越鞠甘麥大棗湯增強突觸可塑性產(chǎn)生抗抑郁樣作用＊

周 童，張海樓，沈家敏，王 薇＊＊，薛文達＊＊，陳 剛

（1.南京中醫(yī)藥大學 醫(yī)學院?整合醫(yī)學學院 南京210023；2.南京中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院?中西醫(yī)結合學院中醫(yī)腦病重點實驗室 南京210023；3.暨南大學中醫(yī)學院 廣州510632）

抑郁癥是最常見的精神疾病之一，患有抑郁癥的人處于情緒紊亂、睡眠障礙的狀態(tài)[1]。目前治療抑郁的單胺類藥物通常起效較慢，且有大約1/3的病人對藥物沒有反應[2]。近年來，氯胺酮已被證明能迅速緩解抑郁癥狀，然而氯胺酮具有肝毒性、神經(jīng)毒性、成癮性等副作用，導致其臨床應用范圍大大減少[3]。抑郁癥許多方面與中醫(yī)“郁證”中的“情志之郁”比較類似。越鞠丸和甘麥大棗湯是中醫(yī)治療“郁證”的經(jīng)典方。越鞠丸出自《丹溪心法》，為治六郁證的代表方。方中香附行氣舒肝開郁，以治氣郁；川芎為血中之氣藥，既行氣開郁，又可活血祛瘀，以治血郁；蒼術燥濕健脾，以治濕郁；神曲消食和胃，以治食郁；梔子清熱瀉火，以治火郁。甘麥大棗湯出自《金匱要略》，方中用小麥，取其甘涼之性，養(yǎng)肝補心，除煩安神；甘草甘平，補養(yǎng)心氣，和中緩急；大棗甘溫質潤，益氣和中，潤燥緩急。采用越鞠丸合甘麥大棗湯能夠行氣解郁、養(yǎng)心安神，療效顯著[4]。研究顯示越鞠甘麥大棗湯能夠通過激活AKT-mTOR信號通路，促進突觸后蛋白的表達，調節(jié)海馬神經(jīng)應激時或損傷后的突觸重塑，使得應激導致的神經(jīng)元損傷得到改善和恢復，從而產(chǎn)生快速的改善產(chǎn)后抑郁樣行為的作用[5]。在正常小鼠上也發(fā)現(xiàn)，越鞠甘麥大棗湯與氯胺酮單次灌胃24 h后即可緩解抑郁樣行為。

海馬是當今抑郁癥研究中的重點關注的腦區(qū)之一，并與情緒相關的大腦區(qū)域（如杏仁核）形成神經(jīng)纖維連接。海馬也可以調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸（The hypothalamic–pituitary–adrenal axis，HPA），使其更容易受到壓力和抑郁的影響[6]。對抑郁癥病人的臨床研究顯示，其海馬組織的體積變小，并且其海馬組織中的神經(jīng)元突觸數(shù)目明顯減少[7]。長時程增強（Long-term potentiation，LTP）指突觸傳遞的增強，是表明突觸可塑性的重要功能指標之一[8]。當暴露于壓力的刺激，包括反復束縛和社會失敗，會損害小鼠海馬的LTP[9]。另外，急性應激也可促進海馬PFC通路LTP的誘導[10]。因而，海馬突觸可塑性的改變可能是導致抑郁樣癥狀的原因之一[11]。

誘導LTP需要突觸前神經(jīng)元和突觸后神經(jīng)元同時活躍，突觸前神經(jīng)元釋放的谷氨酸與突觸后神經(jīng)元上的谷氨酸受體相互作用，包括NMDA受體（NMDAR）和AMPA受 體（AMPAR）[12]。AMPAR由GluR1-4四個亞基組成。阻斷AMPAR可以阻斷氯胺酮對小鼠和大鼠的抗抑郁作用，而增強的AMPAR信號則促進了這種抗抑郁作用[13]。藥理研究證據(jù)證明AMPAR亞基GluR1的持續(xù)上調表達對于LTP的誘導增強是必需的[14]。NMDAR由功能性亞基NR1和調節(jié)性亞基NR2A和NR2B組成[15]。臨床前研究表明抑制NMDAR是氯胺酮抗抑郁的機制之一[16]，但是Wang等[17]發(fā)現(xiàn)NMDAR亞基在抑郁樣小鼠海馬中的表達降低，接受抗抑郁藥之后表達升高，這可能是由于實驗動物品系和藥物的反應差異性所致。有研究報道稱NMDAR亞基的增加會誘導LTP的水平提高[18]。因此NMDAR及AMPAR的功能表達變化也是突觸可塑性的重要反映之一。

在本研究中，我們擬采用行為學測試和離體腦片電生理方法來分析越鞠甘麥大棗湯在昆明小鼠中的抗抑郁樣作用以及對小鼠海馬突觸傳遞的影響，并運用Western blot檢測AMPAR和NMDAR突觸相關蛋白的表達水平，從而探討越鞠甘麥大棗湯在昆明小鼠中如何通過影響突觸可塑性來緩解抑郁樣癥狀的神經(jīng)生物學機制，為臨床用藥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明雌性小鼠，7-8周齡，體質量為20 g-25 g，購自南京市青龍山動物繁殖場（動物合格證號：SCXK(蘇)2014-0002）。實驗前小鼠適應飼養(yǎng)環(huán)境1周，動物房環(huán)境溫度22℃-24℃，光/暗循環(huán)12 h，可以自由獲取食物和水。

1.2 實驗藥物

實驗用中藥材均購于南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂門診，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥學院楊連云教授鑒定，均為《中國藥典》2010年版收載品種。越鞠甘麥大棗湯由100 g川芎、100 g神曲、100 g香附、100 g梔子、100 g蒼術以及125 g炙甘草、250 g淮小麥、375 g大棗組成。將藥物加入8倍體積的純凈水浸泡30 min，沸后煎煮1 h，過濾，再加6倍體積的純凈水按上述方法煎煮后過濾，合并藥液并于65℃減壓旋蒸濃縮。藥物的終濃度為1 g/mL，給藥濃度為10 g/kg。配好的藥物分裝后于-20℃保存。鹽酸氯胺酮（ketamine，Ket）注射液為福建古田制藥廠生產(chǎn)（批號：20140301），臨用前用生理鹽水配成30 g/L的藥液。

1.3 實驗主要試劑和儀器

人工腦脊液（ACSF）（NaCl 124，KCl 5，NaH2PO41.25，NaHCO326，MgSO42，glucose 10，CaCl22 mmol/L，pH=7.4），實驗所用試劑均購自中國國藥公司。懸尾游泳視頻采集設備（上海吉量軟件科技有限公司）；ANY-maze動物行為分析系統(tǒng)（美國Stoelting公司）；旋轉蒸發(fā)儀（南京金正教學儀器有限公司，RE-852）；超聲清洗機（上海Branso公司，SB5200-型）；臺式離心機（德國Hermle公司，Z-32）；電子天平（METTLE公司，AE100）；振動切片機（德國Leica公司，VT1200S型）；電極拉制儀（德國DM公司）；顯微操縱儀（美國Sutter公司，ROE-200）；記錄分析軟件（美國Axon公司，PClamp10.1）；放大器（美國Axon公司，M ultiClamp700B）；可編程刺激器（以色列A.M.P.I公司，Master-8）；隔離器（以色列A.M.P.I公司）；蠕動泵（中國潤澤公司）。

1.4 方法

1.4.1 藥物劑量和持續(xù)性篩選

將小鼠隨機分為兩組：對照組和越鞠甘麥大棗湯組，對照組單次灌胃生理鹽水1次，前期研究中對越鞠甘麥大棗湯組設置不同劑量（5 g/kg、7.5 g/kg、10 g/kg、12.5 g/kg、15 g/kg）進行單次灌胃給藥1次。30 min后進行懸尾測試，2 h后進行強迫游泳測試。實驗結果顯示越鞠甘麥大棗湯劑量為10 g/kg時可顯著降低小鼠不動時間[5]，因而本研究選用10 g/kg作為越鞠甘麥大棗湯的使用劑量。

1.4.2 實驗動物分組

將小鼠隨機分為三組：對照組、中藥越鞠甘麥大棗湯組、西藥氯胺酮組。對照組給予灌胃生理鹽水1次，越鞠甘麥大棗湯組灌胃給予越鞠甘麥大棗湯1次（劑量為10 g/kg），氯胺酮組以西藥氯胺酮注射液（0.1 mL/10 g）給予腹腔注射。于單次給藥24 h和7天后進行懸尾測試和強迫游泳測試。

1.4.3 懸尾測試

TST是使用一個計算機系統(tǒng)進行的，該系統(tǒng)允許六只動物一次被錄像和測試。在隔音和視覺隔離的房間里，一只老鼠被懸掛于距離桌面30 cm的支架上，測試的總持續(xù)時間（6 min）可分為激動期和靜止期。6 min測試的最后4 min的總不動時間用行為學分析軟件（ANY-maze，USA）計算。

1.4.4 強迫游泳測試

將老鼠被從籠子里移走，分別放入一個透明的玻璃水槽（40厘米高，20厘米直徑），里面裝滿30厘米的水（22-23℃），允許它們游泳6 min。在測試結束時，這些動物被從水中移出，用紙巾擦干，然后放回到籠子里。當老鼠漂浮在水中而不掙扎的時候，它們就被認為是靜止的，它們只有做運動時，才能使它們的頭保持在水面上。在6 min測試期的最后4 min內，用軟件記錄下不動時間。

1.4.5 腦片切片制備

小鼠灌胃給予越鞠甘麥大棗湯，用異氟醚麻醉并處死。迅速取腦，淹沒在冰涼的人工腦脊液（ACSF）中，ACSF中提前半小時通入混合氣體（95% O2/5%CO2）。用振動組織切片機切取海馬背片（400 Mm）。在電生理記錄前，將切片在32℃ACSF中孵育至少60 min。

1.4.6 海馬腦片長時程增強作用（LTP）記錄

腦片孵育結束后轉移至灌流槽的載玻片上，用蓋網(wǎng)固定，以1-2 mL/min持續(xù)灌流腦片，并持續(xù)給予混合氣體（95%O2/5%CO2）。用鎳鉻電極刺激Schaffer側枝連合通路，玻璃記錄電極填充ACSF后放置在CA1區(qū)域來記錄興奮性突觸后場電位。連接MultiClamp 700B放大器，穩(wěn)定的基線記錄維持至少10 min。然后，在Schaffer側支通路上施加高頻刺激(HFS；100 pulses，100 Hz)。引起場電位幅度變化要大于40%并隨后記錄60 min，保持相同強度的刺激。

1.4.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測小鼠海馬GluR1、NR1、NR2A、NR2B、PSD95蛋白表達

將海馬組織稱重后，置于含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的Ripa緩沖液中。采用蛋白質A280法測定蛋白質濃度，然后用SDS-PAGE電泳分離蛋白裂解物，電泳結束后，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，轉膜結束后，3% BSA溶液室溫封閉膜1 h，分別用NR1（Cell Signaling Technology，5704S，1:1000）、NR2A（Cell Signaling Technology，2972S，1:1000）、NR2B（Cell Signaling Technology，4207S，1:1000）、PSD95（Cell Signaling Technology，3409S，1:1000）、GluR1（Cell Signaling Technology，13185S，1:1000）以 及 兔 抗βtubulin（proteintech，11224-1-AP，1:8000）的一抗于4℃下孵育過夜。然后用TBST緩沖液漂洗10 min，重復3次后，加入二抗（1:8000），于室溫下孵育1 h后加入Tanon發(fā)光液顯色。采用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon-5200）進行顯影分析。

1.5 統(tǒng)計分析

應用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件對多組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用T檢驗分析。

2 結果

2.1 越鞠甘麥大棗湯單次給藥能夠產(chǎn)生抗抑郁作用

懸尾測試結果顯示，與對照組相比，單次給予越鞠甘麥大棗湯或者氯胺酮24 h后，能夠顯著減少小鼠的不動時間（F(2,45)=18.79，P<0.001，圖1A），表現(xiàn)出抗抑郁樣作用；與對照組相比，單次給予越鞠丸7天后，同樣能夠顯著減少小鼠的不動時間，但是單次給予氯胺酮7天后，不能逆轉小鼠的抑郁樣行為（F(2,45)=17.67，P<0.001，圖1B）。在強迫游泳測試結果中，單次給予越鞠甘麥大棗湯或氯胺酮24 h后，同樣能夠顯著減少小鼠的不動時間（F(2,45)=7.079，P<0.01，圖1C），表現(xiàn)出抗抑郁樣作用；與懸尾結果一致，單次給藥7天后，越鞠甘麥大棗湯能夠顯著減少小鼠的不動時間，而氯胺酮不能產(chǎn)生這種作用（F(2,45)=7.304，P<0.01，圖1D）。這些結果均提示我們越鞠甘麥大棗湯能夠產(chǎn)生更持久的抗抑郁樣作用。

圖1 越鞠甘麥大棗湯在不同時間點的抗抑郁作用（-x±s，n=16）

2.2 小鼠給藥后海馬腦片的LTP記錄

給予HFS來誘發(fā)LTP，結果顯示給藥組小鼠的斜率顯著增加，提示給予HFS后均能在小鼠中誘發(fā)Schaffe側枝-CA1的神經(jīng)元突觸傳遞的明顯增強。其中，給藥24 h后，越鞠甘麥大棗湯組小鼠較對照組的平均fEPSP斜率顯著升高（P<0.001）（圖2A）；同樣在給藥7天后，和對照組相比，給藥組小鼠的平均fEPSP斜率也顯著升高（P<0.001）（圖2B）。

2.3 越鞠甘麥大棗湯對小鼠海馬組織中相關突觸蛋白表達的影響

研究顯示，給予越鞠甘麥大棗湯24 h（P<0.01）和7天（P<0.05）后，小鼠AMPAR亞基GluR1表達水平均顯著升高，氯胺酮組小鼠GluR1表達水平在給藥24 h后升高（P<0.01），而7天后與對照組相比沒有顯著差異（圖3A，3B）。給藥24 h后，NMDAR亞基NR2A表達水平較對照組明顯下降（P<0.05）（圖3C），而在給藥7天后，NR2A表達水平較對照組沒有統(tǒng)計學差異（圖3D）。NMDAR亞基NR2B表達水平在給藥24 h后較對照組均明顯升高（P<0.05），但是氯胺酮組給藥7天后不能上調NR2B的表達（圖3E，3F）。同樣越鞠甘麥大棗湯組小鼠的NMDAR亞基NR1表達水平在24 h和7天兩個時間點上均明顯高于對照組（P<0.05）（圖3G，3H），下游突觸蛋白PSD95的表達水平在給藥后同樣增加顯著（P<0.05）（圖3I，3J），而氯胺酮在單次給藥24 h后可上調NR1或PSD95的表達，但是7天后不能上調NR1或PSD95的表達（圖3G，3H，3I，3J）。

3 討論

在實驗室之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)越鞠丸單次灌胃給藥發(fā)揮快速抗抑郁樣作用，并可以持續(xù)至5天。而甘麥大棗湯有養(yǎng)心安神，補脾和中的效果，常加味或配伍其他方劑使用，常配伍的方劑如逍遙散、四逆散等。該方對于不同中醫(yī)證型的抑郁癥治療效果均較顯著。另外趙志宇等[19]通過對甘麥大棗湯進行拆方分析，發(fā)現(xiàn)其抗抑郁活性成分為一種具有較強抗氧化作用的黃酮類化合物——甘草苷。甘草苷可以改善抑郁模型快感缺乏的癥狀和絕望行為。因此將越鞠丸與甘麥大棗湯兩方合用，疏肝與健脾并施，養(yǎng)血與安神并舉，心肝脾三臟并調，在治療抑郁癥時可以發(fā)揮更好的作用。通過小鼠模型實驗發(fā)現(xiàn)，越鞠甘麥大棗湯單次灌胃24 h后即可緩解抑郁樣行為，而在此模型上，常規(guī)單胺類藥物至少需要7天以上處理時間才能產(chǎn)生作用。并且越鞠甘麥大棗湯單次給藥后的抗抑郁樣作用能夠持續(xù)到7天，比單方越鞠丸的抗抑郁樣作用更加持久。

圖2 小鼠給藥后海馬區(qū)不同時間點的LTP比較（±s，n=6）

圖3 小鼠海馬GluR1、NR2A、NR2B、NR1、PSD95蛋白表達水平（-x±s，n=6）

與此同時，我們發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)Schaffe側枝-CA1的LTP在給藥后24 h至第7天都顯著增強。進一步我們檢測了小鼠海馬組織中AMPA受體及NMDA受體相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)GluR1、NR2B、NR1、PSD95蛋白表達水平明顯增加，提示越鞠甘麥大棗湯可能是通過增強突觸可塑性來產(chǎn)生抗抑郁作用。

抑郁癥的發(fā)病機制復雜多樣，目前神經(jīng)可塑性假說得到更廣泛認同。該假說認為，抑郁癥主要是由相關腦區(qū)的神經(jīng)可塑性在應對應激時降低所引起的。調節(jié)神經(jīng)遞質、增加神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的水平，從而逆轉下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能障礙并發(fā)揮神經(jīng)保護作用是抗抑郁的基礎[20]。LTP是突觸傳遞以及神經(jīng)可塑性的重要表現(xiàn)形式。電生理數(shù)據(jù)顯示在急性應激動物的關鍵腦區(qū)，谷氨酸能突觸表現(xiàn)出LTP誘導損傷[21]。也有研究顯示，許多藥物成分是通過影響谷氨酸能突觸來體現(xiàn)其抗抑郁作用的[22]。本研究的電生理實驗也證實，在給予高頻刺激誘發(fā)LTP后，越鞠甘麥大棗湯組小鼠的平均fEPSP斜率明顯上升，表明越鞠甘麥大棗湯能夠增強小鼠海馬的突觸傳遞。另外，很多研究證明AMPA受體和NMDA受體對于興奮性和抑制性突觸傳遞是必不可少的，LTP的誘導與AMPA受體和NMDA受體的表達增加有關[23]。此外，海馬區(qū)NMDA受體依賴的突觸可塑性被認為是抗抑郁的關鍵機制[24]。我們研究發(fā)現(xiàn)，給予越鞠甘麥大棗湯后，小鼠AMPA受體亞基GluR1的表達增加，提示我們GluR1的增加是誘導LTP增強的必需條件。與此同時，給藥組小鼠較對照組小鼠的NMDA受體亞基NR2B和NR1表達均顯著增加，提示我們形成LTP的過程中NMDAR起到重要作用。但是我們發(fā)現(xiàn)NMDA受體亞基NR2A并沒有出現(xiàn)與其他亞基一致的變化，甚至給藥組的NR2A表達較對照組在24 h后出現(xiàn)顯著下降，7天后無統(tǒng)計學差異。Kiyama等[25]研究發(fā)現(xiàn)在NR2A基因敲除小鼠中，LTP的平均幅度與野生型小鼠相比有所下降，但是提高刺激的強度之后仍然可以誘導出與野生型小鼠水平相當?shù)娘柡蚅TP，從而提示我們NR2A亞基可能并非LTP誘導形成所必需的。另外PSD95是突觸后致密蛋白，為突觸后膜的受體活動和穩(wěn)定性所必需，是突觸可塑性的重要標志[26]。PSD95的蛋白水平在給藥24 h和7天后顯著增加，提示我們給予越鞠甘麥大棗湯后小鼠的突觸可塑性增強。另外我們發(fā)現(xiàn)單次給予越鞠甘麥大棗湯和氯胺酮后，越鞠甘麥大棗湯的抗抑郁樣作用比氯胺酮更加持久，我們推測越鞠甘麥大棗湯抗抑郁樣作用之所以能夠持續(xù)到7天，是其增強了神經(jīng)突觸的傳遞作用，激活了持久抗抑郁的相關分子機制，從而增加了神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，持續(xù)改善神經(jīng)元細胞的受損狀態(tài)，這些提示我們越鞠甘麥大棗湯作為中藥在抗抑郁方面的優(yōu)勢。

本研究通過行為學測試來分析越鞠甘麥大棗湯在昆明小鼠中的快速與持久的抗抑郁樣作用，并利用電生理學方法來研究越鞠甘麥大棗湯對小鼠海馬腦區(qū)長時程增強的影響，并在分子機制上驗證產(chǎn)生長時程增強作用和抗抑郁的基礎，探討越鞠甘麥大棗湯增強突觸效能的快速性和持久性上的神經(jīng)生物學機制。下一步應繼續(xù)研究越鞠甘麥大棗湯對于長時程增強的影響是通過NMDA還是AMPA電流的變化，同時進一步闡明影響治療效果的潛在機制和基因變異，為治療抑郁癥的有效個體化藥物提供新的線索。