TPX2通過p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)直腸癌HR-8348細胞凋亡*

白國民， 李春耕， 陸慶革， 魏永輝， 趙建杰

(唐山市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科， 河北 唐山 063000)

直腸癌是較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，尋找直腸癌有效治療方法是重中之重[1]。非洲爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2靶蛋白(targeting protein forXenopuskinesin-like protein 2，TPX2)在細胞分裂過程中發(fā)揮調(diào)控作用，可通過調(diào)控紡錘體的功能而影響細胞的生長[2]。研究顯示TPX2在食管癌、乳腺癌和直腸癌等腫瘤中表達上調(diào)，與腫瘤的病理分期等具有密切關(guān)系；抑制腫瘤細胞中的TPX2表達，可使腫瘤細胞凋亡增加，增殖能力下降，但目前對于TPX2在直腸癌細胞生長和凋亡中的作用尚不明確[3-6]。已知p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路在腫瘤中激活受阻，抑制其激活后可以降低腫瘤細胞的凋亡能力[7]。本研究用直腸癌細胞作為實驗對象，探討TPX2對直腸癌細胞的影響，以期為靶向治療直腸癌提供新方向。

材 料 和 方 法

1 材料

人直腸癌細胞HR-8348購自ATCC。cDNA合成試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa；抗TPX2抗體購自Santa Cruz Biotechnology；siRNA陰性對照(siRNA negative control, siRNA-NC)和TPX2 siRNA購自Abbexa；抗p38 MAPK抗體和抗磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)抗體購自CST；抗cleaved caspase-3抗體和抗Bcl-2抗體購自Abcam；RNA提取試劑盒購自北京天根公司；細胞蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1細胞轉(zhuǎn)染及分組 將HR-8348細胞分為正常對照(control)組、siRNA-NC組、TPX2 siRNA組和TPX2 siRNA+SB203580組。HR-8348細胞轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA后用20 μmol/L的p38 MAPK抑制劑SB203580處理記為TPX2 siRNA+SB203580組; siRNA-NC組和TPX2 siRNA組的細胞分別為轉(zhuǎn)染siRNA-NC和TPX2 siRNA后的HR-8348細胞;control組為未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HR-8348細胞。轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000說明書。HR-8348細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染步驟簡述如下：HR-8348細胞濃度調(diào)整為4×108/L，接種到6孔細胞培養(yǎng)板，細胞濃度為60%左右時，于細胞轉(zhuǎn)染前1 h 棄去細胞培養(yǎng)液，加入不含血清的不完全培養(yǎng)液，以提高轉(zhuǎn)染效率。同時將不完全培養(yǎng)基與siRNA-NC或TPX2 siRNA均勻混合為A液，室溫下靜置5 min，將Lipofectamine 2000與不完全培養(yǎng)基混合后為B液，取適量A液與B液充分混合后室溫下放置20 min。棄細胞培養(yǎng)瓶中的不完全培養(yǎng)基，加入A液與B液的混合液，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，換液。

2.2RT-qPCR測定細胞中TPX2的mRNA水平 Control組、siRNA-NC組和TPX2 siRNA組的細胞培養(yǎng)24 h以后，用PBS將細胞洗滌2次，在細胞中加入TRIzol，細胞完全裂解后，在細胞中加入氯仿溶液，劇烈振蕩15 s，溶液乳化以后，放在室溫環(huán)境中孵育5 min。放在低溫4 ℃離心30 min。溶液分為3層，RNA存在于上層溶液中，吸取上層溶液，與相等體積的異丙醇混合后，室溫下靜置10 min。在4 ℃離心10 min，用乙醇洗滌沉淀，在室溫條件下干燥5 min，加入DEPC水將RNA溶解以后，測定A260/A280的值為1.8～2.0之間。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR測定TPX2的mRNA水平，以GAPDH為內(nèi)參照。TPX2的上游引物序列為5’-GCCCTTTGTTCCCAAGAAAGA-3’，下游引物序列為5’-AGCAGTGGAATCGAGTGGAGA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGACGAAAGTGGA-3’。

2.3Western blot測定細胞中的蛋白水平 Control組、siRNA-NC組和TPX2 siRNA組的細胞培養(yǎng)24 h以后，收集細胞，加入蛋白裂解液，放在冰上裂解30 min以后，在4 ℃離心5 min。把上清溶液吸取到1.5 mL的EP管中，放置-20 ℃保存。BCA法對蛋白進行定量檢測。用6%的濃縮膠和12%的分離膠進行SDS-PAGE，電泳條件為90 V恒壓電泳約2 h。4 ℃、90 V轉(zhuǎn)膜90 min。在5%牛血清白蛋白中室溫孵育60 min以后，將抗TPX2的 I 抗以1∶800稀釋，放在4 ℃過夜。將膜放在1∶2 000稀釋的 II 抗中室溫孵育90 min。用Odyssey掃描圖像，半定量分析蛋白表達水平，以GAPDH為內(nèi)參照。

Control組、siRNA-NC組、TPX2 siRNA組和TPX2 siRNA+SB203580組的細胞培養(yǎng)72 h以后，提取細胞蛋白，Western blot測定細胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白水平，抗p38 MAPK、p-p38 MAPK、cleaved caspase-3和Bcl-2的I 抗均以1∶1 000稀釋，步驟同上。

2.4MTT法測定細胞存活率 Control組、siRNA-NC組、TPX2 siRNA組和TPX2 siRNA+SB203580組的細胞按照每孔添加100 μL細胞懸浮液，每孔加入3 000個細胞種植到96孔細胞板中，每組設(shè)置4個復(fù)孔，孵育培養(yǎng)。分別在24 h、48 h和72 h在細胞中添加20 μL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h以后。每孔中添加150 μL的二甲基亞砜溶液，使結(jié)晶物溶解后，酶標(biāo)儀測定490 nm的吸光度(A)值，分析細胞活力。

2.5流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 Control組、siRNA-NC組、TPX2 siRNA組和TPX2 siRNA+SB203580組的細胞培養(yǎng)72 h以后，分別用0.25%的胰蛋白酶消化，用冰預(yù)冷的PBS重懸各組細胞，在細胞中分別依次加入膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC) 5 μL和10 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合均勻以后，放在室溫條件下孵育15 min。用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TPX2 siRNA轉(zhuǎn)染直腸癌HR-8348細胞后TPX2的表達

siRNA-NC組的細胞中TPX2的mRNA和蛋白水平與control組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性;TPX2 siRNA組的細胞中TPX2的mRNA和蛋白水平與control組相比明顯降低(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA可以降低直腸癌細胞中TPX2的表達，見圖1、2。

Figure 1.The mRNA expression level of TPX2 in transfected rectal cancer HR-8348 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染后直腸癌細胞中TPX2的mRNA表達水平

Figure 2.The protein expression level of TPX2 in transfected rectal cancer HR-8348 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2TPX2蛋白在轉(zhuǎn)染后直腸癌細胞中的表達水平

2 敲減TPX2表達對HR-8348細胞存活率的影響

siRNA-NC組的細胞在24、48和72 h測定的A值與control組相比沒有明顯變化，差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性;TPX2 siRNA組的細胞在24、48和72 h的A值與control組相比明顯降低(P<0.05)，說明下調(diào)TPX2抑制直腸癌細胞HR-8348細胞的活力，見圖3。

3 敲減TPX2表達對HR-8348細胞凋亡的影響

siRNA-NC組的細胞凋亡率及cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白水平與control組相比沒有明顯變化，差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性；TPX2 siRNA組的細胞凋亡率及cleaved caspase-3的蛋白水平與control組相比明顯升高，而Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，說明下調(diào)TPX2可誘導(dǎo)caspase-3和Bcl-2介導(dǎo)的直腸癌HR-8348細胞凋亡，見圖4、5。

Figure 3.Knockdown ofTPX2 expression reduced the viability of rectal cancer HR-8348 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3TPX2表達下調(diào)降低細胞存活率

Figure 4.Knockdown ofTPX2 expression induced apoptosis of rectal cancer HR-8348 cells (analyzed by flow cytometry). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4流式細胞術(shù)檢測敲減TPX2表達對直腸癌HR-8348細胞凋亡的影響

Figure 5.Knockdown ofTPX2 expression increased the protein level of cleaved caspase-3 and decreased the protein expression of Bcl-2 in the rectal cancer HR-8348 cells (determined by Western blot). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5TPX2表達下調(diào)增加直腸癌HR-8348細胞中cleavedcaspase-3的蛋白水平，減少Bcl-2蛋白表達

4 敲減TPX2表達對HR-8348細胞中p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白水平的影響

siRNA-NC組的p-p38 MAPK/p38 MAPK水平與control組相比沒有明顯變化，差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性；TPX2 siRNA組的p-p38 MAPK/p38 MAPK水平與control組相比明顯升高(P<0.05)，說明下調(diào)TPX2可誘導(dǎo)直腸癌細胞p38 MAPK磷酸化，促進細胞中p38 MAPK信號通路激活,見圖6。

5 p38 MAPK抑制劑對HR-8348細胞活力的影響

TPX2 siRNA+SB203580組的細胞在24、48和72 h的A值與TPX2 siRNA組相比明顯升高(P<0.05)，說明p38 MAPK抑制劑可以減弱TPX2下調(diào)對直腸癌細胞生長的抑制作用，見圖7。

6 p38 MAPK抑制劑對HR-8348細胞凋亡的影響

TPX2 siRNA+SB203580組的細胞凋亡率、cleaved caspase-3水平和p-p38 MAPK/p38 MAPK水平與TPX2 siRNA組相比明顯降低(P<0.05),說明p38 MAPK抑制劑可以減弱TPX2下調(diào)誘導(dǎo)的直腸癌細胞凋亡，見圖8、9。

Figure 6.Knockdown ofTPX2 expression induced p38 MAPK phosphorylation in the rectal cancer HR-8348 cells (determined by Western blot). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6敲減TPX2表達誘導(dǎo)直腸癌HR-8348細胞中p38MAPK磷酸化

Figure 7.p38 MAPK inhibitor SB203580 antagonized the effect ofTPX2 knockdown on the viability of rectal cancer HR-8348 cells (measured by MTT assay). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTPX2 siRNA group.

圖7p38MAPK抑制劑SB203580拮抗TPX2下調(diào)對細胞活力的影響

討 論

TPX2屬于微管蛋白，其基因在人類染色體上定位于20q11.2，該蛋白質(zhì)由747個氨基酸組成，在哺乳動物的有絲分裂中發(fā)揮作用[8-10]。紡錘體的形成發(fā)生于中心體開始分裂之后，并且與MT相關(guān)蛋白功能的調(diào)控有關(guān)，這種調(diào)控作用是可逆的，TPX2經(jīng)過動力蛋白與肌動蛋白聯(lián)合作用后存在于紡錘體兩極上，當(dāng)細胞發(fā)生有絲分裂時，可以通過微管依賴的方法發(fā)生磷酸化，在細胞進入分裂后期以后，又可以從紡錘體的兩極轉(zhuǎn)移到中間體[11]。TPX2參與腫瘤的發(fā)生，在腫瘤中其表達水平升高后可以促進中心體的數(shù)量增多，形成異倍體，在正常的細胞核分裂中發(fā)揮調(diào)控作用[12-13]。

Figure 8.p38 MAPK inhibitor SB203580 antagonized the effect of TPX2 down-regulation on the apoptosis of rectal cancer HR-8348 cells (analyzed by flow cytometry). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTPX2 siRNA group.

圖8p38MAPK抑制劑SB203580拮抗TPX2下調(diào)對細胞凋亡的影響

腫瘤的發(fā)生與細胞惡性增殖、凋亡減少有關(guān)，在這些過程中癌基因的表達上調(diào)起到關(guān)鍵作用，TPX2作為有絲分裂的調(diào)控基因，其表達異常后可以引起染色體異常等現(xiàn)象，降低基因組的穩(wěn)定性，從而引起腫瘤的發(fā)生[14-15]。已經(jīng)有研究顯示，TPX2在肺癌細胞和支氣管上皮細胞中的表達水平不同，在肺鱗癌和正常氣管上皮細胞中表達水平逐漸降低[16]；還有研究顯示，TPX2在食管癌中的表達水平升高，并且與食管癌的轉(zhuǎn)移、病理分期等有關(guān)[17]；劉潔等[18]的研究顯示，TPX2在結(jié)直腸正常黏膜組織、不典型增生組織及癌組織中的水平依次升高，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級等呈正相關(guān)。

Figure 9.p38 MAPK inhibitor SB203580 antagonized the effect of TPX2 down-regulation on the protein levels of p38 MAPK, p-p38 MAPK, cleaved caspase-3 and Bcl-2 in the rectal cancer HR-8348 cells (determined by Western blot). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTPX2 siRNA group.

圖9p38MAPK抑制劑SB203580拮抗TPX2下調(diào)對細胞中p38MAPK、p-p38MAPK、cleavedcaspase-3和Bcl-2蛋白水平的影響

本實驗結(jié)果顯示，在直腸癌細胞中下調(diào)TPX2轉(zhuǎn)錄和表達后，細胞的存活率降低，細胞的凋亡率升高，細胞中caspase-3活化水平也升高，Bcl-2水平降低，說明TPX2表達下調(diào)可以抑制直腸癌細胞的生長，誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。Bcl-2是抗凋亡蛋白，在腫瘤組織中表達上調(diào)，其屬于Bcl-2蛋白家族的成員之一，其表達上調(diào)后可以抑制細胞凋亡發(fā)生[19-20]。Caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)中的凋亡執(zhí)行因子，其活化后發(fā)揮凋亡促進作用，在腫瘤組織中表達下調(diào)[21]。

p38 MAPK是MAPK信號通路的重要分支，其磷酸化水平升高后可以促進細胞凋亡的發(fā)生，在腫瘤組織中的磷酸化水平異常降低[22]。p38 MAPK與細胞的增殖、凋亡等多種生物學(xué)特性的發(fā)揮有關(guān)，是一種重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，p38 MAPK抑制劑可以促進腫瘤細胞的生長，抵抗細胞凋亡發(fā)生[23-24]。有研究顯示，TPX2在乳腺癌中通過調(diào)控下游信號通路p38 MAPK的激活影響乳腺癌細胞的生長和凋亡情況[25]。本實驗結(jié)果顯示，TPX2表達下調(diào)后細胞中p38 MAPK磷酸化水平升高，用p38 MAPK抑制劑處理下調(diào)TPX2的直腸癌細胞后，細胞凋亡減少，細胞活力升高，抑制p38 MAPK信號通路可以減弱TPX2表達下調(diào)對直腸癌細胞生長和凋亡的影響。

TPX2在直腸癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其表達下調(diào)可以抑制直腸癌細胞的生長，促進直腸癌細胞凋亡，其作用機制與激活下游p38 MAPK信號通路有關(guān)，TPX2與p38 MAPK信號通路具體的作用機制尚不清楚。TPX2可能是治療直腸癌的潛在靶點。本研究為以后研究直腸癌的發(fā)病機制提供了理論基礎(chǔ)，為探討TPX2在腫瘤中的作用提供了重要依據(jù)。在后續(xù)實驗中我們將對TPX2在多種直腸癌細胞中的作用進行驗證。