Apaf-1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義*

李益波, 陳冠樺, 戴岳楚， 伍慧慧, 麻懷露, 俞盛健, 梁 勇△

(1河北北方學(xué)院， 河北 張家口 075000； 2臺(tái)州學(xué)院， 浙江 臺(tái)州 318000； 3溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院， 浙江 溫州 325000； 4臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院， 浙江 臺(tái)州 318000)

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其中90%為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，最近幾十年其發(fā)病率呈總體上升趨勢(shì)[1]，在中國(guó)和美國(guó)女性中已經(jīng)成為了第5大常見(jiàn)惡性腫瘤[2-3]。盡管學(xué)界對(duì)PTC的分子機(jī)制研究不斷深入，如Notch1通路和SUMO4與PTC的發(fā)生及進(jìn)展具有相關(guān)性[4-5]，然PTC的致病原因與發(fā)展途徑迄今仍不明確。凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease-activating factor 1，Apaf-1)是細(xì)胞線粒體依賴的凋亡活動(dòng)中一個(gè)核心蛋白分子。研究表明，在黑色素瘤和前列腺癌等惡性腫瘤中Apaf-1表達(dá)下調(diào)，并被認(rèn)為是抑癌基因，其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及耐藥密切相關(guān)[6-7]，但Apaf-1在甲狀腺乳頭狀癌中的意義國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用real-time PCR、 Wes-tern blot以及免疫組化方法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌的Apaf-1的表達(dá)情況，并通過(guò)下調(diào)Apaf-1表達(dá)以檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，為PTC分子機(jī)制研究提供新的證據(jù)。

材 料 和 方 法

1 組織標(biāo)本

收集臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科2017年2～11月甲狀腺乳頭狀癌組織及相匹配的癌旁組織新鮮凍存標(biāo)本各20例、石蠟包埋的甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本63例和石蠟包埋的癌旁組織標(biāo)本60例。上述標(biāo)本均獲明確的病理學(xué)診斷。所有患者術(shù)前未接受過(guò)任何治療。其中新鮮組織樣本用于Western blot及real-time PCR檢測(cè)，男性6例，女性14例，年齡為(47.0±11.5)歲，年齡范圍為25～68歲；石蠟包埋標(biāo)本用于免疫組化檢測(cè)，男性20例，女性43例，年齡為(47.7±13.1)歲，年齡范圍為21～73歲。

2 主要儀器和試劑

Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo); 垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad);StepOne Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems);倒置熒光顯微鏡(Olympus)。人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株CGTHW-3購(gòu)于ATCC。兔抗人Apaf-1多克隆抗體購(gòu)于Abcam；兔抗人GAPDH多克隆抗體購(gòu)于杭州賢至生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于Biosharp；免疫組化DAB顯色試劑購(gòu)于北京中杉金橋生物科技有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司；TRIzol RNA提取試劑和Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen； SYBR? Premix Ex TaqTMII和PrimeScriptTMRT reagent Kit購(gòu)于TaKaRa; Apaf-1和β-actin的引物由上海杰瑞生物工程有限公司合成，序列見(jiàn)表1;Apaf-1干擾序列及陰性對(duì)照組購(gòu)于廣州市銳博生物科技有限公司。

表1 Real-time PCR引物序列

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1Real-time PCR檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中Apaf-1的mRNA表達(dá)情況 取新鮮的甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織各約35 mg，于碾缽中充分碾磨，再移入1.5 mL去酶EP管中，加入1 mL TRIzol提取總RNA，取2 μL RNA在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)RNA的濃度及A260/A280的比值，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)18S和28S 2條條帶。10 μL的cDNA合成體系含1 μg總RNA、2 μL 5×PrimeScript Buffer (for Real Time)、0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、0.5 μL Oligo dT Primer (50 μmol/L)和0.5 μL Random 6 mers (100 μmol/L)，RNase-free dH2O補(bǔ)足到10 μL，金屬浴37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s，4 ℃保存。20 μL real-time PCR體系的正、反引物終濃度均為0.4 μmol/L,包含10 μL SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2×)、0.4 μL ROX Reference Dye (50×)、2 μL DNA模板，RNase-free dH2O補(bǔ)足到20 μL。以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán);最后95 ℃ 15 s，降溫到60 ℃ 1 min，再升溫到95 ℃ 15 s。將收集到的熒光信號(hào)進(jìn)行熔解曲線分析。結(jié)果由StepOne Real-Time PCR系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.2Western blot檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中Apaf-1的蛋白表達(dá)情況 取新鮮的甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織各約35 mg，充分碾磨后，加入約500 μL含PMSF(濃度為1 mmol/L)的Western及IP細(xì)胞裂解液提取總蛋白，在冰上放置1 h，于4 ℃、15 930×g離心10 min，取上清液，留20 μL用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，其余按上清液1/4體積加入5X的蛋白上樣緩沖液，振蕩混勻后于金屬浴100 ℃加熱5 min。SDS-PAGE的分離膠和濃縮膠濃度分別為6%和5%，每孔加樣約35 μg，恒壓跑膠，濃縮膠60 V，分離膠130 V，待目的蛋白跑到分離膠約1/3時(shí)停止電泳，用濕轉(zhuǎn)法以恒流330 mA，2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到0.45 μm孔徑的PVDF膜上。含5%牛奶的TBST溶液封閉2 h，除去封閉液，分別加含5%牛奶的TBST配制的兔抗人Apaf-1(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)3 mL，4 ℃孵育過(guò)夜?；厥誌抗，TBST洗膜每次5 min，共3次，加含5%牛奶的TBST配制的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體(1∶10 000)，室溫孵育1 h，棄II抗，TBST洗膜每次10 min，共3次。ECL顯影3 min，于凝膠成像儀中進(jìn)行自動(dòng)曝光，結(jié)果用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

3.3免疫組織化學(xué)染色 將石蠟包埋的組織以4 μm的厚度進(jìn)行連續(xù)切片，置于恒溫烤箱中70 ℃烘烤2 h，隨后依次放入2瓶二甲苯溶液各15 min，再行梯度乙醇(100%、100%、95%、90%、80%和70%)各5 min去除二甲苯。將切片置于已煮沸的枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)中高壓修復(fù)抗原，PBS洗滌,每次5 min，共3次,滴加3%的H2O2室溫靜置15 min,降低過(guò)氧化氫酶造成的非特異性背景染色，PBS洗滌,每次5 min，共3次，滴加10%山羊血清封閉20 min，將玻片水平放置于濕盒中，滴加Apaf-1抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌,每次5 min，共3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育30 min，PBS洗滌每次5 min，3次，滴加DAB顯色劑，于顯微鏡下觀察染色情況，用自然水沖洗15 min，蘇木精復(fù)染2 min，依次放入梯度乙醇(70%、80%、90%、95%、100%和100%)各2 min脫水，于二甲苯中進(jìn)行透明處理，用中性樹(shù)膠封片，置于熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果并拍照分析。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)Carcangiu半定量方法[8]，以陽(yáng)性細(xì)胞所占視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比和細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(×40)，每個(gè)視野500個(gè)細(xì)胞，總共2 500個(gè)，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比按<5%、5%～35%、36%～70%和>70%依次計(jì)為0、1、2和3分，細(xì)胞著色強(qiáng)度按無(wú)色、淡黃色、棕黃色和棕褐色依次計(jì)為0、1、2和3分，上述2項(xiàng)評(píng)分之積：≤3分為陰性表達(dá)，>3分為陽(yáng)性表達(dá)。

3.4細(xì)胞培養(yǎng) 將CGTHW-3細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于5% CO2、 90%濕度，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并及時(shí)更換培養(yǎng)液，保證細(xì)胞最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右進(jìn)行凍存或傳代。

3.5Apaf-1 siRNA轉(zhuǎn)染CGTHW-3并檢測(cè)干擾效率 將CGTHW-3細(xì)胞以每孔3×105個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h去除培養(yǎng)液，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)要求轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 250 μL Opti-MEM分別稀釋siRNA和Lipofectamine 2000，靜置5 min，將兩者混勻靜置20 min再加到含細(xì)胞的孔中，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液補(bǔ)足到2 mL。實(shí)驗(yàn)分為4組：Apaf-1 siRNA+Lipofectamine 2000(siRNA組)、NC-siRNA+Lipofectamine 2000(NC組)、Lipofectamine 2000(mock組)和5Cy3-NC-siRNA+Lipofectamine 2000組(熒光標(biāo)記NC組)。培養(yǎng)6 h將前面3組無(wú)血清培養(yǎng)液更換為10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液；熒光標(biāo)記NC組操作過(guò)程注意避光，24 h后用PBS沖洗3遍，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。分別在轉(zhuǎn)染24 h和48 h提取mRNA和蛋白，real-time PCR和Western blot檢測(cè)各組Apaf-1表達(dá)情況。各組的mRNA樣本有3份，蛋白樣本有4份。

3.6細(xì)胞平板克隆 按上述方法轉(zhuǎn)染后siRNA組和NC組的CGTHW-3細(xì)胞培養(yǎng)24 h，胰酶消化，培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)細(xì)胞密度，以每孔100個(gè)接種于新的6孔板中，每組各有3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3周，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，75%乙醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗3遍，晾干后拍照計(jì)數(shù)。

3.7CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將CGTHW-3細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，siRNA組和NC組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按上述方法轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h，每孔加10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織的Western blot和real-time PCR結(jié)果用t檢驗(yàn)分析；免疫組化中Apaf-1蛋白陽(yáng)性率以及與臨床病理特征之間的關(guān)系采用2檢驗(yàn)和連續(xù)校正卡方檢驗(yàn)；CGTHW-3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織的real-time PCR結(jié)果

根據(jù)real-time PCR體系，Apaf-1和β-actin的熔解曲線均為單峰，峰值溫度分別為83.63 ℃和85.42 ℃，表明引物的特異性良好，無(wú)引物二聚體產(chǎn)生，兩者的擴(kuò)增曲線顯示均達(dá)到平臺(tái)期,Ct值波動(dòng)小，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性好。以癌旁組織作為對(duì)照組，應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算比較，Apaf-1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.535±0.220。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌的Apaf-1 mRNA水平比癌旁組織明顯下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The relative levels of Apaf-1 mRNA expression in papillary thyroid carcinoma (PTC) and tumor-adjacent tissues. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsadjacent tissue.

圖1Apaf-1在甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2 甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織的Western blot結(jié)果

甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織的Western blot結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織的Apaf-1蛋白水平分別為0.216±0.017和0.637±0.045，甲狀腺乳頭狀癌的Apaf-1蛋白水平明顯比癌旁組織中下調(diào)(P<0.05), 見(jiàn)圖2。

Figure 2.The relative levels of Apaf-1 protein in papillary thyroid carcinoma (PTC) and tumor-adjacent tissues. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsadjacent tissue.

圖2Apaf-1在甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中蛋白相對(duì)水平

3 免疫組化結(jié)果

免疫組化分析甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中的Apaf-1蛋白的分布及表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Apaf-1蛋白在胞核和胞漿中均有分布，主要存在于細(xì)胞漿中,見(jiàn)圖3。Apaf-1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織的陽(yáng)性率分別為52.3%(33/63)和81.6%(49/60)，差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)表2。

Figure 3.Immunohistochemical analysis for Apaf-1 protein expression in papillary thyroid carcinoma (PTC) and tumor-adjacent tissues (DAB staining).

圖3甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中Apaf-1蛋白免疫組化結(jié)果

表2免疫組化檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中Apaf-1蛋白表達(dá)情況

Table 2.The Apaf-1 protein expression in papillary thyroid carcinoma (PTC) and tumor-adjacent tissue detected by immunohistochemistry

GroupTotalPositiveNegative2PPTC tissue63333011.861<0.01Adjacent tissue604911

4 Apaf-1蛋白的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征之間的關(guān)系

對(duì)比免疫組化結(jié)果中Apaf-1蛋白表達(dá)與各臨床病理特征，結(jié)果顯示Apaf-1蛋白陽(yáng)性率與患者的性別、年齡、腫塊大小、淋巴轉(zhuǎn)移情況及TNM分期均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3甲狀腺乳頭狀癌Apaf-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Table 3.The association between Apaf-1 protein expression and its clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma

Clinical factors TotalPositiveNegative2PSex0.0810.777 Male20119 Female432221Age (year)0.2180.641 <45251411 ≥45381919Tumor size (cm)0.0940.759 ≤2572928 >2642Lymphatic metastasis0.7500.387 Yes301416 No331914TNM stage1.6110.204 Ⅰ+Ⅱ482325 Ⅲ+Ⅳ15105

5 Apaf-1 siRNA干擾效率檢測(cè)

5Cy3熒光標(biāo)記NC組在轉(zhuǎn)染24 h后于熒光顯微鏡下觀測(cè)熒光情況，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%以上。CGTHW-3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h和48 h后分別檢測(cè)Apaf-1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示siRNA組Apaf-1的mRNA和蛋白水平較NC組和mock組顯著降低(P<0.05),NC組和mock組之間Apaf-1表達(dá)無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖4、5。

6 下調(diào)Apaf-1表達(dá)對(duì)CGTHW-3細(xì)胞增殖的影響

統(tǒng)計(jì)siRNA組和NC組的細(xì)胞集落數(shù)目，siRNA組和NC組分別為42.667±3.055、66.000±3.606，干擾Apaf-1表達(dá)增強(qiáng)了CGTHW-3細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)，見(jiàn)圖6。CCK-8結(jié)果示，siRNA組和NC組在450 nm波長(zhǎng)的吸光度分別為1.479±0.053和0.947±0.051，表明下調(diào)Apaf-1表達(dá)可以提高CGTHW-3細(xì)胞的活力(P<0.05),見(jiàn)圖7。

Figure 4.Expression of Apaf-1 mRNA in CGTHW-3 cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖4CGTHW-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Apaf-1的mRNA表達(dá)

Figure 5.Expression of Apaf-1 protein in CGTHW-3 cells after transfection. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsNC group.

圖5CGTHW-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Apaf-1蛋白表達(dá)量

Figure 6.Comparison of cell colony number. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖6平板克隆形成細(xì)胞集落數(shù)比較

Figure 7.Comparison of CCK-8 results. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖7CCK-8檢測(cè)結(jié)果比較

討 論

腫瘤的形成機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，但通常會(huì)涉及到增殖和凋亡之間失衡。Apaf-1基因位于染色體12q23上，其編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)可以啟動(dòng)凋亡的活化因子，主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)，由1 194個(gè)氨基酸組成，分子量約為130 kD。Apaf-1蛋白有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，位于N端的是一個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域，可以與procaspase-9結(jié)合，其后是與核苷酸結(jié)合的NOD結(jié)構(gòu)域，C端是一個(gè)12個(gè)WD40重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，是cytochrome C的結(jié)合區(qū)域。Apaf-1在全身各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中以成人脾臟、外周血白細(xì)胞和胎兒腦、腎、肺中表達(dá)量最高。 1997年Zou等[9]首次在HeLa細(xì)胞的胞漿中提取并合成Apaf-1的cDNA。Apaf-1是線粒體依賴性凋亡通路中的一個(gè)核心蛋白分子，通常情況下在NOD區(qū)域結(jié)合ADP使其自身活性抑制，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)源性凋亡刺激，如DNA損傷和γ射線照射時(shí)，線粒體膜的通透性增高，cytochrome C由線粒體內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)，可與Apaf-1中的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，dATP/ATP置換ADP產(chǎn)生活化形態(tài)的Apaf-1，隨后寡聚形成apoptosome，并激活下游的caspase-9、-3、-6、-7，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。已有研究表明Apaf-1在多種腫瘤中充當(dāng)著抑癌基因的角色，其表達(dá)水平的下調(diào)與腫瘤形成緊密相關(guān)，但其在甲狀腺乳頭狀癌中的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用real-time PCR、Western blot和免疫組化方法來(lái)檢測(cè)比較甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中Apaf-1 mRNA與蛋白的相對(duì)量,結(jié)果顯示甲狀腺乳頭狀癌中Apaf-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯比癌旁組織的要低，提示Apaf-1在PTC中可能發(fā)揮抑癌作用。Apaf-1低表達(dá)可能是多方面因素調(diào)節(jié)造成，有研究表明膀胱移行細(xì)胞癌中的Apaf-1基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于癌旁正常組織，導(dǎo)致癌組織的Apaf-1表達(dá)量較癌旁正常組織中的低，使用去甲基化藥可以恢復(fù)Apaf-1的表達(dá)[10]；此外在黑色素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，染色體12q22-23發(fā)生雜合性丟失，以及結(jié)直腸腫瘤中發(fā)現(xiàn)Apaf-1等位基因失衡均可降低Apaf-1 mRNA的表達(dá)量[11-13]，由此可以推測(cè)PTC中Apaf-1低表達(dá)可能與基因啟動(dòng)子甲基化、染色體雜合性丟失或者等位基因失衡相關(guān)。p53在大多數(shù)腫瘤是一種抑癌基因，p53蛋白是Apaf-1蛋白的上游因子，可以增強(qiáng)Apaf-1蛋白的表達(dá)量并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]，在甲狀腺乳頭狀癌中p53表達(dá)受到抑制可能導(dǎo)致下游Apaf-1蛋白水平降低。Wallace等[15]用去乙?；敢种苿┨幚硇∈笠暰W(wǎng)膜感光細(xì)胞株，檢測(cè)到p53和轉(zhuǎn)錄因子E2F-1結(jié)合到Apaf-1基因啟動(dòng)子，增強(qiáng)Apaf-1的表達(dá)，從而促進(jìn)其下游caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表明乙?；芯S持Apaf-1依賴的凋亡通路穩(wěn)定的作用，去乙?；赡芡ㄟ^(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子而激活A(yù)paf-1基因啟動(dòng)子，從而對(duì)該凋亡通路進(jìn)行抑制。Choi等[16]報(bào)道同時(shí)敲除促凋亡因子Bax和Bak基因的小鼠胚胎纖維母細(xì)胞用化療藥處理后Apaf-1蛋白量明顯比未敲除或者只敲除其中一個(gè)基因的小鼠胚胎纖維母細(xì)胞的低，提示Apaf-1可能是Bax和Bak的一個(gè)正向調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，Bax和Bak表達(dá)受到抑制時(shí)會(huì)減弱Apaf-1介導(dǎo)的凋亡作用。p21是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，通過(guò)阻止DNA受損的細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，減少受損的DNA累積，從而降低腫瘤的發(fā)生率，Gogada等[17]揭示了p21基因缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體膜的通透性降低使釋放進(jìn)入胞漿的cytochrome C減少，從而間接抑制Apaf-1的表達(dá)，造成該細(xì)胞凋亡抵抗。翻譯調(diào)控腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein，TCTP)被認(rèn)為與腫瘤耐藥具有相關(guān)性,Jung等[18]報(bào)道TCTP抑制HeLa細(xì)胞的線粒體膜電位的超極化分布，阻礙cytochrome C釋放入細(xì)胞漿，同時(shí)TCTP可與Apaf-1的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可能抑制了Apaf-1蛋白形態(tài)變構(gòu)寡聚形成apoptosome的過(guò)程，進(jìn)而阻斷caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使癌細(xì)胞發(fā)生耐藥。以上研究均表明Apaf-1表達(dá)以及其介導(dǎo)的凋亡作用受多因素調(diào)節(jié)，提示PTC中Apaf-1低表達(dá)可能涉及上述因子表達(dá)或功能的失調(diào)，從而抑制Apaf-1依賴的凋亡通路。我們分析了免疫組化Apaf-1表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示Apaf-1蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移情況和TNM分期均無(wú)關(guān)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Apaf-1表達(dá)對(duì)PTC生物學(xué)行為的影響，我們用Apaf-1 siRNA轉(zhuǎn)染CGTHW-3細(xì)胞，熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染率達(dá)到90%以上，且明顯抑制了Apaf-1的mRNA及蛋白表達(dá)，細(xì)胞平板克隆和CCK-8結(jié)果均表明下調(diào)Apaf-1表達(dá)能顯著增強(qiáng)CGTHW-3細(xì)胞增殖及活性。Zhang等[19]通過(guò)上調(diào)miR-23a表達(dá)以及直接用Apaf-1 siRNA干擾均可以明顯降低人喉鱗狀細(xì)胞癌Apaf-1表達(dá)，導(dǎo)致該癌細(xì)胞株增殖能力明顯提高，其結(jié)果與我們?cè)贑GTHW-3細(xì)胞中觀察到的一致，可能是基于細(xì)胞凋亡抑制，生存期延長(zhǎng)，從而有更多增殖時(shí)間產(chǎn)生的。

綜上所述，Apaf-1在PTC中表達(dá)降低可能是由于基因啟動(dòng)子甲基化、染色體雜合性丟失或者等位基因失衡引起，同時(shí)多種抑癌基因或者癌基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)Apaf-1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)或者抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡；Apaf-1低表達(dá)也同時(shí)提高了PTC細(xì)胞的增殖能力。Apaf-1在PTC中的全面評(píng)價(jià)及其具體的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究，或有望成為一個(gè)新的分子標(biāo)志及靶點(diǎn)。