蛇床子素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制SMMC7721人肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究＊

潘志強(qiáng)，王曉敏，錢(qián)宏梁，方肇勤

（上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 上海 201203）

蛇床子素（Osthole，OST），又名甲氧基歐芹酚，化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，屬香豆素類(lèi)化合物，是從傘形科一年生草本植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實(shí)中提取出來(lái)的主要成分。其對(duì)應(yīng)的中藥飲片蛇床子外用具有祛風(fēng)燥濕、殺蟲(chóng)止癢作用，內(nèi)服具有溫腎壯陽(yáng)功效[1]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗心律失常、雄激素樣和促性腺激素樣等作用[2]。在抗腫瘤研究方面，近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞、肺腺癌A549細(xì)胞、肝癌Bel-7402細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、膀胱腫瘤T24/ADM 細(xì)胞、Walker-256 肝癌移植瘤等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均具有抑制作用[3-9]，主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞增殖或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并從不同的分子機(jī)制方面予以揭示。本研究在課題組前期發(fā)現(xiàn)蛇床子素具有抑制小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤Y1細(xì)胞、小鼠垂體瘤AtT20細(xì)胞基礎(chǔ)上[10,11]，以人肝癌細(xì)胞株SMMC7721 為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)蛇床子素抑制肝癌細(xì)胞增殖與促進(jìn)細(xì)胞凋亡可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)從而發(fā)揮抗腫瘤的作用，茲報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

SMMC7721 人肝癌細(xì)胞為本課題組液氮保種，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥物與試劑

蛇床子素（簡(jiǎn)稱OST）購(gòu)自上海市食品藥品檢驗(yàn)所東方藥品科技實(shí)業(yè)有限公司，并溶解于DMSO 中。毒胡蘿卜素（Thapsigargin，簡(jiǎn)稱TG）、DMSO、MTT 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；RIPM1640 培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）、0.25%胰酶（0.02%EDTA）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公 司；PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)Ⅱ購(gòu)自TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶、磷酸酶抑制劑&PMSF購(gòu)自上?？党巧锕こ逃邢薰荆坏蛲鲈噭┖校ˋnnexin V-FITC Apoptosis Analysis Kit）、周期試劑盒（PI/RNase Staining Solution）購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司；抗體CyclinD1、CyclinE1、CDK4、Bax、Bcl-2 購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，抗體GRP78、GRP94、XBP-1S、PERK、p-eIF2α(Ser51) 購(gòu) 自 美 國(guó) Cell signaling technology 公司，抗體β-actin、p27Kip1購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，抗體CHOP 購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司。

1.1.3 基因引物序列

采用Primer3（v.0.4.0）在線軟件設(shè)計(jì)引物并委托Life Technologies 公司合成有關(guān)基因引物序列及其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度（表1）。

表1 人基因上下游引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與治療

SMMC7721人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清與1%青霉素/鏈霉素雙抗的RIPM1640 培養(yǎng)液中。依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎盟幬镏委煼绞饺缦拢簩⒓?xì)胞鋪入96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為50%時(shí)，采用20-100 μM 蛇床子素干預(yù)24 h、48 h、72 h 后以MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖。將細(xì)胞鋪入6 孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為80% 時(shí)，采用20 μM-80 μM 蛇床子素干預(yù)48 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。將細(xì)胞鋪入6 孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%時(shí)，采用60 μM 蛇床子素干預(yù)24 h，采用RT-qPCR 檢測(cè)基因表達(dá)以及Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)均以0.1%DMSO作為對(duì)照組。

1.2.2 MTT檢測(cè)

按照MTT 試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞增殖及活性，SMMC7721 人肝癌細(xì)胞種植于96 孔板，細(xì)胞密度為1×104/孔，次日采用蛇床子素治療，分別在治療24 h、48 h 和72 h 檢測(cè)細(xì)胞增殖，吸棄培養(yǎng)液并用PBS 沖洗2 次，加入10 微升/孔0.5 mg/mL 的MTT 溶液，輕輕搖晃，放入培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸棄上液，加入150 微升/孔DMSO 溶液；并置于振蕩器上，低速振蕩10 min，使其充分溶解；在酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD570 nm的吸光值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡

SMMC7721 肝癌細(xì)胞經(jīng)蛇床子素干預(yù)48 h 后，用預(yù)冷的PBS 沖洗細(xì)胞2 次，0.25%胰酶-EDTA 消化細(xì)胞，4℃下1000 rpm 離心5 min，與收集的懸浮細(xì)胞合并，以PBS 重懸，取1× 105個(gè)細(xì)胞，在1ml 預(yù)冷70%乙醇中4℃固定過(guò)夜。4℃下1000 rpm 離心5 min 去除乙醇，用預(yù)冷的PBS 沖洗細(xì)胞2 次；加入0.5 毫升/管PI/RNase 染液，輕輕搖勻，室溫下避光孵育30 min；在流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)1 × 104個(gè)細(xì)胞，根據(jù)所測(cè)定細(xì)胞的DNA含量，分析細(xì)胞周期。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)如下：將6 孔板上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 管中（含部分死亡的細(xì)胞），加入0.5 mL/孔PBS，輕輕搖晃，并轉(zhuǎn)移到相應(yīng)管中（含部分死亡的細(xì)胞）；0.25% 胰 酶-EDTA 消 化 細(xì) 胞，加 入0.5 mL/孔1 ×Binding Buffer，輕輕搖晃，并轉(zhuǎn)移到相應(yīng)管中。1000 rpm 離心5 min，吸棄上清溶液；加入2 mL PBS，輕輕搖晃，1000 rpm 離心5 min，棄上液，洗滌2 次；加入100 μL/管1 × Binding Buffer，輕彈管底重懸細(xì)胞；加入5 μL/管V-FITC 到各管（除空白和PI對(duì)照管外），輕輕混懸，室溫下避光孵育10 min，加入2 μL/管PI到各管（除空白和V-FITC 對(duì)照管外），輕輕混懸，室溫下避光孵育10 min；加入0.5 毫升/管預(yù)冷的PBS 到全部管中，輕輕混懸；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（RT-qPCR）檢測(cè)基因表達(dá)

按照TRIzol 試劑說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA，采用NanoDrop 2000 檢測(cè)RNA 濃度和純度，然后采用PrimeScript?RT reagent Kit 試 劑 盒 將RNA 反 轉(zhuǎn) 錄 為cDNA，cDNA 稀釋5 倍后采用SYBR?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)Ⅱ進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，擴(kuò)增條件為95℃30 s, 95℃5 s, 60℃for 30 s for 40 cycles. 最后采用ΔΔ CT 法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量，以β-actin 作為內(nèi)參照。

1.2.5 Western blot技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)

以RIPA 裂解液裂解細(xì)胞抽提總蛋白質(zhì)，離心后取上清液，并加入5 × Sample buffer 在沸水中變性蛋白，然后通過(guò)BCA 法定量后采用10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白、并轉(zhuǎn)膜至PVDF上。采用5%脫脂奶粉封閉膜蛋白1 h，然后采用相關(guān)蛋白抗體4℃孵育過(guò)夜，各一抗稀釋濃度分別為：Bax 抗體(1∶2 000)、Bcl-2 抗體(1∶2 000)、CDK4 抗 體(1∶1 000)、CyclinD1 抗 體(1∶30 000)、CyclinE1 抗體(1∶1 000)、p27Kip1抗體(1∶1 000)、GRP78 抗體(1∶1 000)、GRP94 抗體(1∶1 000)、PERK 抗體(1∶1 000)、CHOP 抗體(1∶1 000)、p-eIF2α(Ser51)抗體(1∶1 000)、XBP-1S 抗 體(1∶1 000)、β-actin 抗 體(1∶20 000)。次日，采用含0.1% Tween-20 的TBST buffer洗滌膜，再將二抗加入5%脫脂奶粉封閉液孵育1.5 h，然后以TBST buffer 洗滌膜3 次，最后采用ELC 化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad.Prism6.0 專業(yè)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。計(jì)量資料以means±SD 表示，多組比較采用Newman-Keuls post-hoc 方差分析，兩組比較采用ttests (nonparametric tests)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

蛇床子素，是從傘形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實(shí)中提取出來(lái)的一種有效成分，化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，其分子結(jié)構(gòu)（圖1），分子式為C15H16O3，分子量244.29，可溶解于DMSO。

圖1 蛇床子素分子結(jié)構(gòu)圖

2.2 蛇床子素抑制SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖

與對(duì)照組（Con）比較，蛇床子素干預(yù)24 h 后，100 μM 蛇床子素對(duì)SMMC7721 肝癌細(xì)胞增殖抑制率為36.76%（P＜0.05）；干預(yù)48 h 后，60-100 μM 蛇床子素對(duì)SMMC7721 肝癌細(xì)胞增殖抑制率為30.84%-52.49%（P＜0.05）；干預(yù)72 h 后，40-100 μM 蛇床子素對(duì)SMMC7721 肝癌細(xì)胞增殖抑制率為32.7%-73.15%（P＜0.05）（表2）。提示蛇床子素具有顯著抑制SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖的作用。

表2 蛇床子素對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖的抑制率（±s，n = 4）

表2 蛇床子素對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖的抑制率（±s，n = 4）

注：與對(duì)照組比較，*表示P ＜0.05，**表示P ＜0.01。下同

濃度/μM 0(Con)20 40 60 80 100抑制率/%72 h 0.16±2.06 21.37±5.88 32.97±4.71*47.70±4.54*56.93±1.37**73.15±2.84**24 h-0.18±1.57 12.60±9.81 22.45±5.39 19.57±5.64 21.19±5.59 36.76±8.31*48 h-0.15±3.12 15.33±3.97 24.96±4.66 30.84±3.42*40.23±3.84*52.49±4.05**

2.3 蛇床子素對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞周期的影響

與Con 組比較，60 μM 蛇床子素干預(yù)SMMC7721肝癌細(xì)胞48 h 后，G1 期細(xì)胞數(shù)增加、G2 期和S 期減少（P＜0.05），而0.1 μM 毒胡蘿卜素（TG）導(dǎo)致G1期顯著增 加（P＜0.05）（圖2）。提示蛇床子素能夠?qū)MMC7721肝癌細(xì)胞阻滯在G1期，從而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

圖2 蛇床子素對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞周期的影響

2.4 蛇床子素對(duì)SMMC7721 肝癌細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

與Con 組比較，60 μM 蛇床子素顯著抑制CyclinD1、CyclinE1和p27Kip（1CDKN1B）蛋白表達(dá)，然而0.1 μM TG 均顯著抑制CyclinD1、CyclinE1、p27Kip1和CDK4蛋白表達(dá)，（圖3）。提示蛇床子素和毒胡蘿卜素通過(guò)抑制CyclinE1的表達(dá)，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用。

圖3 蛇床子素對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

2.5 蛇床子素誘導(dǎo)SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡

采用20-80 μM 蛇床子素干預(yù)SMMC7721 肝癌細(xì)胞48 h 后，與Con 組比較，60-80 μM 蛇床子素具有誘導(dǎo)SMMC7721肝癌細(xì)胞晚期凋亡的作用（P＜0.05）（圖4）。提示蛇床子素能夠誘導(dǎo)SMMC7721 肝癌細(xì)胞凋亡。

2.6 蛇床子素對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡蛋白的影響

與Con 組比較，不同濃度蛇床子素干預(yù)SMMC7721 肝癌細(xì)胞48 h 后，對(duì)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)無(wú)明顯影響，但是60-80 μM 蛇床子素顯著抑制促凋亡蛋白Bax 表達(dá)（圖5）。提示蛇床子素誘導(dǎo)SMMC7721 肝癌細(xì)胞凋亡與抑制Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)關(guān)系不大。

圖4 蛇床子素促進(jìn)SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡

圖5 蛇床子素對(duì)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的作用

2.7 蛇床子素量效對(duì)SMMC7721 肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)的影響

與Con 組比較，不同濃度蛇床子素處理SMMC7721 肝癌細(xì)胞48 h 后，均顯著促進(jìn)GRP78、DDIT3（CHOP）和ATF4基因表達(dá)（P＜0.05）；20 μM 蛇床子素顯著促進(jìn)GADD34和EIF2A基因表達(dá)（P＜0.05），（表3）。提示 蛇 床子素通過(guò)上調(diào)GRP78、DDIT3、ATF4和EIF2A等基因表達(dá)，誘發(fā)SMMC7721肝癌細(xì)胞發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)過(guò)程，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程。

表3 不同濃度蛇床子素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因mRNA表達(dá)的作用

與Con 組比較，不同濃度蛇床子素均顯著促進(jìn)FOXO3、RICTOR 和SGK1 基因表達(dá)（P＜0.05）；80μM蛇床子素顯著促進(jìn)GDF15 基因表達(dá)（P＜0.05），結(jié)果（表4）。提示蛇床子素通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞增殖基因表達(dá)抵御性增強(qiáng)。

表4 不同濃度蛇床子素對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)的作用

2.8 蛇床子素對(duì)SMMC7721 肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響

與Con 組比較，0.1 μM TG 非常顯著增強(qiáng)GRP78、XBP-1s、GRP94 蛋 白表達(dá)，60 μM 蛇床子素可促進(jìn)CHOP、XBP-1s 蛋白表達(dá)，然而對(duì)蛇床子素對(duì)GRP78、GRP94、PERK、p-eIF2α(Ser51)蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響（圖6）。提示蛇床子素通過(guò)促進(jìn)CHOP 及XBP-1s 蛋白表達(dá)，誘發(fā)SMMC7721肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生。

圖6 蛇床子素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

蛇床子素是蛇床子的主要活性成分，屬香豆素類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗心律失常、雄激素樣和促性腺激素樣等作用[2]。而蛇床子在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中藥性味辛、苦、溫，歸腎經(jīng)，外用具有祛風(fēng)燥濕、殺蟲(chóng)止癢作用，內(nèi)服具有溫腎壯陽(yáng)的功效；用于陰癢帶下，濕疹瘙癢，濕痹腰痛，腎虛陽(yáng)痿，宮冷不孕等病證。雖然古代本草沒(méi)有記載蛇床子可治療類(lèi)似腫瘤相關(guān)的病證，但是近現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蛇床子及蛇床子素具有抗腫瘤活性[34]。本文在我們前期探索蛇床子素可抑制Y1 小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞和AtT20小鼠垂體瘤細(xì)胞增殖基礎(chǔ)上[10,11]，進(jìn)一步研究了蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，在體外發(fā)現(xiàn)蛇床子素具有明確的抑制SMMC7721人肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。并深入揭示蛇床子素通過(guò)影響細(xì)胞周期以抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而揭示了蛇床子素體外抗肝癌作用的分子機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素具有抑制體外培養(yǎng)的SMMC7721 人肝癌細(xì)胞增殖作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，并隨藥物干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，呈現(xiàn)更強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。有研究報(bào)道，蛇床子素對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞及MCF-7/ADR 多藥耐藥性乳腺癌細(xì)胞均具有增殖抑制作用，IC50值約58 μM[12]。20-100 μg·mL-1蛇床子素對(duì)小鼠肺腺癌LA795 細(xì)胞和人肝癌Bel-7402 細(xì)胞增殖也具有顯著抑制作用，且相同濃度下對(duì)LA795 細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)烈[13]。30-120 μM 蛇床子素對(duì)人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間濃度依賴性，而且蛇床子素可誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡[14]。40-200 μM 蛇蛇床子素均可明顯抑制人宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。50-200 μM蛇床子素呈劑量依賴性地抑制人肺癌NCI-H460 細(xì)胞的增殖及凋亡[16]。從文獻(xiàn)報(bào)道提示，蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞增殖均具有抑制作用，說(shuō)明蛇床子素可以作為抗腫瘤研究的候選中藥單體成分，值得關(guān)注。

然而，蛇床子素抑制肝癌細(xì)胞增殖是否與細(xì)胞周期有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可以導(dǎo)致SMMC7721肝癌細(xì)胞G1 期細(xì)胞數(shù)增加,G2 期和S 期細(xì)胞數(shù)減少；進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)蛇床子素顯著抑 制CyclinD1、CyclinE1 和p27Kip1蛋 白 表 達(dá)。 而CyclinD1、CyclinE1 蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)程中起到非常重要的作用，是細(xì)胞周期素依賴激酶（CDK）的正調(diào)節(jié)因子；正常情況下，CyclinD1、CyclinE1 與CDK 相結(jié)合，從而促使細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期，使細(xì)胞發(fā)生分裂與增殖。研究表明，細(xì)胞周期紊亂是腫瘤細(xì)胞尤其是惡性癌變的重要特征，蛇床子素可通過(guò)促進(jìn)G1 期阻滯以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制MCF-7 乳腺癌細(xì)胞增殖[17]。此外，蛇床子素能明顯改善阿爾茨海默病模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，減少神經(jīng)元凋亡，增加S期細(xì)胞百分率，促進(jìn)G2/M 期細(xì)胞進(jìn)一步分裂，增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，有利于維持神經(jīng)元正常的生理功能[18]。提示蛇床子素通過(guò)抑制CyclinE1 的表達(dá)，阻止細(xì)胞進(jìn)入S 期，從而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，而蛇床子素調(diào)控細(xì)胞周期蛋白是其抗癌作用的重要靶點(diǎn)。

在發(fā)現(xiàn)了蛇床子素抑制SMMC7721 肝癌細(xì)胞增殖基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步觀察到蛇床子素還可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)生。本研究表明，蛇床子素具有誘導(dǎo)SMMC7721 肝癌細(xì)胞晚期凋亡的作用，并呈現(xiàn)量效關(guān)系，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。且發(fā)現(xiàn)蛇床子素顯著抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，然而對(duì)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)無(wú)明顯影響，提示蛇床子素誘導(dǎo)SMMC7721 肝癌細(xì)胞凋亡與抑制Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)關(guān)系不大。研究表明，蛇床子素也能抑制人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，能顯著降低Bcl-2 蛋白表達(dá)，但對(duì)Bax 蛋白表達(dá)無(wú)影響[19]，提示蛇床子素對(duì)SMMC7721 和HepG2 肝癌細(xì)胞作用機(jī)制的差異性。同樣，有報(bào)道蛇床子素呈現(xiàn)劑量與時(shí)間依賴性抑制人骨肉瘤SAOS-2 細(xì)胞活力，且增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，減弱抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)[20]。提示蛇床子素誘導(dǎo)SMMC7721 細(xì)胞凋亡與其他細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制的不同。

由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度蛇床子素具有顯著增強(qiáng)GRP78、DDIT3（CHOP）和ATF4基因表達(dá)作用，而且GADD34和EIF2A基因表達(dá)也受蛇床子素上調(diào)，且蛇床子素顯著促進(jìn)CHOP及XBP-1s蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)，提示蛇床子素通過(guò)誘發(fā)SMMC7721 肝癌細(xì)胞發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)過(guò)程，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)精細(xì)的膜系統(tǒng)，有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，主要參與膜蛋白的合成和分泌、蛋白質(zhì)的正確折疊、Ca2+儲(chǔ)藏、脂質(zhì)與膽固醇合成和代謝等過(guò)程。外在或內(nèi)在因素的影響，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。細(xì)胞內(nèi)未折疊蛋白反應(yīng)主要涉及3條信號(hào)通路：即雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶樣ER激酶（PERK）通路，肌醇需酶1（IRE1）通路，活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）通路。其中，CHOP（DDIT3）即激活凋亡分子C/EBP 同源蛋白，正常情況下CHOP處于低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素等均可顯著激 活PERK、IRE1 和ATF6 這3 條信號(hào)通路以增強(qiáng)CHOP的表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道蛇床子素通過(guò)降低GRP78蛋白水平、增加CHOP 蛋白表達(dá)以抑制成骨細(xì)胞增殖[21]，而蛇床子素對(duì)其他腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有明確的促進(jìn)GRP78及其下游CHOP、ATF4和GADD34分子表達(dá)的作用，誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)，推測(cè)可能是誘發(fā)SMMC7721 肝癌細(xì)胞凋亡的主要原因。此外，蛇床子素均顯著促進(jìn)FOXO3、RICTOR、SGK1和GDF15基因表達(dá)，推測(cè)蛇床子素可能通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞增殖基因表達(dá)抵御性增強(qiáng)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素通過(guò)將細(xì)胞阻滯在G1期抑制SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖，并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂從而持續(xù)性誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)生。該研究豐富了蛇床子素抗肝癌作用的新藥理學(xué)機(jī)制。