NOX1在TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷和炎癥中的作用研究*

葉 茂, 周偉超， 黃潤(rùn)英， 徐 楊

(1雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科， 四川 雅安 625000； 2宜賓市第二人民醫(yī)院兒科， 四川 宜賓 644000； 3樂山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 四川 樂山 614000)

肺泡上皮細(xì)胞損傷與急性呼吸窘迫綜合征等疾病發(fā)生有關(guān)，炎癥是肺泡上皮細(xì)胞損傷發(fā)生的重要原因，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在急性呼吸窘迫綜合征患者肺泡灌洗液中的含量升高，TNF-α也是啟動(dòng)炎癥和放大炎癥的關(guān)鍵因子[1-2]。NADPH氧化酶1(NADPH oxidase 1, NOX1)是NOX蛋白家族的成員，可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)自由基的形成，在不同的組織中有不同程度的表達(dá)，在上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中存在一定程度的表達(dá)，而在子宮和前列腺等組織中的表達(dá)水平較低[3-5]。NOX1與肺病、心血管系統(tǒng)疾病和腫瘤等疾病有關(guān)，不僅參與組織氧化損傷，還與組織中的炎癥反應(yīng)有關(guān)[6-8]。本實(shí)驗(yàn)用TNF-α處理肺泡上皮細(xì)胞模擬肺部炎癥病理?xiàng)l件，探討NOX1在TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥和氧化損傷中的作用，為明確急性呼吸窘迫綜合征肺泡上皮細(xì)胞損傷機(jī)制提供參考。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺泡上皮細(xì)胞A549購(gòu)自ATCC；總RNA提取試劑盒和real-time PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；本次實(shí)驗(yàn)所用引物均由南京金斯瑞公司合成；NOX1 siRNA(si-NOX1)及其陰性對(duì)照(siRNA negative control, si-NC)由上海吉?jiǎng)P公司合成；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自Sigma；白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)含量測(cè)定試劑盒和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司；抗cleaved caspase-3和NOX1抗體購(gòu)自CTS；重組人TNF-α購(gòu)自Sigma。TNF-α配制方法：10 μg的重組人TNF-α溶解于100 μL的去離子水中，濃度為0.1 g/L，分裝成10管，保存在-70 ℃，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成含10 μg/L TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液。

2 方法

2.1TNF-α誘導(dǎo)后肺泡上皮細(xì)胞中NOX1的mRNA表達(dá)檢測(cè) 以real-time PCR檢測(cè)TNF-α處理后肺泡上皮細(xì)胞中NOX1 mRNA水平。取A549細(xì)胞，用含有0和10 μg/L的TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液處理，分別記為對(duì)照(control,Con)組和TNF-α組(10 μg/L的TNF-α劑量參照文獻(xiàn)[9])。培養(yǎng)48 h以后，以TRIzol試劑以常規(guī)方法提取各組肺泡上皮細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，real-time PCR檢測(cè)NOX1水平。PCR體系為20 μL，包括：10 μL的2×Ultra SYBR Mixture，1 μL的cDNA，8 μL的RNase-free H2O，上、下游引物各0.5 μL。β-actin的上游引物序列為5’-CCAGGGGCGTTATGGTAGGCA-3’，下游引物序列為5’-TTCCATATGCTCCCAGTTGGT-3’；NOX1的上游引物序列為5’-CCGCACAGTGAGAAAGCAAT-3’，下游引物序列為5，-CTGCAGAGAATGGAGGAAG-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.2TNF-α誘導(dǎo)后肺泡上皮細(xì)胞中NOX1蛋白表達(dá)檢測(cè) 以Western blot檢測(cè)TNF-α處理后肺泡上皮細(xì)胞中NOX1蛋白表達(dá)水平。A549細(xì)胞經(jīng)0和10 μg/L的TNF-α處理以后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，以1 000×g離心10 min后，將上清液吸除，在細(xì)胞中加入PBS重懸細(xì)胞2次，在細(xì)胞沉淀中加入單去污裂解液，放在冰上裂解液60 min后，期間每隔10 min超聲1次，吸取上清，保存在-80 ℃。以12%的分離膠、5%的濃縮膠進(jìn)行蛋白電泳，每個(gè)孔中上樣量為50 μg，調(diào)節(jié)電壓為80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入到凝膠的下端1 cm以后，把電源關(guān)閉，取出凝膠。以15 V電壓將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜的時(shí)間為45 min。用5%的脫脂奶粉在室溫中孵育2.5 h以后，再用1∶600稀釋的Ⅰ抗在4 ℃中雜交過(guò)夜，與1∶4 000稀釋的Ⅱ抗在室溫雜交1.5 h?；瘜W(xué)發(fā)光以后，在暗室中壓片，顯影并定影以后，掃描圖片，分析各條帶的灰度值，用各條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.3細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞分為Con組、TNF-α組、si-NC組和si-NOX1組，其中Con和TNF-α組細(xì)胞處理方法同2.1，si-NC和si-NOX1組分別為轉(zhuǎn)染si-NC和si-NOX1后12 h的A549細(xì)胞經(jīng)10 μg/L的TNF-α誘導(dǎo)處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟如下：A549細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)濃度為70%時(shí)，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸除，將si-NC和si-NOX1同Lipofectamine 2000稀釋混合以后，加入到細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h以后，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換，以real-time PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中NOX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，步驟同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.4細(xì)胞中MDA含量和SOD活性檢測(cè) Con、TNF-α、si-NC和si-NOX1組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，收集各組細(xì)胞，分別以硫代巴比妥酸法檢測(cè)細(xì)胞中MDA水平，黃嘌呤氧化法檢測(cè)細(xì)胞中SOD水平，步驟均參照試劑盒說(shuō)明書。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.5細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6和IL-1β水平檢測(cè) Con、TNF-α、si-NC和si-NOX1組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，以ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-4、IL-6和IL-1β含量，步驟同試劑盒說(shuō)明書。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.6細(xì)胞凋亡檢測(cè) Con、TNF-α、si-NC和si-NOX1組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，以Annexin V-FITC和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。收集細(xì)胞，每個(gè)樣品約含有1×106個(gè)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS把細(xì)胞洗滌3次以后，2 000×g離心10 min。將上清溶液吸掉，添加500 μL的Binding Buffer混合以后，依次添加5 μL的Annexin V-FITC和PI，混合以后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平，步驟同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件分析，計(jì)量資料用(mean±SD)表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞中NOX1表達(dá)

肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α誘導(dǎo)以后，細(xì)胞中的NOX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)NOX1,見圖1。

Figure 1.TNF-α induced NOX1 expression in alveolar epithelial cells. A: quantitative results of NOX1 mRNA in alveolar epithelial cells; B: Western blot was used to detect the expression level of NOX1 protein in the cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group.

圖1TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞中NOX1表達(dá)

2 轉(zhuǎn)染NOX1 siRNA下調(diào)肺泡上皮細(xì)胞中NOX1表達(dá)

在肺泡上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NOX1 siRNA后，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)，細(xì)胞中的NOX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明NOX1 siRNA可以沉默肺泡上皮細(xì)胞中NOX1的表達(dá),見圖2。

Figure 2.Reduced expression of NOX1 in cells after transfection of siRNA. A: quantitative results of NOX1 mRNA in alveolar epithelial cells; B: Western blot was used to detect the expression level of NOX1 protein in cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

圖2siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中NOX1表達(dá)水平降低

3 沉默NOX1減輕TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷

TNF-α處理后的肺泡上皮細(xì)胞中MDA水平升高，SOD活性降低(P<0.05);而沉默NOX1后的肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)，細(xì)胞中的MDA水平降低，SOD活性升高(P<0.05)，說(shuō)明沉默NOX1可以減輕TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷，見圖3。

Figure 3.Silencing ofNOX1 reduced the oxidative damage induced by TNF-α in alveolar epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;&P<0.05vsTNF-α group.

圖3沉默NOX1可以減輕TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷

4 沉默NOX1減少TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞分泌IL-4、IL-6和IL-1β

TNF-α處理以后的肺泡上皮細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6和IL-1β水平升高(P<0.05)，沉默NOX1后的肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)以后，細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6和IL-1β水平降低(P<0.05)，說(shuō)明沉默NOX1可以減少TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子分泌，見圖4。

Figure 4.Silencing ofNOX1 reduced the secretion of IL-4, IL-6 and IL-1 by TNF-α-induced alveolar epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;&P<0.05vsTNF-α group.

圖4沉默NOX1減少TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞分泌IL-4、IL-6和IL-1β

5 沉默NOX1減少TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡

TNF-α處理后的肺泡上皮細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05);沉默NOX1后的肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，說(shuō)明沉默NOX1可以減少TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,見圖5。

討 論

肺泡上皮細(xì)胞損傷是急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生的重要原因之一，而細(xì)胞炎癥和氧化損傷是肺泡上皮細(xì)胞損傷發(fā)生的基礎(chǔ)，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞在維持肺泡正常功能、分化、維持肺泡內(nèi)外體液平衡等中具有重要作用,A549細(xì)胞是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞來(lái)源的癌細(xì)胞系，也是常用的體外研究肺泡上皮細(xì)胞模型[10]。存在于革蘭氏陰性菌表面的脂多糖可以特異性的識(shí)別中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞膜上的受體，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎癥因子如TNF-α，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，這些炎癥因子會(huì)損傷周圍的正常細(xì)胞，最終誘導(dǎo)急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生[11-12]。研究表明，TNF-α在急性呼吸窘迫綜合征患者的肺泡灌洗液中含量升高，TNF-α是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其可以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷[13-14]。

TNF-α不僅參與炎癥反應(yīng)，還參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激過(guò)程，其可以誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，誘導(dǎo)氧化損傷[15]。肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷是急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)病機(jī)制之一，正常情況下，機(jī)體內(nèi)有低水平的氧自由基存在，這些氧自由基參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化平衡的維持，在病理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)的氧自由基大量積累，氧自由基清除劑SOD的活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，而脂質(zhì)是細(xì)胞膜的主要成分之一，其過(guò)氧化后可以產(chǎn)生大量的MDA[16-17]。在生物進(jìn)化中，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激應(yīng)相對(duì)協(xié)調(diào)，既可有效清除抗原，又使炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激維持在合理水平，減少組織細(xì)胞的損傷。如打破炎癥與氧化應(yīng)激的平衡，將對(duì)生物機(jī)體造成巨大的損傷,炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，氧化應(yīng)激損傷往往與炎癥失衡同時(shí)出現(xiàn)[18]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，TNF-α可以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生MDA，降低細(xì)胞中SOD活性，促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-4、IL-6和IL-1β炎癥因子，這與以前的實(shí)驗(yàn)報(bào)道相符合，提示TNF-α可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷和炎癥造成肺泡上皮細(xì)胞損傷[13-15]。

Figure 5.Silencing ofNOX1 reduced TNF-α-induced apoptosis of alveolar epithelial cells. A: flow cytometry was used to determine the results of cell apoptosis; B:Western blot was used to detect the level of apoptotic marker protein cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;&P<0.05vsTNF-α group.

圖5沉默NOX1減少TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡

Caspase-3是caspase蛋白家族的成員，其位于凋亡反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其活化水平升高后不可逆地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。正常細(xì)胞在受到氧化應(yīng)激或者炎癥因子的刺激以后，可以激活細(xì)胞內(nèi)caspase凋亡反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-20]。急性呼吸窘迫綜合征患者中肺泡上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡，TNF-α可以在體外誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生，TNF-α是常用的體外模擬急性呼吸窘迫綜合征病理?xiàng)l件下肺泡上皮細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)因子[21]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，TNF-α處理后的肺泡上皮細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中活化的caspase-3水平升高，這與上述研究結(jié)果相符合，說(shuō)明TNF-α能夠通過(guò)促進(jìn)caspase-3活化發(fā)揮肺泡上皮細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用。

NOX1基因定位于X染色體q22上，其編碼的蛋白質(zhì)含有564個(gè)氨基酸，在結(jié)腸上皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞等細(xì)胞中均有表達(dá)[22]。NOX1與細(xì)胞內(nèi)氧自由基的含量有關(guān)，其是一種與細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)的基因，在腫瘤、急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征等疾病發(fā)生中有重要作用，用高濃度的氧刺激肺泡細(xì)胞，細(xì)胞中NOX1水平升高，敲除NOX1基因后的大鼠體內(nèi)氧自由基含量降低，肺泡上皮細(xì)胞凋亡減少，以上這些研究結(jié)果均顯示，NOX1可能參與肺泡上皮細(xì)胞損傷[23-25]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，TNF-α處理后的肺泡上皮細(xì)胞中的NOX1表達(dá)水平升高，而沉默NOX1可以減少TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷和炎癥因子分泌，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生，提示沉默NOX1能夠通過(guò)減輕肺泡上皮細(xì)胞炎癥損傷和氧化損傷發(fā)揮保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞的作用。

綜上所述，TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞中NOX1高表達(dá)，沉默NOX1可減輕TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥和氧化損傷，減少細(xì)胞凋亡。NOX1在急性肺損傷中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。這為以后明確急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于研究NOX1在肺泡上皮細(xì)胞損傷中的具體作用機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)沒有在原代的肺泡上皮細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，選用的是肺癌細(xì)胞A549系，在以后的實(shí)驗(yàn)中還需要在多株細(xì)胞及體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。