小麥根際土壤微生物數(shù)量對(duì)莖基腐病的影響

陸寧海 楊蕊 郎劍鋒

摘要：為探索小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期根際土壤微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，通過(guò)稀釋分離法分析健康植株和患病植株根際土壤真菌、細(xì)菌和放線菌數(shù)量。結(jié)果表明，患病植株根際土壤真菌種群數(shù)量在小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期比健康植株根際土壤真菌數(shù)量多，從返青期到成熟期，真菌種群數(shù)量逐漸增加，孕穗期達(dá)到最大值，健康植株根際土壤真菌數(shù)量為 10.21×103 CFU/g，患病植株根際土壤真菌數(shù)量為14.27×103 CFU/g。患病植株根際土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量在小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期比健康植株根際土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量少，從返青期到成熟期，種群數(shù)量逐漸增加，在揚(yáng)花期達(dá)到最大值，健康植株根際土壤細(xì)菌數(shù)量為50.78×106 CFU/g，放線菌數(shù)量為28.44×103 CFU/g，患病植株根際土壤細(xì)菌數(shù)量為36.68×106 CFU/g，放線菌數(shù)量為22.67×103 CFU/g。因此，小麥莖基腐病的發(fā)生與根際土壤微生物數(shù)量有一定的關(guān)系，其中當(dāng)真菌數(shù)量較多，細(xì)菌和放線菌數(shù)量較少時(shí)，有可能加重病害的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：小麥莖基腐病;根際土壤;微生物;稀釋分離法

中圖分類號(hào)： S435.121.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0113-04

小麥莖基腐?。╟rown rot，簡(jiǎn)稱CR）是由多種病原真菌引起的一種土傳病害，別稱旱地腳腐?。╠ry land foot rot）、鐮刀根腐?。‵usarium root rot）和鐮刀莖基腐病（Fusarium crown rot）等[1]。該病是一種世界性的重要病害，已有10多個(gè)國(guó)家報(bào)道其發(fā)生，包括美國(guó)、澳大利亞、意大利、土耳其、加拿大等[2]。在我國(guó)江蘇地區(qū)曾報(bào)道小麥莖基褐腐病的危害，但其病原以根腐蠕孢菌為主，與國(guó)外報(bào)道的以鐮刀菌為主要病原的小麥莖基腐病明顯不同[3]。Li等首次在我國(guó)報(bào)道了由假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）引起的小麥莖基腐病[4]。有調(diào)查顯示，近年來(lái)，隨著秸稈還田及免耕少耕等耕作措施的大面積推廣，小麥莖基腐病在各大麥區(qū)發(fā)生普遍并造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，已逐步引起重視[5-6]。

大量的研究表明，田間環(huán)境是影響病害發(fā)展和流行的重要因素，主要包括播期、土壤類型、土壤濕度、營(yíng)養(yǎng)狀況等[7]。另外，品種抗性也在一定程度上影響發(fā)病程度。有研究表明，早播會(huì)使病害加重發(fā)生，而適當(dāng)晚播可減輕病害的發(fā)生程度。莖基腐病在所有土壤類型中均可發(fā)生，尤以黏性土壤最為普遍。地勢(shì)低洼、排水不良可促進(jìn)其發(fā)病[8]。土壤濕度是影響莖基腐病田間發(fā)病率和嚴(yán)重度的主要因素。濕潤(rùn)的表層土壤是病害苗期侵染的必要條件，土壤濕度高有利于發(fā)病[9]。有資料顯示，小麥播種后遭遇陰雨天氣以及揚(yáng)花期至成熟期遇到干旱天氣有利于莖基腐病的發(fā)生[10]。氮和鋅是影響莖基腐病發(fā)病率和發(fā)病嚴(yán)重程度的主要營(yíng)養(yǎng)元素。施用氮肥過(guò)多、植物缺鋅均有利于小麥莖基腐病的發(fā)生[11-12]，在莖基腐病嚴(yán)重發(fā)生的地區(qū)，適當(dāng)增施鋅肥可有效減輕莖基腐病的發(fā)生。但有關(guān)根際土壤微生物數(shù)量對(duì)小麥莖基腐病的影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探討根際土壤微生物數(shù)量對(duì)小麥莖基腐病的影響。

1 材料與方法

1.1 根際土壤微生物的采集

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在河南省新鄉(xiāng)市新鄉(xiāng)縣洪門(mén)鎮(zhèn)喬謝村的試驗(yàn)田，在小麥生長(zhǎng)返青期、拔節(jié)期、孕穗期、揚(yáng)花期、成熟期分別采集患病和健康小麥植株根際土壤，采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)隨機(jī)選擇50株小麥，收集其根際土壤，輕抖帶土植株掉落土樣，該土樣為非根際土壤，黏附在植株根系上的土樣則為根際土壤[13]。采樣后將根際土壤裝入無(wú)菌袋中并編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室后，將統(tǒng)一處理的5個(gè)樣品混合，將土樣過(guò)1 mm篩后放入 4 ℃ 環(huán)境下保存，用于根際土壤微生物的分離。

1.2 培養(yǎng)基的選擇

真菌的分離采用馬鈴薯葡萄糖（PDA培養(yǎng)基）培養(yǎng)基，細(xì)菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌的分離采用高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基[14]。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基配方[15]：200 g馬鈴薯，10～20 g葡萄糖，17～20 g瓊脂，1 000 mL自來(lái)水，自然pH值。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方[14]：3 g牛肉浸膏，5～10 g蛋白胨，1 000 mL水，17～20 g瓊脂，自然pH值。

高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基配方[14]：20 g可溶性淀粉，1.0 g KNO3，0.5 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g NaCl，0.01 g FeSO4·7H2O，1 000 mL水，20 g瓊脂，自然pH值。

1.3 根際土壤微生物的分離

（1）用稀釋分離法[16]從根際土壤中分離細(xì)菌。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基放在微波爐里加熱，待完全融化后取出，在無(wú)菌操作臺(tái)上倒空白平板。冷凝后，用微量移液槍吸取已經(jīng)梯度稀釋過(guò)的土壤懸浮液中，從低濃度到高濃度依次吸取10-6、10-5、10-4各0.1 mL，用涂抹棒涂抹均勻。置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第2天至第7天每天觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)量與種類。

（2）用稀釋分離法[16]從根際土壤中分離真菌。將滅過(guò)菌的250 mL PDA培養(yǎng)基放在微波爐里加熱，待完全融化后取出，加入1 mL鏈霉素，輕搖，使鏈霉素與培養(yǎng)基充分混勻，然后倒空白平板。冷凝后，用微量移液槍吸取已經(jīng)梯度稀釋過(guò)的土壤懸浮液，從低濃度到高濃度依次取10-3、10-2、10-1各 0.1 mL，用涂抹棒涂抹均勻。置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第2天至第7天每天觀察統(tǒng)計(jì)真菌菌落數(shù)量與種類。

（3）用稀釋分離法[16]從根際土壤中分離放線菌。將高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基放在微波爐里加熱，待完全融化后取出，在無(wú)菌操作臺(tái)上倒空白平板。冷凝后，用微量移液槍吸取已經(jīng)梯度稀釋過(guò)的土壤懸浮液，從低濃度到高濃度依次取10-3、10-2、10-1各0.1 mL，用涂抹棒涂抹均勻。放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第2天至第7天每天觀察統(tǒng)計(jì)放線菌菌落數(shù)量與種類。每個(gè)處理重復(fù)3次，土壤中微生物數(shù)量以每克土壤樣品所含的菌落數(shù)表示，單位為CFU/g。試驗(yàn)所用器材均為事先滅過(guò)菌的。

1.4 小麥莖基腐病發(fā)病情況調(diào)查

在小麥返青期、拔節(jié)期、孕穗期、揚(yáng)花期、成熟期分別調(diào)查記錄各小區(qū)小麥莖基腐病的發(fā)病情況，按對(duì)角線5點(diǎn)取樣法進(jìn)行，每點(diǎn)取50株，調(diào)查小麥莖基腐病的發(fā)生情況。按莖基腐病的發(fā)病程度分為0～5級(jí)，即0級(jí)：無(wú)明顯癥狀;1級(jí)：第1葉鞘褐枯小于葉鞘長(zhǎng)度10%;2級(jí)：第1葉鞘褐枯占葉鞘長(zhǎng)度11%～25%;3級(jí)：第1葉鞘褐枯占葉鞘長(zhǎng)度26%～50%;4級(jí)：第2葉鞘有明顯褐枯;5級(jí)：第3葉鞘有明顯褐枯或全株枯死[17]。然后計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)[18]。

病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）;

發(fā)病率=調(diào)查染病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥莖基腐病在不同時(shí)期的發(fā)病率和病情指數(shù)分析

由圖1可知，在小麥的整個(gè)生育期中，小麥莖基腐病的發(fā)生呈先迅速上升而后趨于平穩(wěn)的變化動(dòng)態(tài)。從返青期到孕穗期，莖基腐病的發(fā)生流行較快，返青期、拔節(jié)期、孕穗期的發(fā)病率分別為17.11%、40.12%、76.26%，在孕穗期達(dá)到高峰，孕穗期后發(fā)病率相對(duì)穩(wěn)定，揚(yáng)花期、成熟期的發(fā)病率分別為 78.33%、79.54%。

由圖2可知，在小麥的不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，小麥莖基腐病的病情指數(shù)（即嚴(yán)重度）呈持續(xù)上升趨勢(shì)，在成熟期達(dá)到高峰。從返青期到拔節(jié)期，小麥的病情指數(shù)急劇增長(zhǎng)，從4.24增長(zhǎng)到17.43，孕穗期、揚(yáng)花期、成熟期，病情逐漸加重，但增幅較小，病情指數(shù)分別為24.33、27.41、32.41。

2.2 小麥返青期根際土壤微生物的數(shù)量分析

由表1可知，返青期患病小麥植株根際土壤與健康小麥植株根際土壤中的微生物數(shù)量有顯著差異。小麥返青期健康小麥根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯比患病小麥根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量多，健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為4.64×106 CFU/g，患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為3.23×106 CFU/g;患病小麥根際土壤中的真菌數(shù)量明顯比健康小麥根際土壤中的真菌數(shù)量多，健康小麥根際土壤中的真菌數(shù)量為1.67×103 CFU/g，患病小麥根際土壤中的真菌數(shù)量為3.51×103 CFU/g;健康小麥根際土壤中放線菌的數(shù)量明顯比患病小麥根際土壤中放線菌的數(shù)量多，健康小麥根際土壤中放線菌的數(shù)量為1.32×103 CFU/g，患病小麥根際土壤中放線菌的數(shù)量為 1.06×103 CFU/g。

2.3 小麥拔節(jié)期根際土壤微生物的數(shù)量分析

由表2可知，拔節(jié)期患病小麥植株根際土壤與健康小麥植株根際土壤中的微生物數(shù)量有顯著差異。小麥拔節(jié)期健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量多，健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為14.35×106 CFU/g，患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為10.12×106 CFU/g;患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量明顯比健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量多，患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量為5.98×103 CFU/g，健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量為3.74×103 CFU/g;健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量多，健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為5.12×103 CFU/g，患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為 4.18×103 CFU/g。

2.4 小麥孕穗期根際土壤微生物的數(shù)量分析

由表3可知，孕穗期患病小麥植株根際土壤與健康小麥植株根際土壤中的微生物數(shù)量有顯著差異。小麥孕穗期健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量多，健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為32.69×106 CFU/g，患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為19.79×106 CFU/g;患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量明顯比健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量多，患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量為11.26×103 CFU/g，健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量為8.62×103 CFU/g;健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量多，健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為13.78×103 CFU/g，患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為 11.56×103 CFU/g。

2.5 小麥揚(yáng)花期根際土壤微生物的數(shù)量分析

由表4可知，揚(yáng)花期患病小麥植株根際土壤與健康小麥植株根際土壤中的微生物數(shù)量有顯著差異。小麥揚(yáng)花期健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量多，健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為50.78×106 CFU/g，患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為36.68×106 CFU/g;患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量明顯比健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量多，患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量為14.27×103 CFU/g，健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量為10.21×103 CFU/g;健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量多，健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為28.44×103 CFU/g，患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為 22.67×103 CFU/g。

2.6 小麥成熟期根際土壤微生物的數(shù)量分析

由表5可知，成熟期患病小麥植株根際土壤與健康小麥植株根際土壤中的微生物數(shù)量存在顯著差異。小麥成熟期健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量多，健康植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為35.14×106 CFU/g，患病植株根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為28.95×106 CFU/g;患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量明顯比健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量多，患病植株根際土壤中的真菌數(shù)量為11.17×103 CFU/g，健康植株根際土壤中的真菌數(shù)量為9.56×103 CFU/g;健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量明顯比患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量多，健康植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為21.56×103 CFU/g，患病植株根際土壤中放線菌的數(shù)量為 19.79×103 CFU/g。

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