花生3-磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因的功能鑒定

姜竹 陳丹丹 劉宏波

摘要：花生（Arachis hypogaea）是我國的主要油料作物，花生油脂的合成受3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）調(diào)控，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。從花生中克隆了13個(gè)GPAT基因，編碼含有4個(gè)?；D(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域的蛋白;同時(shí)，運(yùn)用酵母遺傳互補(bǔ)體系對(duì)基因功能進(jìn)行了鑒定。在該體系中，酵母雙突變體菌株ZAFU1（Δgat1/Δgat2）因缺少GPAT而不能在特定的葡萄糖培養(yǎng)基上生長。結(jié)果表明，AhGPAT1/2/3/6/9與空白載體一樣，其導(dǎo)入并不能恢復(fù)酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長缺陷，而AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的導(dǎo)入能恢復(fù)酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長缺陷，說明上述3個(gè)基因具有?；D(zhuǎn)移酶活性，從而為進(jìn)一步研究花生油脂的合成代謝調(diào)控提供了參考。

關(guān)鍵詞：花生;3-磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（GPAT）;遺傳互補(bǔ);酵母雙突變體菌株

中圖分類號(hào)： S565.201 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0056-05

油脂是高等植物的主要能量儲(chǔ)存形式，可為植物的種子萌發(fā)、花粉發(fā)育和有性生殖等提供能量，對(duì)于植物的生長發(fā)育至關(guān)重要[1]。植物油可為人類提供能量和營養(yǎng)，同時(shí)也是重要的工業(yè)原料[2]。我國的花生（Arachis hypogaea）總產(chǎn)量、單位面積產(chǎn)量和出口量一直位居我國油料作物之首，在我國油脂供應(yīng)、出口創(chuàng)稅和國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有舉足輕重的地位，但是花生油脂的合成機(jī)制目前尚不清楚[3-4]。

植物油的主要成分是三酰甘油（TAG），由3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶（LPAAT）和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）依次催化脂肪酸鏈摻入甘油骨架的sn-1、sn-2、sn-3位而生成[5-6]。目前，關(guān)于甘油脂合成前2步?；磻?yīng)的酶，特別是第1步?；磻?yīng)的酶知之甚少。研究者在擬南芥、油菜、水稻和向日葵等多種植物中已成功克隆了多個(gè)編碼?；D(zhuǎn)移酶的GPAT基因[7]，但普遍認(rèn)為，除了ATS1，只有GPAT9直接參與甘油脂的合成，其他GPAT是否參與甘油脂合成并不清楚[8-10]。已有研究者從花生中克隆了部分GPAT基因，并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了分析，但是關(guān)于花生GPAT酶的特性尚無相關(guān)報(bào)道[11-12]。本研究從山花15中分離了13個(gè)3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶基因，并用酵母遺傳互補(bǔ)體系對(duì)上述基因進(jìn)行了功能鑒定，發(fā)現(xiàn)AhGPAT1/2/3/6/9不能恢復(fù)酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長，AhGPAT5B、AhGPAT7A/B能恢復(fù)酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長，說明上述3個(gè)基因具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生品種山花15、酵母菌株ZAFU1[13]、大腸桿菌菌株DH5α和酵母表達(dá)載體pYES2-yADH1-Kan V2[14]均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。RNA提取試劑盒，購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;高保真酶PrimeSTAR、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA連接酶以及限制性內(nèi)切酶，購自TaKaRa公司。引物由賽默飛世爾科技有限公司合成?；驕y(cè)序由鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取花生根、葉的總RNA。測(cè)定總RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證RNA的完整性，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 基因克隆和重組載體的構(gòu)建

參考已有的研究，檢索得到花生GPAT1/2/3/5/6/8/9基因的核苷酸序列，以這些基因結(jié)合擬南芥GPAT氨基酸序列，在花生數(shù)據(jù)庫peanutbase中進(jìn)行同源檢索，得到候選AhGPAT序列，基于此確定花生GPAT1A/1B/2A/2B/3B/5B/6A/7A/7B/8A/9A-1/9A-2/9B序列的信息。結(jié)合候選基因序列和表達(dá)載體酶切位點(diǎn)，在SIGMA網(wǎng)站上設(shè)計(jì)各基因的PCR擴(kuò)增引物（表1）。

以花生cDNA為模板，用帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收。將酶切后的AhGPAT與酵母表達(dá)載體pYES2-yADH1-Kan V2進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，并進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)。最后提取測(cè)序成功的AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2重組質(zhì)粒備用。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

使用DNAMAN對(duì)已克隆的10個(gè)AhGPAT基因（AhGPAT1A/1B/2A/2B/3B/5B/6A/7A/7B/8A）編碼的蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，使用MEGAX軟件對(duì)AhGPAT的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，系統(tǒng)發(fā)育樹采用Neighbour-Joining（鄰接）方法[15-16]構(gòu)建。

1.5 AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2載體轉(zhuǎn)化酵母雙突變體及酵母濃度梯度稀釋試驗(yàn)

通過LiAc法制備ZAFU1酵母感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2、pYES2-yADH1-Kan V2空白載體和GAT1-pYES2-yADH1-Kan V2陽性對(duì)照轉(zhuǎn)入酵母雙突變體ZAFU1感受態(tài)中。分別涂布于含有葡萄糖（glucose）、半乳糖（galactose）的SC-Ura-His-Leu固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)4～7 d。挑選SC-Ura-His-Leu+葡萄糖固體培養(yǎng)基中的酵母單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，將菌液分別稀釋至D600 nm=1、0.2，0.04、0.008、0.000 16，取5 μL分別涂布于SC-Ura-His-Leu+半乳糖、SC-Ura-His-Leu+葡萄糖固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)4～7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AhGPAT氨基酸序列的差異分析

本研究分離了AhGPAT的8個(gè)不同成員，共13個(gè)基因。分離的由AhGPAT編碼的蛋白羧基端均有典型的酰基轉(zhuǎn)移酶的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（AhGPAT9除外）：AT-Ⅰ、AT-Ⅱ、AT-Ⅲ 和AT-Ⅳ（圖1），保守結(jié)構(gòu)域中與酰基轉(zhuǎn)移酶催化活性相關(guān)的氨基酸是AT-Ⅰ 的組氨酸（His）及天冬氨酸（Asp）、AT-Ⅲ 的甘氨酸（Gly）、AT-IV的脯氨酸（Pro）;與底物甘油綁定相關(guān)的氨基酸是AT-Ⅱ的精氨酸（Arg）、AT-Ⅲ 的谷氨酸（Glu）。

為了更好地確定花生GPAT的親緣關(guān)系，對(duì)AhGPAT進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，并對(duì)部分AhGPAT進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

結(jié)果顯示，分離的由AhGPAT編碼的蛋白之間的氨基酸序列相似度為19.1%～99.7%。栽培花生A/B 2個(gè)亞基因組和亞基因組內(nèi)由AhGPAT編碼的蛋白氨基酸相似度極高，為 96.3%～99.7%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，分離的由AhGPAT編碼的蛋白可聚成兩大分支：AhGPAT1/2/3/5/6/7/8和AhGPAT9（圖2）。其中，AhGPAT1/2/3/5/6/7/8蛋白可分為3個(gè)亞家族：AhGPAT1/2/3、AhGPAT5/7和AhGPAT6/8;AhGPAT2和AhGPAT3的親緣關(guān)系較近，AhGPAT3B氨基酸序列與AhGPAT2A、AhGPAT2B氨基酸序列的相似度分別為73.0%、73.2%。AhGPAT5/7的親緣關(guān)系較近，AhGPAT5B氨基酸序列與AhGPAT7A、AhGPAT7B氨基酸序列的相似度分別為80.4%、80.9%。AhGPAT6A與AhGPAT8A的親緣關(guān)系較近，二者的氨基酸序列相似度為74.9%。AhGPAT9與其他AhGPAT的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 AhGPAT的功能分析

2.2.1 重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 對(duì)AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，獲得如圖3所示與預(yù)期大小一致的目的條帶，表明AhGPAT-pYES2-yADH1-KanV2重組質(zhì)粒已構(gòu)建成功。

2.2.2 酵母遺傳互補(bǔ)及酵母濃度梯度稀釋試驗(yàn) 筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了GAT1、GAT2雙敲除的ZAFU1（gat1Δgat2Δ+[pGAL1：：At1g06520 Leu2]）菌株，其本身含有His3篩選標(biāo)記， 同時(shí)含有Leu2篩選標(biāo)記的YEplac181-AtGPAT1重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒GAL1啟動(dòng)子在半乳糖條件下能夠誘導(dǎo)AtGPAT1基因的表達(dá)，但在葡萄糖條件下，AtGPAT1基因不能表達(dá)。因此該酵母雙突變體ZAFU1只能在SC+Ura-His-Leu+Galactose培養(yǎng)基中生長，不能在SC+Ura-His-Leu+Glucose培養(yǎng)基中生長。pYES2-yADH1-Kan V2空白載體含有合成尿嘧啶的基因，該質(zhì)粒yADH1啟動(dòng)子受葡萄糖誘導(dǎo)，受半乳糖抑制，因此轉(zhuǎn)入該載體的酵母菌株若能在 SC-Ura-His-Leu+Glucose 培養(yǎng)基上生長，則證明轉(zhuǎn)入酵母雙突變體ZAFU1的目的基因具有?；D(zhuǎn)移酶活性。

本研究將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2、pYES2-yADH1-Kan V2空白載體和GAT1-pYES2-yADH1-Kan V2的酵母雙突變體分別培養(yǎng)在SC-Ura-His-Leu+Galactose、SC-Ura-His-Leu+Glucose培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)pYES2-yADH1-Kan V2空白載體和AhGPAT1A/1B/2A/2B/3B/6A/9A-1/9A-2/9B的酵母雙突變體均不能在SC-Ura-His-Leu+Glucose培養(yǎng)基上生長，而轉(zhuǎn)GAT1陽性對(duì)照、AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的酵母雙突變體能在SC-Ura-His-Leu+Glucose培養(yǎng)基上生長，說明AhGPAT5B、AhGPAT7A/B具有?；D(zhuǎn)移酶活性（圖4）。將轉(zhuǎn)AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的酵母雙突變體進(jìn)行濃度梯度稀釋培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)它們均能很好地恢復(fù)酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖培養(yǎng)基上的生長（圖5）。轉(zhuǎn)AhGPAT8A的ZAFU1酵母在SC-Ura-His-Leu+Glucose上有少數(shù)幾個(gè)酵母菌落生長，其功能有待進(jìn)一步探究。將AhGPAT轉(zhuǎn)入條件致死型酵母雙突變體ZAFU1中，從葡萄糖或半乳糖培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落稀釋（1 ∶ 5）后，分別涂布在SC-Ura-His-Leu+Glucose、SC-Ura-His-Leu+Galactose固體培養(yǎng)基上。

3 結(jié)論與討論

本研究從花生中分離了13個(gè)3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶基因，編碼的蛋白均具有?；D(zhuǎn)移酶的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[17]。運(yùn)用酵母遺傳互補(bǔ)體系對(duì)AhGPAT的酰基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)AhGPAT5B/7A/7B能恢復(fù)酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長，表明其具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性。

擬南芥AtGPAT1具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性，而花生AhGPAT1A、AhGPAT1B在酵母遺傳互補(bǔ)體系中均不能恢復(fù)酵母雙突變體ZAFU1的生長，AhGPAT1A/B與AtGPAT1的氨基酸相似度分別只有65.8%、66.1%，AhGPAT1A/B與AtGPAT1的氨基酸序列差異較大，目前尚不清楚這些序列差異是否影響了AhGPAT1A/B的酰基轉(zhuǎn)移酶活性。

根據(jù)前人的研究及花生基因組數(shù)據(jù)庫信息，AhGPAT5、AhGPAT7在根、花中的表達(dá)量較高，但是這些基因在種子中的表達(dá)量較低，而花生根和花的油脂含量低[11]。目前尚不清楚這些基因是否參與種子中油脂、膜脂合成，AhGPAT5、AhGPAT7的功能差異有待進(jìn)一步探究。

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