中風(fēng)病急性期痰熱證與MMP-1和MMP-3表達(dá)的影響＊

郭春莉，付 強(qiáng)，高 穎

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100091；2. 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院 北京 100191；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 北京 100700）

中風(fēng)病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，已成為第一位致殘和死亡的原因[1]。雖然超早期溶栓和急性期神經(jīng)元保護(hù)取得了重要進(jìn)展，但對(duì)于大多數(shù)腦缺血患者而言，神經(jīng)元死亡不可避免[2]，患者多需要他人幫助才能完成日常生活活動(dòng)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶類(lèi)之一，在大腦的血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中都存在許多種類(lèi)的MMPs，在出現(xiàn)腦缺血或者缺血的灌注損傷時(shí)，MMPs 被激活開(kāi)始破壞基質(zhì)和開(kāi)放血腦屏障，導(dǎo)致腦水腫，促進(jìn)急性腦梗死發(fā)病[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶家族在人的動(dòng)脈斑塊損傷部位表達(dá)。激活的MMPs 降解纖維帽的結(jié)構(gòu)基質(zhì)組成，包括膠原纖維和彈力纖維，削弱纖維帽，成為斑塊不穩(wěn)定的主要因素。在外在觸發(fā)條件下，斑塊破裂，釋放大量組織因子、激活血小板和凝血系統(tǒng)，形成血栓，導(dǎo)致腦血管疾病[4]。MMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中表達(dá)量最高的間質(zhì)膠原酶，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脂質(zhì)核心強(qiáng)烈表達(dá)MMP-1，局部血壓增高，血流剪切力增強(qiáng)，可使血管壁合成MMP-1 增加，所以MMP-1 的表達(dá)與斑塊破裂存在正相關(guān)，MMP-1 含量越高之處，斑塊越易破裂[5]。Carrell 把動(dòng)脈硬化損傷分成兩類(lèi):①血管壁膠原數(shù)量增加致使血管腔變窄；②動(dòng)脈瘤的出現(xiàn)使管腔體積變小，管腔發(fā)生破裂。目前研究表明，兩種管壁損傷中都出現(xiàn)了MMP-1水平增高[6]，表明MMP-1 可能和動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程存在重要的關(guān)系。MMP-3 也是在動(dòng)脈粥樣斑塊中表達(dá)的MMPs 家族的主要成員，它廣泛存在于動(dòng)脈粥樣病變處，在斑塊破裂中起重要作用，如果頸動(dòng)脈B 超發(fā)現(xiàn)軟斑塊結(jié)合臨床血漿MMP-3 升高，可進(jìn)一步反應(yīng)斑塊的不穩(wěn)定性，要積極地抗炎治療，以預(yù)防及控制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，并預(yù)防和控制TIA進(jìn)一步發(fā)展為腦梗死[7]。Henney等運(yùn)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)到冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-3 的轉(zhuǎn)錄物與巨噬細(xì)胞共同存在于斑塊的肩部[8]。Silence Y 等[9]的研究也證實(shí)MMP-3 可通過(guò)降解基質(zhì)成分而與斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)，從而認(rèn)為，MMP-3 血清水平與頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性有關(guān)，可能是反映動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的新的指標(biāo)。臨床證據(jù)表明，中藥對(duì)缺血性卒中治療有效，其主要是通過(guò)干預(yù)證候達(dá)到改善或治療疾病，臨床研究提示，中風(fēng)急性期約有40%-50%的病人表現(xiàn)出痰熱證，中醫(yī)藥對(duì)中風(fēng)病急性期痰熱證的治療也突顯優(yōu)勢(shì)，之前的研究顯示MMP-2 與中風(fēng)病急性期痰熱證存在相關(guān)性，可以成為微觀辨證的依據(jù)，MMP-1 和MMP-3 亞型與腦梗塞的分型目前有一些相關(guān)性研究，MMP-1 和MMP-3與中風(fēng)病急性期痰熱證是否存在相關(guān)性，其相關(guān)性研究能否形成微觀辨證的依據(jù)，以及能否成為證候診斷及療效評(píng)價(jià)的依據(jù)對(duì)中醫(yī)藥治療中風(fēng)病具有重要的意義，目前未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

1 研究資料和方法

1.1 臨床資料

本研究數(shù)據(jù)來(lái)源于2013 年8 月-2015 年5 月發(fā)病7 天內(nèi)就診于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院的缺血性中風(fēng)痰熱證患者45 名，非痰熱證44 名，發(fā)病年齡均為35-85歲。

1.2 篩選中風(fēng)病急性期受試者

1.2.1 疾病診斷

疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2005年衛(wèi)生部疾病控制司、中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)頒布的《中國(guó)腦血管病防治指南（試行版）》的腦梗塞診斷部分。

1.2.2 證候診斷

證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照973 計(jì)劃“缺血性中風(fēng)病證結(jié)合的診斷標(biāo)準(zhǔn)與療效評(píng)價(jià)體系研究”課題組制定的《缺血性中風(fēng)證候要素診斷量表》。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)；起病7 天以內(nèi)；年齡≥35 歲且≤85歲者。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

蛛網(wǎng)膜下腔出血者；既往有腫瘤、造血系統(tǒng)疾病者；有精神性疾病患者；不配合者。

1.3 臨床信息采集

所有入選受試者均填寫(xiě)統(tǒng)一表格，表格內(nèi)容主要是人口學(xué)資料、病史調(diào)查，中風(fēng)病急性期受試者并填寫(xiě)病例觀察表、中風(fēng)病證候要素診斷量表，分為痰熱組和非痰熱組，均于入院后第1 d 清晨空腹取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清MMP1和MMP-3水平。

1.4 研究方法

1.4.1 證候量化評(píng)定

經(jīng)過(guò)統(tǒng)一組織的量表使用培訓(xùn)后，由納入之日由腦病科醫(yī)師使用《缺血性中風(fēng)證候要素診斷量表》，對(duì)每例患者分別作出內(nèi)風(fēng)證、內(nèi)火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10分診斷成立）。

1.4.2 受試者血清MMP1和MMP3的測(cè)定

在缺血性中風(fēng)病起病第7 d 采肘靜脈血10 mL，留取標(biāo)本后盡快注入EDTA 抗凝管內(nèi)，4℃、3000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，-20℃至-80℃保存待測(cè)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中MMP1 和MMP-3的含量（ng·mL-1）。

1.5 實(shí)施過(guò)程及結(jié)果

1.5.1 試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀：芬蘭（LabsystemsMultiskan MS），儀器型號(hào)：352 型；洗板機(jī)：（芬蘭）Thermo Labsystems，儀器型號(hào)：AC8；離心機(jī)：微量高速離心機(jī)（國(guó)產(chǎn)），儀器型號(hào)：TG16W；培養(yǎng)箱：隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國(guó)產(chǎn)），儀器型號(hào)：GNP-9080型。

1.5.2 操作步驟

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：標(biāo)準(zhǔn)品按照說(shuō)明書(shū)稀釋好五個(gè)梯度，各個(gè)梯度每孔加樣量都為50 μl，

加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

配液洗滌：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

顯色：每孔先加入顯色劑A50 μl，再加入顯色劑B50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min.

終止：每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)

測(cè)定：以空白空調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min 以內(nèi)進(jìn)行。（主波長(zhǎng)450，輔助波長(zhǎng)630）

1.5.3 計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0版本，組內(nèi)數(shù)據(jù)分析采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間分析采取單向方差分析的方法.

表1 痰熱組和非痰熱組MMP1（ng·mL-1）含量測(cè)定參數(shù)

表2 痰熱組和非痰熱組MMP3（ng·mL-1）含量測(cè)定參數(shù)

2 研究結(jié)果

研究結(jié)果如下圖所示：

研究共納入缺血性中風(fēng)患者89名，研究人員經(jīng)過(guò)統(tǒng)一組織的量表使用培訓(xùn)后，由腦病科醫(yī)師使用《缺血性中風(fēng)證候要素診斷量表》，對(duì)每例患者分別作出內(nèi)風(fēng)證、內(nèi)火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10 分診斷成立）。痰熱證患者45名，非痰熱證44名，所有入選受試者均填寫(xiě)統(tǒng)一表格，表格內(nèi)容主要是人口學(xué)資料（指調(diào)查患者的個(gè)人信息，包括患者姓名、性別、出生日期、家庭住址、聯(lián)系電話等）、病史調(diào)查（既往史、家族史、過(guò)敏史、生命體征、一般內(nèi)科情況、神經(jīng)系統(tǒng)檢查等），中風(fēng)病急性期受試者并填寫(xiě)病例觀察表、中風(fēng)病證候要素診斷量表。結(jié)果顯示，發(fā)病7天內(nèi)中風(fēng)病痰熱組MMP-1和MMP-3的表達(dá)較非痰熱組比較，P＞0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異。

3 討論

中藥對(duì)缺血性卒中治療有效，其主要是通過(guò)干預(yù)證候達(dá)到改善或治療疾病，因此證候的規(guī)范化研究一直是中風(fēng)病診療研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

“辨證論治”被認(rèn)為是中醫(yī)學(xué)術(shù)思想的精髓，已經(jīng)成為指導(dǎo)中醫(yī)臨床診斷和治療的基礎(chǔ)。“辨證”就是對(duì)病人四診所收集的臨床信息進(jìn)行概括、判斷為某種證候，是論治的前提和依據(jù)，“論治”是根據(jù)辨的證候來(lái)確定治法和處方譴藥，因此“證候”是連接中醫(yī)學(xué)理論和臨床研究的核心與關(guān)鍵問(wèn)題。傳統(tǒng)中醫(yī)只能依靠望、聞、問(wèn)、切來(lái)獲取患者的臨床信息等病情資料，臨床信息分辨率低、信息量小，模糊性大，信息收集過(guò)程中主觀性很大，而且受到個(gè)人師承、臨床經(jīng)驗(yàn)、認(rèn)知水平和方法及不同時(shí)代的不同，導(dǎo)致辨出的證候差別很大，使得辨證的精確性和重復(fù)性較差，影響了研究結(jié)論的真實(shí)性和可靠性，而且證候的概念模糊不清，表現(xiàn)出對(duì)證候名稱(chēng)及其內(nèi)涵描述的經(jīng)驗(yàn)化和隨意性。所以，目前的中醫(yī)證候描述存在不確定性、中醫(yī)病名描述缺乏規(guī)范性，隨意性較大，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不利于中醫(yī)、西醫(yī)理論的滲透和溝通，不利于自身的學(xué)術(shù)交流與對(duì)外交流，急需對(duì)證候規(guī)范化提出新的要求。

宏觀辨證是指以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，根據(jù)四診所取得的信息，判斷出因、位、病、勢(shì)的辨證方法。微觀辨證是運(yùn)用現(xiàn)代科技方法對(duì)中醫(yī)證候內(nèi)在的病理、生化等方面的客觀指標(biāo)進(jìn)行分析，目的是深入探討證候的內(nèi)在機(jī)理，揭示其發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而用客觀指標(biāo)補(bǔ)充中醫(yī)病證診斷標(biāo)準(zhǔn)。宏觀辨證客觀化，微觀指標(biāo)整體化，宏觀辨證與微觀辨證有機(jī)地結(jié)合有利于證候診斷與評(píng)價(jià)的客觀化，有利于中西醫(yī)結(jié)合工作的推動(dòng)。

王永炎院士對(duì)于證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究方面，提出了重要的“證候概念及其屬性”理論[10]：即證候是一個(gè)非線性的“內(nèi)實(shí)外虛”、“動(dòng)態(tài)時(shí)空”和“多維界面”的復(fù)雜系統(tǒng)，所謂“實(shí)”是指最能反映證候病機(jī)的權(quán)重最大的關(guān)鍵內(nèi)容，是群體在某一特定病變過(guò)程中所具有的共性癥狀信息，是治則干預(yù)的依據(jù)。“虛”是指某一患者所表現(xiàn)的一系列個(gè)性化癥狀信息，對(duì)干預(yù)原則和方法具有一定影響作用。其中“內(nèi)實(shí)外虛”是證候最重要的特性，這對(duì)于證候的基礎(chǔ)研究有著重要的指導(dǎo)意義?；谧C候概念的新詮釋?zhuān)飳W(xué)指標(biāo)與中醫(yī)證候是否相關(guān)，或者說(shuō)中醫(yī)證候微觀指標(biāo)的研究成為了難點(diǎn)、熱點(diǎn)。證候與生物學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性研究也取得了豐碩成果，主要表現(xiàn)在以下方面：①篩查某一證候可能發(fā)生變化的指標(biāo)；②某一疾病的西醫(yī)診斷指標(biāo)和其中醫(yī)證型之間相關(guān)性的研究；③不同疾病同一證候微觀指標(biāo)異同的研究；④證候主要癥狀特征的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)闡釋[11]。例如近些年對(duì)血瘀證的研究報(bào)道較多，在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)了許多與血瘀證相關(guān)的指標(biāo)，并將微循環(huán)障礙、血流變異常、血液凝固性增高或纖溶活性降低等6 項(xiàng)指標(biāo)補(bǔ)充到了血瘀證的診斷標(biāo)準(zhǔn)中[12]。危氏等[13]通過(guò)對(duì)多種疾病的證候與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性的分析，臨床觀察了慢性胃炎和潰瘍病患者102例，脾胃虛弱證組與脾胃濕熱證相比，脾胃濕熱證的幽門(mén)彎曲桿菌陽(yáng)性率明顯高于脾胃虛弱證，說(shuō)明幽門(mén)彎曲桿菌感染與中醫(yī)證候有一定相關(guān)性。

以高穎教授牽頭的國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”課題組（No.2009ZX09502-028），國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973 計(jì)劃）課題組（No.2003CB517102）既往動(dòng)態(tài)采集175 例急性缺血性中風(fēng)病患者四診信息，并判斷其證候要素，應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘手段探討缺血性中風(fēng)急性期證候與生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HSP70、ICAM-1、MMP9 可能是缺血性中風(fēng)急性期血瘀證的微觀指標(biāo)，HSP70 可能為氣虛證的微觀指標(biāo)。以上研究結(jié)果均為本課題的實(shí)施提供研究基礎(chǔ)。

臨床研究提示，中風(fēng)急性期約有40%-50%的病人表現(xiàn)出痰熱證，痰為氣血津液代謝紊亂的產(chǎn)物，為有形之邪，具有黏稠重濁之性，易與火熱相結(jié)，二者交結(jié)難解，不易變化。便秘便干、舌苔黃膩、脈弦滑構(gòu)成中風(fēng)病急性期痰熱證的基本證候特征及辨證要點(diǎn)[14]。王永炎院士指出中風(fēng)病急性期病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，證候變化多端，病勢(shì)發(fā)展迅猛，難以駕馭，且變證壞證頻見(jiàn)，極易產(chǎn)生神昏、竅閉、厥脫等，為難治重證，提出了“毒損腦絡(luò)”中風(fēng)病機(jī)理論的觀點(diǎn)。中醫(yī)藥對(duì)中風(fēng)病急性期痰熱證的治療也突顯優(yōu)勢(shì)。

大量臨床實(shí)踐證明痰熱證是中風(fēng)病急性期的常見(jiàn)證候，痰熱證的證候演變特點(diǎn)及其與神經(jīng)功能缺損程度密切相關(guān)，中醫(yī)藥主要是通過(guò)干預(yù)中風(fēng)病痰熱證證候因素以改善癥狀或治療疾病。本研究結(jié)合前期研究的基礎(chǔ)上，以王永炎院士提出的“證候概念及其屬性”理論為依據(jù)，以痰熱證與基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)亞型的關(guān)系為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)中風(fēng)病急性期痰熱證的MMP-1 和MMP-3 的表達(dá)較非痰熱組無(wú)明顯差異，其原因解釋為：①雖然此次試驗(yàn)的結(jié)果為陰性，但是可能因受試者基礎(chǔ)疾病比較復(fù)雜，比如高血壓、糖尿病、高脂血癥、高同型半胱氨酸血癥以及吸煙、飲酒等生活習(xí)慣均可能影響MMP1、和MMP3，可以通過(guò)擴(kuò)大樣本量，避免其它諸多因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，來(lái)發(fā)現(xiàn)更為可靠的試驗(yàn)結(jié)果；②雖然本次研究顯示中風(fēng)病急性期痰熱證與MMP1、MMP3 無(wú)明顯相關(guān)性，試驗(yàn)結(jié)果為陰性，但中風(fēng)病急性期的痰熱證預(yù)后差，病情兇險(xiǎn)確實(shí)與基質(zhì)金屬蛋白酶的某些亞型可能存在相關(guān)性，今后的試驗(yàn)可以通過(guò)多檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶亞型來(lái)確定中風(fēng)病急性期與基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)一步對(duì)中風(fēng)病痰熱證證候診斷及療效評(píng)價(jià)提供更加客觀支持。