調(diào)脈飲及其拆方對(duì)快速性心律失常大鼠模型心肌L型鈣通道β2亞基表達(dá)的影響

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快速性心律失常通常是因心搏頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常范疇，或是由于沖動(dòng)傳導(dǎo)途徑發(fā)生異常而導(dǎo)致病人產(chǎn)生的一種心律失常，可影響血液循環(huán)，對(duì)病人生命安全構(gòu)成極大威脅。隨著我國(guó)冠心病、高血壓、糖尿病等發(fā)病率的增高，人口老齡化程度不斷增加，心律失常發(fā)生率也隨之增高，嚴(yán)重危害到病人的生命安全[1-2]。

雖然近年來射頻消融術(shù)埋藏式心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器(ICD)、外科手術(shù)等治療心律失常的方法取得進(jìn)展，但由于其治療范圍有限，具有一定侵襲性，并且費(fèi)用昂貴，難以廣泛開展，因此抗心律失常藥物仍占主要地位[3]。當(dāng)前，抗心律失常藥物主要是通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜的離子通道抑制心律失常的發(fā)生[4]。臨床試驗(yàn)表明，多種抗心律失常藥物可引發(fā)致死性心律失常[5]。因此，亟需藥效好、副作用少的藥物以及新的治療策略來控制心律失常。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)量來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而改善心肌細(xì)胞整體功能[6]。中藥治療心律失常與基因調(diào)節(jié)有著非常緊密的關(guān)系，并有望成為心律失常研究的新熱點(diǎn)。

調(diào)脈飲是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)魏執(zhí)真教授潛心研究多年治療快速性心律失常的有效方劑，經(jīng)30年的臨床實(shí)踐證實(shí)，調(diào)脈飲對(duì)快速性心律失常療效顯著，與心律平(普羅帕酮)療效相當(dāng)[7]。調(diào)脈飲全方由丹皮、赤芍、黃連、太子參、麥冬、五味子香附、香櫞、川芎、丹參等中藥組成，以益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱為法。在調(diào)脈飲的拆方實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)[8]，調(diào)脈飲全方及涼血清熱藥組均具有抗烏頭堿致實(shí)驗(yàn)性快速心律失常作用，涼血清熱組較行氣通脈、益氣養(yǎng)心組對(duì)烏頭堿及哇巴因致心律失常的抑制作用明顯，且可降低心律失常的持續(xù)時(shí)間，為從“瘀熱”論治快速型心律失常提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。本研究觀察調(diào)脈飲及拆方對(duì)快速性心律失常大鼠模型心肌L型鈣通道β2亞基(LTCC β2)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討調(diào)脈飲的抗心律失常作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠60只，雌雄各半，SPF級(jí)，體質(zhì)量(280±20) g。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供[批號(hào)SCXK-(軍)2012-0004]。

1.2 受試藥物 中藥顆粒由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥劑科提供。實(shí)驗(yàn)給藥濃度及給藥量參照前期研究資料[8]，根據(jù)臨床等效劑量換算(生藥量g/kg)：全方組大鼠給藥劑量22 g/kg；涼血清熱組大鼠給藥劑量7 g/kg；行氣通脈組和益氣養(yǎng)心組大鼠給藥劑量7.5 g/kg。

1.3 主要試劑與藥品 烏頭堿：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)PRF7033041；戊巴比妥鈉：Sigma公司，批號(hào)1010N0310；可達(dá)龍(鹽酸胺碘酮片)：賽諾菲(杭州)制藥有限公司，批號(hào)2A13819；GoScript Reverse Transcription System、GoTaq?qPCR Master Mix(美國(guó)Promega公司，貨號(hào)：0000076581)；β-actin、LTCC β2mRNA引物設(shè)計(jì)使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，引物序列如下：β-actin 上游引物5′-AGGCCCCTCTGAACCCTAAG-3′，下游引物5′-TGCCACAGGATTCCATACCC-3′；LTCCβ2：上游引物：5′-AAGCAAGCACCTCAATGTCCAG-3′，下游引物：5′-TAGTCGGCGAGATGCTCACAG -3′；β-actin、LTCC β2抗體(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab93606)

1.4 儀器 多道自動(dòng)分析心電圖機(jī)(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司，F(xiàn)X-7202)；美國(guó)ABI 7500 Real-Time PCR儀；美國(guó)BINTA數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)；美國(guó)Image-Pro Plus Analysis Soft ware計(jì)算機(jī)圖像分析儀。

1.5 動(dòng)物分組 將大鼠按照雌雄隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：模型組、調(diào)脈飲全方組(全方組)、涼血清熱主要功效組(涼血組)、益氣養(yǎng)心輔藥功效組(益氣組)、行氣通脈輔藥功效組(行氣組)、胺碘酮組(西藥組)，每組10只。按上述受試藥物給藥劑量給予相應(yīng)藥物，胺碘酮組給予胺碘酮100 mg/kg；模型組給予等量生理鹽水，灌胃給藥7 d，末次給藥30 min 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 造模記錄心電圖 將小鼠用0.4% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后仰臥位固定于鼠臺(tái)上，連接心電圖導(dǎo)聯(lián)電極，常規(guī)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECG)。5 s內(nèi)快速由舌下靜脈按0.2 mL/100 g體重注入烏頭堿溶液，烏頭堿溶液的配制方法：精確稱取烏頭堿2 mg，先加入少量稀鹽酸，然后加蒸餾水至100 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，配成濃度為20 μg/mL。監(jiān)測(cè)心電圖，待出現(xiàn)心律失常后，連續(xù)記錄心電圖變化，并同時(shí)用秒表分別記錄室性早搏(VPB)、室性心動(dòng)過速(VT) 和室顫(VF) 出現(xiàn)的時(shí)間及死亡(CA) 時(shí)間。心律失常消失恢復(fù)竇性心律300 s以上或出現(xiàn)死亡后停止記錄。

1.7 鈣離子通道基因和蛋白表達(dá)

1.7.1 標(biāo)本采集 各組記錄完最后心電圖后，立即開胸，充分暴露出心臟，分離心臟與周圍組織，取出心臟，迅速根據(jù)心尖搏動(dòng)的位置剪取(200～300) mg左心室心肌，用冷0.9%氯化鈉溶液沖洗血液，放入用焦炭酸二乙酯(DEPC)水處理過的凍存管中，用液氮速凍，以-70 ℃低溫冰箱保存，待做逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot)。

1.7.2 RT-PCR檢測(cè) 取液氮凍存的大鼠心肌組織，采用Trizol法提取組織總RNA，利用GoScript Reverse Transcription System試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，退火25 ℃ 5 min，延伸42 ℃ 1 h，滅活70 ℃ 15 min，得到cDNA；20 μL反應(yīng)體系，2 μL cDNA稀釋液加入10 μL GoTaq反應(yīng)液、7.2 μL Nuclease-Free Water和0.8 μL引物混合物，置于Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40次循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s溶解。運(yùn)用2-△△CT相對(duì)定量法比較各組目標(biāo)mRNA表達(dá)差異。

1.7.3 Western Blot實(shí)驗(yàn) 取液氮凍存的大鼠心肌組織，取液氮凍存的小鼠肝組織，加入冰浴的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育30 min，收集溶解產(chǎn)物，12 000 r/min 4 ℃ 30 min離心；抽取上清，加入上樣緩沖液，100 ℃ 5 min 蛋白變性；上樣，以每孔20 μg量加入12.5% SDS-PAGE凝膠，100 V 2 h電泳，預(yù)處理PVDF膜及濾紙，半干法凝膠轉(zhuǎn)膜，100 A 2 h，膜在TBS溶液洗 15 min；Blocking one封閉30 min，一抗以solution1按1∶1 000比例稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST(Tris緩沖液加吐溫20)洗膜后二抗(1∶10 000)孵育，室溫1 h。洗膜后加ECL發(fā)光液，室溫反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)成像，蛋白條帶用Image J 7.0圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)脈飲及其拆方對(duì)烏頭堿導(dǎo)致大鼠心電圖的影響 與模型組相比，全方組、西藥組大鼠出現(xiàn)VPB時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，全方組、涼血組、西藥組出現(xiàn)VT時(shí)間延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，全方組、涼血組、西藥組出現(xiàn)VF時(shí)間延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，全方組、涼血組、西藥組出現(xiàn)CA時(shí)間延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 調(diào)脈飲及其拆方對(duì)快速心律失常大鼠心電圖的影響(±s) s

圖1 各組出現(xiàn)心律失常時(shí)間

2.2 調(diào)脈飲及其拆方對(duì)大鼠心肌LTCC β2mRNA的影響 與模型組相比，全方組、涼血組、西藥組心肌LTCC β2mRNA表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖2。

與模型組比較，*P<0.05圖2 各組對(duì)LTCC β2 mRNA的影響

表2 調(diào)脈飲及其拆方對(duì)大鼠心肌LTCC β2 mRNA的影響(±s)

2.3 調(diào)脈飲及拆方對(duì)大鼠心肌LTCC β2蛋白表達(dá)的影響 與模型組相比，全方組、涼血組、西藥組心肌LTCC β2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。詳見表3、圖3。

與模型組比較，*P<0.05圖3 各組對(duì)LTCC β2蛋白表達(dá)的影響

表3 調(diào)脈飲及拆方對(duì)大鼠心肌LTCC β2 蛋白表達(dá)的影響(±s)

3 討 論

調(diào)脈飲全方及涼血組可減少各種快速性心律失常的發(fā)生時(shí)間，降低心肌LTCC β2的mRNA的表達(dá)。L型鈣通道是心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的重要調(diào)節(jié)者[9]，主要由α、β、γ和δ亞基組成，其中調(diào)節(jié)亞基β有4種亞型，僅β2在心肌中表達(dá)，它能使L型鈣通道活性增強(qiáng)[10]。β2高表達(dá)會(huì)加速L 型鈣通道激活，增加鈣電流，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高， 發(fā)生了鈣超載， 導(dǎo)致L 型鈣通道加速失活，L型鈣通道電流降低，有效不應(yīng)期縮短，促進(jìn)快速性心律失常的發(fā)生[11]。

本研究結(jié)果顯示，調(diào)脈飲全方及涼血組可減少各種快速性心律失常的發(fā)生時(shí)間，同時(shí)降低心肌LTCC β2的表達(dá)。因此，可以推測(cè)，調(diào)脈飲對(duì)快速性心律失常的治療和預(yù)防作用與降低心肌LTCC β2的表達(dá)，降低L型鈣通道活性，減少鈣超載有關(guān)，其中，涼血組中藥具有關(guān)鍵性作用。