基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)葛根解肌退熱的作用機(jī)制Δ

高思佳，王 丹，王瑩瑩，楊玉雪，徐 卓，張 璐，周雪林，趙艷玲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100039； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053； 4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100069)

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，性涼，味甘辛，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)和解酒毒等功效[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，“葛根主身大熱、消渴”；《本草綱目》中也有關(guān)于葛根的記載，“葛，起陰氣、解諸毒，主治諸弊、身大熱、消渴”。葛根的解肌退熱和生津止渴作用為其最重要的功效。葛根多用于治療外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛及酒毒傷中等[1]。發(fā)熱是一種常見的機(jī)體防御性反應(yīng)，是機(jī)體正氣與病邪相爭(zhēng)或者體內(nèi)陰陽(yáng)失調(diào)的結(jié)果，主要包括外感發(fā)熱和內(nèi)傷發(fā)熱[2]。外感發(fā)熱是致病因素與人體正氣相互作用的結(jié)果，外界環(huán)境的變化、外邪傷害和機(jī)體正氣的盛衰是外感發(fā)熱病發(fā)病的關(guān)鍵因素，陽(yáng)熱盛極則壯熱不已；若邪熱耗傷人體陰精、津血，使陽(yáng)盛陰虛，則發(fā)熱遷延。內(nèi)傷發(fā)熱的基本病機(jī)為體內(nèi)臟腑功能失調(diào)，氣血陰陽(yáng)失衡[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期發(fā)熱或高熱持續(xù)不退，可導(dǎo)致細(xì)胞代謝增強(qiáng)，進(jìn)一步升高耗氧量，使心率加快，增加心輸出量；炎癥反應(yīng)誘發(fā)的炎性因子可增加耗氧量，加速肌肉分解，導(dǎo)致消瘦[4]。此外，發(fā)熱時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮，可能導(dǎo)致頭痛、頭暈；持續(xù)發(fā)熱又可抑制神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致嗜睡或者昏迷等。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討葛根解肌退熱的作用機(jī)制，進(jìn)一步分析其作為常用解表藥治療發(fā)熱的合理性及針對(duì)性，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究及臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 葛根藥物靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)獲得葛根所含的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，再依據(jù)相似性比對(duì)中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http：//lifecenter.sgst.cn/hit/)[5]和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)[6]進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，建立葛根藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.2 發(fā)熱相關(guān)疾病靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)[7]篩選發(fā)熱相關(guān)疾病靶點(diǎn)，建立發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。以上人類的靶點(diǎn)連接蛋白通過(guò)交互蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doembi.ucla.edu)獲得。將以上靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別碼形式。

1.3 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

為了更合理地闡明葛根中被鑒定的活性成分與發(fā)熱靶點(diǎn)之間的關(guān)系，將葛根活性化學(xué)成分、成分相關(guān)靶點(diǎn)、發(fā)熱相關(guān)疾病靶點(diǎn)和交互蛋白靶點(diǎn)連接成“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。將所得網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件進(jìn)行可視化分析，并分析各靶點(diǎn)的相關(guān)拓?fù)鋮?shù)。以點(diǎn)度中心性、中介中心性和接近中心性3個(gè)拓?fù)鋮?shù)為篩選有效作用靶點(diǎn)的依據(jù)。

1.4 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路注釋分析

將“1.3”所得直接作用靶點(diǎn)的UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別碼導(dǎo)入功能注釋工具DAVID 6.8中進(jìn)行KEGG通路注釋分析，得出交互網(wǎng)絡(luò)中的直接作用靶點(diǎn)相關(guān)作用通路。

2 結(jié)果

2.1 葛根成分靶點(diǎn)和發(fā)熱疾病靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出葛根中13個(gè)化學(xué)活性成分，203個(gè)蛋白靶點(diǎn)，10個(gè)發(fā)熱相關(guān)作用靶點(diǎn)，522個(gè)交互蛋白，以上靶點(diǎn)將進(jìn)一步用來(lái)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

2.2 葛根解肌退熱的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

為了更清晰直觀地闡釋葛根解肌退熱的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-炎癥”交互網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步通過(guò)分析該網(wǎng)絡(luò)中各靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)值，篩選出較為重要的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)和相關(guān)的信號(hào)通路。圖1展示了葛根解肌退熱的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，圖中，三角形為藥物/成分，菱形為藥物/成分靶標(biāo)，六邊形為疾病靶標(biāo)，圓形為與靶標(biāo)存在相互作用的蛋白質(zhì)，正方形為藥物/成分直接作用的疾病靶標(biāo)。選取該圖中所有直接作用靶點(diǎn)，并計(jì)算其拓?fù)鋮?shù)點(diǎn)度中心性、中介中心性和接近中心性，結(jié)果見表1。圖2展示了葛根解肌退熱的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互作用網(wǎng)絡(luò)中與直接作用靶點(diǎn)直接相連靶點(diǎn)交互網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，凸顯了葛根中化學(xué)成分的直接作用靶點(diǎn)的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系；圖中，三角形為藥物/成分，六邊形為疾病靶標(biāo)，圓形為與靶標(biāo)存在相互作用的蛋白質(zhì)，正方形為藥物/成分直接作用的疾病靶標(biāo)；包含了12個(gè)化學(xué)成分，1個(gè)非直接藥物作用靶點(diǎn)，2個(gè)非直接發(fā)熱作用靶點(diǎn)和11個(gè)交互蛋白。圖3展示了葛根中化學(xué)成分與直接作用靶點(diǎn)的交互關(guān)系，圖中，正方形為藥物/成分直接作用的疾病靶標(biāo)，三角形為藥物/成分。

圖1 葛根解肌退熱的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 1 “Ingredients-target-disease” interactive network of radix puerariae in treatment of fever

2.3 KEGG通路注釋分析

基于以上分析結(jié)果，篩選出8個(gè)直接作用靶點(diǎn)作為本次KEGG通路注釋分析的參與靶點(diǎn)。將符合篩選條件的直接作用靶點(diǎn)呈遞到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG通路注釋分析。結(jié)果顯示，共篩選出10條信號(hào)通路，部分通路與炎癥反應(yīng)相關(guān)，見表2、圖4。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)計(jì)算機(jī)方法整合大量生物學(xué)信息來(lái)分析預(yù)測(cè)不同節(jié)點(diǎn)之間關(guān)聯(lián)性的綜合學(xué)科[8]。其優(yōu)勢(shì)在于可從蛋白、分子和基因等多層面揭示藥物對(duì)機(jī)體的作用及其機(jī)制，使研究具有靶向性。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特征，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這種多靶點(diǎn)、多途徑和多層次的評(píng)價(jià)系統(tǒng)方法在中藥的研究中有較好的預(yù)測(cè)作用，更加切合中醫(yī)藥的學(xué)術(shù)特點(diǎn)和實(shí)際情況，為解決現(xiàn)代中藥研究的熱點(diǎn)問(wèn)題發(fā)揮了巨大的作用[9-10]。

表1 葛根解肌退熱的直接作用靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析Tab 1 Topological parameter analysis on direct targets of radix puerariae in treatment of fever

圖2 葛根解肌退熱的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互作用網(wǎng)絡(luò)中與直接作用靶點(diǎn)直接相連靶點(diǎn)交互網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Target-interactive network directly connected to a direct target in “Ingredients-target-disease” interactive network of radix puerariae in treatment of fever

圖3 葛根解肌退熱的“成分-直接作用靶點(diǎn)”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 3 “Ingredients- direct target” interactive network of radix puerariae in treatment of fever

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探討了葛根解肌退熱的作用靶點(diǎn)及其可能機(jī)制。結(jié)果顯示，“Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator”(囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子)、“Prostaglandin G/H synthase 2”(前列腺素G/H合酶和環(huán)氧酶2)、“C-C motif chemokine 2”(C-C基序趨化因子2)、“Interleukin-1 beta”(白細(xì)胞介素1β)、“Prostaglandin G/H synthase 1”(前列腺素G/H合酶和環(huán)氧酶1)、“Glial fibrillary acidic protein”(膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白)、“Tyrosine-protein kinase BTK”[酪氨酸蛋白激酶(PTK)]和“Interleukin-6”(白細(xì)胞介素6)為葛根解肌退熱的直接作用靶點(diǎn)。其中，“ProstaglandinG/Hsynthase1”(前列腺素G/H合酶和環(huán)氧酶1)、“ProstaglandinG/Hsynthase2”(前列腺素G/H合酶和環(huán)氧酶2)是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，非甾體抗炎藥即以其為基礎(chǔ)發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用[11]。查閱文獻(xiàn)并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的KEGG通路富集結(jié)果，葛根可以通過(guò)“TNFsignalingpathway”(腫瘤壞死因子信號(hào)通路)、“NOD-likereceptorsignalingpathway”(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體信號(hào)通路)和“NF-kappaBsignalingpathway”(核轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)通路)等通路發(fā)揮解肌退熱作用。

表2 葛根解肌退熱的KEGG通路分析Tab 2 Analysis on KEGG pathway of radix puerariae in treatment of fever

圖4 葛根解肌退熱直接靶點(diǎn)的通路分析Fig 4 Pathway analysis of direct targets of radix puerariae in treatment of fever

綜合以上分析，葛根解肌退熱的機(jī)制主要與其干預(yù)機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步揭示了葛根解肌退熱的科學(xué)內(nèi)涵，為中藥的研究方法提供了新思路。