丹參酮IIA通過(guò)JNK通路誘導(dǎo)人骨肉瘤HOS細(xì)胞凋亡*

陸建紅， 黃曉文▲， 金益軍， 楊彥楠， 吳奕征

(武警浙江省總隊(duì)醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2重癥監(jiān)護(hù)科， 浙江 嘉興 314000；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院骨科， 浙江 杭州 310016)

骨肉瘤好發(fā)于少年兒童，預(yù)后差，病死率高[1]。隨著外科手術(shù)與新輔助化療的聯(lián)合應(yīng)用，大多數(shù)患者實(shí)現(xiàn)了保肢[2]，但仍有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)者，5年生存率無(wú)法超過(guò)70%[3]。此外，化療藥物及一些新型靶向藥的使用,也增加了對(duì)患者的毒副作用[4]。因此，尋找新型有效的骨肉瘤治療藥物，提高遠(yuǎn)期緩解率，成為臨床工作中亟待解決的問(wèn)題之一。丹參酮IIA(tanshinone IIA)良好的抗氧化與抑制炎癥反應(yīng)的能力已被證實(shí)[5]，并能促進(jìn)部分腫瘤細(xì)胞凋亡或自噬，誘導(dǎo)相關(guān)癌基因表達(dá)變化，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)[6-9]，但對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系HOS的作用，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、熒光顯微鏡技術(shù)、電鏡、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)及流式細(xì)胞術(shù)等方法，探討不同濃度丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞增殖的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步探究該藥作為骨肉瘤治療藥物的可能性提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

丹參酮IIA(純度>99%)和SP600125購(gòu)自Sigma；CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫染色液和Hoechst 33258染液購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自Corning；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自BD；抗cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax和p-JNK等抗體均購(gòu)自Abcam。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞系HOS購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC),細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)液 (含10% 四季青胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)， 37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

3 主要方法

3.1CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 取指數(shù)生長(zhǎng)期HOS細(xì)胞，按每孔3 000個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔補(bǔ)足DMEM高糖培養(yǎng)液至100 μL，增設(shè)只加培養(yǎng)液的陰性對(duì)照孔。待12 h細(xì)胞完全貼壁后，分別加入不同濃度的丹參酮IIA，使終濃度為10、20和30 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。于加藥24 h和48 h后每孔分別加入10 μL CCK-8檢測(cè)溶液終止培養(yǎng)。將96孔板于37 ℃孵育4 h后振蕩，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。結(jié)合劑量效應(yīng)關(guān)系計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

3.2集落形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞按單克隆鋪于6孔板上，待第2天貼壁后加入相應(yīng)濃度的藥物處理，約7 d后用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗滌1次。加入0.1%的結(jié)晶紫染液染色20 min，PBS洗滌后觀察各孔集落形成數(shù)量并拍照計(jì)數(shù)。

3.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞鋪于Transwell上室(小室)內(nèi)，同時(shí)加入不同濃度的藥物處理。培養(yǎng)板上室內(nèi)使用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，下室內(nèi)加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基。1 d后用PBS洗滌培養(yǎng)板，加入0.1%的結(jié)晶紫染液染色20 min，洗滌后在顯微鏡下觀察并拍照。

3.4Hoechst 33258染色 添加爬片于6孔板內(nèi)，并接種細(xì)胞。用不同濃度藥物處理1 d后，PBS洗滌3次，加入Hoechst 33258染液染色20 min，再次洗滌后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.5透射電鏡觀察 將藥物處理后的細(xì)胞用2.5%的戊二醛溶液固定過(guò)夜，隨后經(jīng)固定漂洗、脫水與包埋后制作切片并染色，用透射電鏡觀察并拍照。

3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化并收集經(jīng)不同濃度的藥物和制劑處理后的細(xì)胞，離心后用PBS洗滌2次，并重懸于100 μL Binding Buffer中，分別加入5 μL Annexin V-FITC與PI染色，避光孵育15 min后補(bǔ)充Binding Buffer至500 μL，轉(zhuǎn)移到流式檢測(cè)管中，1 h內(nèi)上機(jī)測(cè)量細(xì)胞凋亡比例。

3.7Western blot檢測(cè)蛋白水平 用含有1%PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解經(jīng)不同濃度藥物和相應(yīng)抑制劑處理過(guò)的細(xì)胞提取蛋白，定量后調(diào)齊內(nèi)參上樣。采用80 V 恒壓電泳15 min，再轉(zhuǎn)為120 V恒壓電泳分離蛋白后，經(jīng)280 mA恒流轉(zhuǎn)膜100 min，用5%脫脂牛奶封閉液常溫下封閉1 h，然后分別加入抗cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、p-JNK和GAPDH抗體，置4 ℃孵育過(guò)夜(抗體稀釋比例為1∶1 000)，用TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (1∶5 000) 室溫孵育90 min，再次洗滌3次，每次10 min后進(jìn)行曝光測(cè)量目標(biāo)蛋白的含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、蛋白灰度分析、流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)等單變量不同濃度間的比較采用單因素方差分析和Dunnett’s檢驗(yàn);相同藥物濃度下的抑制劑、藥物共處理組與單藥處理組間的比較采用成組設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞活力的影響

CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)顯示，丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，并呈濃度和作用時(shí)間依賴性，24 h的IC50為(23.80±2.15) μmol/L，48 h的IC50為(19.36±2.21) μmol/L。與對(duì)照組相比，各處理組細(xì)胞活力的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞增殖能力有強(qiáng)烈的抑制效果，與對(duì)照組相比，各處理組集落數(shù)有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The inhibitory effect of tanshinone IIA on HOS cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞活力的抑制作用

Figure 2.The effect of tanshinone IIA on the colony formation ability of HOS cells. The cell colonies were suppressed by the drug at different concentrations for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2丹參酮IIA抑制細(xì)胞集落形成

2 丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，丹參酮IIA可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，其效應(yīng)隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effect of tanshinone IIA on HOS cell migration ability (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3丹參酮IIA抑制HOS細(xì)胞遷移能力

3 丹參酮IIA促進(jìn)HOS骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡

Hoechst染色和透射電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)30 μmol/L丹參酮IIA處理24 h后的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)核皺縮與凋亡小體，見(jiàn)圖4、5。流式細(xì)胞技術(shù)量化了細(xì)胞凋亡的比例，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡比例呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)圖6。Western blot結(jié)果顯示，丹參酮IIA能上調(diào)cleaved caspase-3與Bax蛋白的水平，并下調(diào)Bcl-2蛋白的水平(P<0.05)，進(jìn)一步從蛋白層面證實(shí)了凋亡的發(fā)生，見(jiàn)圖7。

4 丹參酮IIA誘導(dǎo)JNK通路激活

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，丹參酮IIA處理提高了HOS細(xì)胞的p-JNK與其底物p-c-Jun的蛋白水平，且上升程度呈現(xiàn)藥物濃度依賴性(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

Figure 4.Apoptosis of the HOS cells induced by tanshinone IIA. The apoptotic cells demonstrated by Hoechst 33258 staining under fluorescence microscope (red arrow,×400).

圖4丹參酮IIA誘導(dǎo)HOS細(xì)胞發(fā)生凋亡

Figure 5.The ultrastructure of apoptotic HOS cells induced by tanshinone IIA under transmission electron microscope (white asterisk,×5 000).

圖5透射電鏡觀察丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.Apoptosis of the HOS cells triggered by tanshinone IIA was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖6流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞凋亡的影響

5 JNK/c-Jun通路對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，JNK抑制劑SP600125能在一定程度上減輕丹參酮IIA對(duì)HOS細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，與相應(yīng)單藥物處理組相比，丹參酮IIA與SP600125共處理組在中、高濃度下細(xì)胞活力明顯提高(P<0.05)，見(jiàn)圖9。Western blot結(jié)果顯示，與單藥物處理組相比，丹參酮IIA與SP600125共處理組cleaved caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖10。因此，丹參酮IIA通過(guò)激活JNK通路，導(dǎo)致HOS細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

討 論

骨肉瘤的發(fā)病率位居惡性骨腫瘤之首，病情進(jìn)展迅速，近年來(lái)不斷提高的治療方法，遠(yuǎn)期緩解率也始終無(wú)法突破瓶頸，迫使我們探索行之有效且安全的新治療方案。丹參酮IIA是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的有效藥物成分，很多研究已證實(shí)其有一定抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[6-9]。本研究結(jié)果表明，丹參酮IIA在體外能有效抑制HOS細(xì)胞增殖與遷移，通過(guò)激活JNK信號(hào)通路產(chǎn)生細(xì)胞抑制作用，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是由特定因素誘導(dǎo)并受基因調(diào)控的一種程序性死亡過(guò)程，以形態(tài)上出現(xiàn)細(xì)胞表面微絨毛消失、胞漿濃縮、核膜皺縮、核仁裂解、染色質(zhì)濃聚以及出現(xiàn)凋亡小體等為特征性標(biāo)志，與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞病理生理狀態(tài)以及內(nèi)環(huán)境關(guān)系十分密切[10]。通過(guò)Hoechst 33258染色與透射電鏡檢查，我們觀察到在丹參酮IIA作用下的HOS細(xì)胞出現(xiàn)大量核膜皺縮，染色質(zhì)濃聚等現(xiàn)象，提示細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。研究顯示，凋亡是由caspase家族介導(dǎo)的一系列級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，caspase-3作為凋亡反應(yīng)下游的執(zhí)行蛋白，是不同凋亡途徑所共同的必經(jīng)之路，其表達(dá)水平可以整體反映凋亡的強(qiáng)弱[11]。此外，Bcl-2家族是腫瘤細(xì)胞中影響凋亡的關(guān)鍵因素之一，在不同的信號(hào)通路中起重要作用，其中Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的凋亡抑制和促進(jìn)基因，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，Bcl-2家族中的相應(yīng)蛋白作用于線粒體，破壞其完整性，進(jìn)一步釋放線粒體中的促凋亡因子，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[12]。本課題研究發(fā)現(xiàn)，在丹參酮IIA作用之下，HOS細(xì)胞內(nèi)caspase-3與Bax表達(dá)水平顯著上升，而B(niǎo)cl-2水平下降，進(jìn)一步佐證了細(xì)胞內(nèi)凋亡的發(fā)生且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，并與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡所得結(jié)果相吻合。

Figure 7.The alterations of apoptosis-related proteins caused by tanshinone IIA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖7丹參酮IIA導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白改變

Figure 8.Tanshinone IIA induced activation of JNK signaling pathway. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖8丹參酮IIA誘導(dǎo)JNK信號(hào)通路激活

Figure 9.The JNK inhibitor SP600125 reversed tanshinone IIA-induced HOS cell viability inhibition. Mean±SD.n=3.*P<0.05vstanshinone IIA group.

圖9SP600125緩解丹參酮IIA對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)調(diào)控凋亡的相關(guān)上游信號(hào)通路有多條，包括JNK通路、IL-6/STAT3通路和PI3K /Akt通路等[13-15]。JNK通路作為一條經(jīng)典的MAPK信號(hào)通路，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化以及多種代謝活動(dòng)中起到重要作用。JNK小分子能被上游多種激酶激活而磷酸化，再激活下游底物如c-Jun發(fā)揮病理生理作用[16]。JNK的亞型JNK1和JNK2普遍表達(dá)于各組織，而JNK3則在少數(shù)器官中才表達(dá)，因此我們選擇p-JNK與p-c-Jun以及總JNK與總c-Jun作為檢測(cè)指標(biāo)以反映JNK信號(hào)通路的激活情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在丹參酮IIA作用之下，蛋白表達(dá)水平p-JNK/JNK與p-c-Jun/c-Jun顯著上升。為了進(jìn)一步驗(yàn)證JNK通路與凋亡的關(guān)系，我們添加了JNK抑制劑SP600125與丹參酮IIA共處理組，再次通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)與Western blot進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示JNK通路一定程度上被抑制，在此基礎(chǔ)上細(xì)胞存活率有所提升，凋亡某種程度上被逆轉(zhuǎn)。由此可見(jiàn)，JNK通路參與了丹參酮IIA引起的凋亡，但SP600125并不能完全逆轉(zhuǎn)凋亡的發(fā)生，我們推測(cè)可能有其它通路參與該藥物介導(dǎo)的凋亡，或是抑制劑濃度以及作用時(shí)間的關(guān)系，有待于我們作進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的方法，研究丹參酮IIA對(duì)人骨肉瘤HOS細(xì)胞的影響。我們發(fā)現(xiàn)一定劑量的丹參酮IIA可通過(guò)作用于JNK信號(hào)通路而導(dǎo)致HOS細(xì)胞增殖被抑制，從而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，效應(yīng)呈現(xiàn)濃度和作用時(shí)間依賴性。該結(jié)果為丹參酮IIA在骨肉瘤方面的臨床應(yīng)用提供了可參考的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Figure 10. The JNK inhibitor SP600125 reversed tanshinone IIA-induced HOS cell apoptosis. The cells were treated with tanshinone IIA (30 μmol/L) for 24 h after incubation of JNK inhibitor SP600125 at 40 μmol/L for 2 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vstanshinone IIA group.

圖10SP600125緩解丹參酮IIA導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用