第1天、3天、5天,四組大鼠機械性痛敏痛閾值相似。接種后第7天,骨癌痛組、IGFBP3慢病毒治療組、空載慢病毒對照組大鼠的機械性痛敏閾值開始下降,第10天顯著降低,三組大鼠機械性痛敏閾值相似。假手術組機械性痛敏閾值術前、術后無明顯變化。骨癌痛組大鼠隨著時間的延長,機械性痛敏閾值逐漸下降,接種后10天、14天、21天與假手術組比較,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 假手術組與骨癌組大鼠不同時間點的機械痛閾值比較 g

2.4 鞘內給藥后機骨癌大鼠械痛閾值變化 鞘內IGFBP3慢病毒后,IGFBP3慢病毒治療組大鼠機械性痛敏閾值升高,14天和21天分別為9.8±1.6 g和7.68±1.1 g,高于空載慢病毒組的4.8±2.3 g和3.9±0.98 g,差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 IGFBP3慢病毒治療組不同時間機械性痛敏閾值變化

3 討 論

骨癌痛已成為困擾晚期癌癥患者最常見的并發(fā)癥之一,往往隨著病情發(fā)展逐漸加重,患者的生活質量受到嚴重影響。目前對骨癌痛的治療手段目前仍然有限,對骨癌痛的發(fā)生機制尚不甚明確。

研究表明,腫瘤主要由腫瘤細胞及其基質細胞組成,分泌能敏化或直接興奮初級傳入神經(jīng)元的多種細胞因子。近年來研究發(fā)現(xiàn)辣椒素受體能夠整合誘發(fā)痛覺的化學和熱刺激信號[3-5],辣椒素受體（transient receptor potential vanilloid subfamily member 1,TRPV1）是一種表達于傷害感受器上的配體門控非特異性陽離子通道,廣泛分布于背根神經(jīng)節(jié)等中小型神經(jīng)元中,在骨癌痛中正是這些初級神經(jīng)元介導傷害信息的傳入而導致疼痛。許多研究表明,辣椒素受體可以感受多種內、外源性理化刺激,如辣椒素、低pH環(huán)境、超過43℃溫度、內源性大麻素及其他炎癥介質,并將這些傷害性刺激傳送至中樞[6],辣椒素受體參與炎性痛、神經(jīng)病理疼痛和骨癌痛的發(fā)生機制。

另一方面,在骨轉移癌發(fā)生時,破骨細胞破壞骨質增加,同時成骨細胞也被激活,激活的成骨細胞釋放IGF-1增加,IGF-1與受體結合,激活酪氨酸激酶,啟動下游的Ras蛋白激酶、絲裂原蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇 3激酶（PI（3）K）等一系列酶促反應,通過不同信號傳導通路上調外周神經(jīng)纖維上TRPV1受體,從而加劇骨癌痛[7-15]。由于胰島素樣生長因子結合蛋白-3（IGFBP-3）與IGF-1結合力遠高于IGF-1與其受體的結合力[16-17],循環(huán)中約75%IGFBP-3與IGF-1結合,阻止IGF-1與其受體結合。GFBP-3通過競爭性結合,抑制IGF-1在骨癌痛中加劇效應,從而發(fā)揮緩解疼痛的作用。

本實驗結果顯示,經(jīng)脛骨近端注射乳腺癌腫瘤細胞株能成功建立骨癌痛大鼠模型；接種腫瘤細胞后行為學表現(xiàn)、影像學檢查、行為學檢測證實骨癌痛大鼠模型是成功的。癌痛大鼠鞘內注射IGFBP-3慢病毒載體,通過人為調高IGFBP-3蛋白含量后,和空載慢病毒對照組比較,其機械性刺激痛敏反應閾值明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時在造模成功第14天、21天給予鞘內注射給藥后在不同時間段測痛敏閾值,發(fā)現(xiàn)在給藥2 h后IGFBP-3慢病毒載體組癌痛大鼠的痛敏閾值到達最高峰,隨著注射后時間的延長,其痛敏閾值漸漸降低,但在給藥6h后仍較對照組明顯提高,具有統(tǒng)計學的意義,其痛敏閾值在給藥8 h后漸漸恢復至給藥前的水平,結合行為學研究,說明鞘內注射IGFBP-3慢病毒載體后,IGFBP-3可以通過競爭性抑制IGF-1活性緩解骨癌痛引起的疼痛。在14天、21天鞘內重復給予IGFBP-3慢病毒載體,仍然反復出現(xiàn)以上實驗骨癌痛大鼠的痛敏閾值轉變情況,但是在第21天鞘內給藥和第14天比較其痛敏閾值上調的程度有所降低,原因考慮可能和骨癌痛繼續(xù)進展及產生IGFBP-3慢病毒載體的藥物耐受有關。

綜上所述,經(jīng)脛骨注射Walker 256腫瘤細胞株可以成功建立穩(wěn)定的大鼠骨癌痛模型,背根神經(jīng)節(jié)水平的IGFBP-3可能參與骨癌痛的發(fā)生機制,IGFBP-3通過競爭性抑制IGF-1活性可以緩解大鼠骨癌痛。