不同炮制方法對紫菀浸出物及主成分含量的影響△

范玲，王鑫，朱曉靜，劉杰，尹浩，駱建平，薛毅，金慶江，于棟偉*

(1.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 藥劑科，江蘇 蘇州 215101；2.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 腎病科，江蘇 蘇州 215101)

紫菀是菊科多年生草本植物紫菀AstertataricusL.f.的干燥根及根莖，是一種常用的中藥材，別名青苑、紫倩、返魂草等，生長于海拔400～2000 m的低山陰坡濕地、低山草地、沼澤地、山頂?shù)鹊?。紫菀資源豐富，我國主要分布在安徽、河北、內(nèi)蒙以及東北三省等地，在日本、朝鮮等其他國家也有著廣泛的分布。紫菀的嫩幼苗可以食用，嫩幼苗先經(jīng)開水焯后，再用冷水浸泡，便可煮粥或炒食等，口感清爽適口的同時也具有消痰止嗽的功效。紫菀化學(xué)成分眾多，有萜類及其苷、肽類、黃酮、蒽醌、香豆素、有機酸、酚類、甾醇、揮發(fā)油及苯丙素類等。藥理作用有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、通便利尿等。從紫菀的石油醚部位分離得到9個化合物，經(jīng)理化與波譜分析，分別鑒定為紫菀酮、木栓酮、表木栓醇等[1]，其中紫菀酮為紫菀的主要成分；黃酮類成分如橙皮苷、槲皮素和山萘酚也是其重要成分，槲皮素成分有祛痰、止咳、平喘的功效，橙皮苷、山柰酚也常用于支氣管炎的治療，越來越多的研究表明植物體內(nèi)的黃酮類物質(zhì)具有明顯的抗氧化、抗炎、抗病毒等特點。因此以浸出物和紫菀酮等成分的含量為指標評價不同炮制品的質(zhì)量，探索不同炮制品對紫菀中部分成分的影響，為科學(xué)評價中藥不同炮制方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1試劑 對照品紫菀酮(批號：17102706)、槲皮素(批號：16111701)、山萘酚(批號：17092102)、橙皮苷(批號：18011801)均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%；甲醇和乙腈為色譜醇，其余為分析純；實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2儀器 Agilent1260系列高效液相色譜儀(美國，DAD檢測器；Agilent Chemstation色譜工作站)；FA2004型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；B-260型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3藥材 紫菀樣品(批號：171216，蘇州市天靈中藥飲片有限公司)產(chǎn)地為河北，按照中國藥典操作規(guī)程采用了6種不用的炮制方法進行加工炮制，得生、蜜、醋、酒、炒、蒸6種紫菀炮制品。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同紫菀炮制品的制備

2.1.1 生紫菀 將原藥材洗凈并除去雜質(zhì)，稍潤，切片，干燥，篩去灰屑，即得。

2.1.2 蜜紫菀 在煉蜜中加入適量沸水稀釋后，加入洗凈的紫菀片中攪拌均勻，悶透，用文火炒至顯棕褐色、手觸摸不粘手時，取出，放涼，即得。

2.1.3 炒紫菀 取洗凈的紫菀片，用文火炒至表面焦褐色，取出，放涼，即得。

2.1.4 酒紫菀 將黃酒加入洗凈的紫菀片中拌勻，悶透，文火炒制褐色，60 ℃烘干，即得。

2.1.5 醋紫菀 將醋加入洗凈的紫菀片中拌勻，悶透，用文火炒干，取出，放涼，即得。

2.1.6 蒸紫菀 將紫菀片蒸1 h，取出，干燥，即得。

2.2不同紫菀炮制品水溶性浸出物的測定 參照2010版《中華人民共和國藥典》附錄Ⅸ下水溶性浸出物測定法項下的熱浸法對紫菀不同炮制品進行水溶性浸出物的含量測定，取不同紫菀炮制品每種約5 g，精密稱定，置于250 mL的具塞錐形瓶中，精密加入100 mL水，密塞后稱定重量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱后保持微沸1 h。放冷，取下具塞錐形瓶，密塞，再次稱定重量，用水補足失重，搖勻后過濾，精密量取濾液20 mL，置恒重的蒸發(fā)皿中，在恒溫水浴鍋中蒸干，再于105 ℃的恒溫干燥箱中干燥3小時，然后置于干燥器中冷卻30分鐘，取出后迅速精密稱定重量，并計算含量。

2.3不同紫菀炮制品薄層色譜鑒別 取不同紫菀炮制品粉末每種約1 g，加入甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，待濾液揮干后，加乙酸乙酯1 mL使殘余溶解，作為供試品；取紫菀酮對照品10 mg放入10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容為1 mL·mg-1的對照品。按照藥典記錄的薄層色譜法實驗，吸取上述兩種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，再展開缸中展開，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑噴在薄層板上，在105 ℃加熱，待斑點顯色清晰后置日光和紫外燈光(365 nm)下檢視。色譜圖見圖1。

注：1.紫菀酮對照品；2.生紫菀飲片；3.蜜紫菀飲片；4.蒸紫菀飲片；5.炒紫菀飲片；6.酒紫菀飲片；7.醋紫菀飲片。圖1 薄層色譜試驗

2.4 不同紫菀炮制品中紫菀酮的含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取紫菀酮對照品適量，減壓干燥至恒重，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含98 μg的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 取不同紫菀炮制品粉末每種約2.5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入甲醇定容，稱定重量，40 ℃溫浸1 h，超聲處理15分鐘，取出，放冷，再次稱定重量，用甲醇補足失重，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(96∶4)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：200 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取2.4.1項下紫菀對照品溶液1、5、10、15、20 μL進樣，按照2.4.3的色譜條件進行測定，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，所得的回歸方程為Y=2067.70X+19.53，r=0.999 8，線性范圍為0.098～1.96 μg。標準曲線見圖1。

2.4.5 精密度考察 取濃度為98 μg·mL-1的紫菀酮對照品溶液，進樣體積為20 μL，進行6次重復(fù)進樣，測定其峰面積，計算求得其的平均值為4147.15，RSD為0.71%，說明精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 取生紫菀樣品約2.5 g，精密稱定，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，分別在1、2、4、6、8、16 h進行HPLC測定，進樣體積為20 μL，計算求得峰面積的平均值為1438.55，RSD為2.21%，表明樣品在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性考察 取6份生紫菀樣品，每份2.5 g，精密稱定，按照2.4.2項下方法制成供試品溶液，進樣體積為20 μL，經(jīng)計算得含量的RSD為2.02%，說明重復(fù)性較好。

2.4.8 加樣回收率考察 取含量已知的生紫菀樣品約1 g，精密稱定，加入0.061 mg·mL-1的對照品溶液10 mL，按照2.4.2項下方法平行制備6份供試品溶液，測定，計算平均加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 紫菀中紫菀酮成分加樣回收試驗結(jié)果

2.4.9 樣品的含量測定 取2.4.2項下制備的供試品溶液，進樣體積為20 μL，計算不同紫菀炮制品中紫菀酮的含量。高效液相結(jié)果見圖2、圖3。

注：*紫菀酮。圖2 紫菀對照品

注：*紫菀酮。圖3 生紫菀供試品

2.5 不同紫菀炮制品中黃酮類成分(橙皮苷、槲皮素和山萘酚)的含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 分別取橙皮苷、槲皮素、山柰酚對照品適量，減壓干燥至恒重，精密稱定，加甲醇溶解制成各對照品溶液，取各對照品溶液適量，加入甲醇制成每1 mL含槲皮素4.16 μg、橙皮苷112 μg、山萘酚4.04 μg的混合對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 按照2.4.2項下制備供試品溶液。

2.5.3 色譜條件 色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(C)-0.4%磷酸水溶液(A)；梯度洗脫，洗脫程序見表；檢測波長為360 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.5.4 線性關(guān)系考察 取2.5.1項下黃酮類混合對照品溶液1、5、10、15、20 μL進樣，按照2.5.3的色譜條件進行測定，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，所得的回歸方程分別為橙皮苷Y=176.2X+0.607，r=0.999 0，線性范圍為0.112～2.24 μg；槲皮素Y=4976.11X+0.45，r=0.999 97，線性范圍為0.004 16～0.083 2 μg；山萘酚Y=5818.81X+1.98，r=0.999 9，線性范圍為0.004 04～0.080 8 μg。

2.5.5 精密度考察 取每1 mL含橙皮苷112 μg、槲皮素4.16 μg、山萘酚4.04 μg的混合對照品溶液，進樣體積為20 μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算求得峰面積的RSD分別為2.03%、1.72%、1.29%，說明精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性考察 取2.4.2項下制備紫菀供試品溶液，分別于配后的1、2、4、6、8、16 h測定橙皮苷、槲皮素、山柰酚的峰面積，進樣量20 μL，計算求得峰面積的RSD分別為2.17%、0.83%、0.27%，表明樣品在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性考察 取6份生紫菀樣品，每份2.5g，精密稱定，按照2.4.2項下方法制成供試品溶液，進行測定，進樣體積為20 μL，計算求得橙皮苷、槲皮素、山萘酚含量的RSD分別為2.21%、1.56%、1.98%，說明重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率考察 取含量已知的生紫菀樣品約1 g，精密稱定，加入14.4 μg·mL-1的橙皮苷對照品溶液10 mL，3.12 μg·mL-1的槲皮素對照品溶液10 mL，3.03 μg·mL-1的山萘酚對照品溶液10 mL，按照2.4.2項下方法平行制備6份供試品溶液，測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 紫菀中黃酮類成分加樣回收試驗結(jié)果

2.5.9 樣品的含量測定 取2.5.2項下供試品溶液，進樣體積為20 μL，計算各飲片中橙皮苷、槲皮素、山萘酚的含量(以干燥品計)。高效液相結(jié)果見圖4、圖5。

注：1.橙皮苷；2.槲皮素；3.山萘酚。圖4 黃酮類混合對照品

注：1.橙皮苷；2.槲皮素；3.山萘酚。圖5 生紫菀供試品

3 分析

3.1 不同紫菀炮制品水溶性浸出物的測定(n=3)

經(jīng)2.2項下實驗方法得到不同紫菀炮制品的水溶性浸出率分別為生紫菀69%、蜜紫菀63%、蒸紫菀69%、炒紫菀69%、酒紫菀66%和醋紫菀71%，平均值為67.83%，由實驗結(jié)果得醋紫菀水溶性浸出率最高為71%，蜜紫菀最低為63%。

3.2不同紫菀炮制品薄層色譜鑒別

經(jīng)過薄層色譜鑒別試驗，在供試品色譜中，與對照品對應(yīng)位置存在與對照品相同顏色斑點。

3.3 不同紫菀炮制品中紫菀酮的含量測定(n=3)

經(jīng)上述實驗方法測得生紫菀中紫菀酮含量為0.582 5 mg·g-1，蜜紫菀中紫菀酮含量為0.627 6 mg·g-1，蒸紫菀中紫菀酮含量為0.723 6 mg·g-1，炒紫菀中紫菀酮含量為0.874 4 mg·g-1，酒紫菀中紫菀酮含量為0.858 mg·g-1，醋紫菀中紫菀酮含量為0.822 4 mg·g-1。不同紫菀炮制品中紫菀酮含量大小依次為：炒紫菀>酒紫菀>醋紫菀>蒸紫菀>蜜紫菀>生紫菀，炒紫菀中紫菀酮含量最高，生紫菀中紫菀酮含量最低，表明紫菀經(jīng)過炮制后能增加其中紫菀酮的含量。修彥鳳等[2]研究發(fā)現(xiàn)不同紫菀炮制品中紫菀酮含量大小依次為：生紫菀>炒紫菀>蒸紫菀>醋紫菀>酒紫菀>蜜紫菀，由于兩者炮制的標準不完全相同，有偏差也是有可能的，還需要更多的廠家，更多的實驗去驗證。

3.4 不同紫菀炮制品中黃酮類成分(橙皮苷、槲皮素和山萘酚)的含量測定(n=3)

經(jīng)上述實驗方法測得生紫菀中橙皮苷含量為0.156 mg·g-1、槲皮素含量為0.029 4 mg·g-1、山萘酚含量為0.031 6 mg·g-1；蜜紫菀中橙皮苷含量為0.199 7 mg·g-1、槲皮素含量為0.035 9 mg·g-1、山萘酚含量為0.028 8 mg·g-1；蒸紫菀中橙皮苷含量為0.234 4 mg·g-1、槲皮素含量為0.038 mg·g-1、山萘酚含量為0.040 7 mg·g-1；炒紫菀中橙皮苷含量為0.222 4 mg·g-1、槲皮素含量為0.053 1 mg·g-1、山萘酚含量為0.059 mg·g-1；酒紫菀中橙皮苷含量為0.156 7 mg·g-1、槲皮素含量為0.043 6 mg·g-1、山萘酚含量為0.055 1 mg·g-1；醋紫菀中橙皮苷含量為0.176 5 mg·g-1、槲皮素含量為0.043 5 mg·g-1、山萘酚含量為0.050 1 mg·g-1。其中橙皮苷含量最高的為炒紫菀，最低為生紫菀；槲皮素含量最高的為炒紫菀，最低為生紫菀；山萘酚含量最高的為炒紫菀，最低的為蜜紫菀，說明炒紫菀中黃酮類成分較多，經(jīng)炮制后能夠增加黃酮類成分在紫菀中的含量。

4 討論

4.1 中藥的炮制

中藥炮制是指在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，根據(jù)中醫(yī)辨證施治需要，將藥材通過凈制切制炮炙處理，加工成一定規(guī)格飲片的技術(shù)，可以緩和、增強藥性或改變藥性，是一項我國獨有的傳統(tǒng)的制藥技術(shù)，是中醫(yī)臨床用藥最顯著的特色之一[3]。

中藥炮制的目的，在于除去雜質(zhì)及非藥用部分，使藥材清潔純凈，改變藥物性能以及降低或消除藥物毒副作用，確保用藥安全和更好地發(fā)揮療效[4]。中藥材經(jīng)過不同方法炮制后，可以改變其外觀、化學(xué)成分以及藥理作用，能充分發(fā)揮藥物的利用價值，增強藥物的臨床療效，說明了中藥炮制的重要性，它是安全用藥的保障，是提高藥效的必要手段。中藥材經(jīng)過不同炮制方法后，對中藥的藥理作用存在很多影響[5]，例如在止咳平喘方面，紫菀、麻黃等藥材經(jīng)過蜜制后，能夠增強其止咳潤肺的作用；活血化瘀類藥物常用酒制、醋制等方法炮制，酒制可以增強活血通絡(luò)的作用，醋制可以引藥入肝，增強藥物止痛化瘀、入血收斂的作用[6]；還具有抗腫瘤作用、瀉下作用、免疫作用等。中藥炮制雖然效果顯著，但同時在藥材來源、炮制工藝、質(zhì)量標準及已經(jīng)出版的全國和各地的炮制規(guī)范中，目前還或多或少存在這樣或那樣的問題，可以概括為“六個不規(guī)范、一個不統(tǒng)一”[3]，六個不規(guī)范分別為藥材來源不規(guī)范、藥物名稱不規(guī)范、輔料使用不規(guī)范、炮制工藝不規(guī)范、質(zhì)量評價不規(guī)范、包裝貯存不規(guī)范；一個不統(tǒng)一是炮制規(guī)范不統(tǒng)一。因此在進行中藥炮制及發(fā)展過程中應(yīng)該注意這些問題，才能使中藥炮制技術(shù)得到科學(xué)的傳承和發(fā)展。

4.2 紫菀酮

紫菀的成分眾多，包括萜類及其苷[7-8]、肽類[9-10]、黃酮[11]、蒽醌、香豆素、有機酸、酚類[12-14]、甾醇、揮發(fā)油[15]及苯丙素[16]類等等，其中紫菀酮為紫菀止咳祛痰的主要標示性成分。盧艷花等[17]通過小鼠呼吸道酚紅排泄試驗發(fā)現(xiàn)紫菀水煎劑表現(xiàn)出明顯的祛痰作用，并且在祛痰有效部位中分離得到了含量較大的紫菀酮；同時發(fā)現(xiàn)紫菀水煎劑對小鼠氨水致咳表現(xiàn)出抑制作用。紫菀酮除了止咳祛痰外還具有體外抗炎作用[18]，紫菀酮可通過下調(diào)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細胞ERK1/2蛋白磷酸化水平，減少IκBα蛋白磷酸化降解，通過部分抑制NF-κB信號通路的激活下調(diào)iNOS蛋白的表達，從而使下游炎性細胞因子釋放減少而發(fā)揮抗炎作用。從本實驗中發(fā)現(xiàn)，不同炮制品中紫菀酮的含量也存在差別，其中生紫菀中紫菀酮含量最低為0.582 8 mg·g-1，炒紫菀中紫菀酮含量最高0.874 4 mg·g-1，表明經(jīng)過炮制之后能夠增加紫菀酮含量，一定意義上增強紫菀止咳祛痰的功效。不同炮制品中蜜紫菀含量為1.569 mg·g-1，雖然不高，但是煉蜜可以增強紫菀止咳的作用，所以臨床上使用也較多，經(jīng)過本次實驗，臨床上或許可以增加炮制紫菀的使用，提高紫菀止咳祛痰作用。

4.3 黃酮類

紫菀的黃酮類成分有橙皮苷、槲皮素、山萘酚、蘆丁、木犀草素、芹菜素等[19]多種成分，本次實驗選取了橙皮苷、槲皮素、山萘酚三種化學(xué)成分進行了含量測定，這三類黃酮類成分都具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌等作用[20-22]。馬慧萍等[23]采用常壓密閉缺氧耐受力實驗和急性減壓缺氧耐受力實驗聯(lián)合評價了藏紫菀總黃酮的抗缺氧活性，通過實驗發(fā)現(xiàn)，無論是常壓密閉缺氧耐受力實驗或是急性減壓缺氧耐受力實驗，口服給予不同劑量藏紫菀總黃酮均能夠顯著延長小鼠的生存時間或降低小鼠的死亡率，說明了紫菀中黃酮類成分的抗缺氧作用。中藥紫菀的藥理作用眾多，也包括抗癌、抗菌、抗氧化等[24]，可見黃酮類成分在紫菀中發(fā)揮了巨大的作用。通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，在不同的紫菀炮制品中，炒紫菀中的橙皮苷、槲皮素、山萘酚含量都為最高；生紫菀中橙皮苷、槲皮素含量為最低；蜜紫菀中山萘酚含量為最低。因此對中藥紫菀的應(yīng)用不應(yīng)局限于2015版《中華人民共和國藥典》第一部記載的生紫菀和蜜紫菀，可以使用炒制、酒炙、醋炙等多種炮制方法，都能有較好的效果。

經(jīng)過本次試驗，我們發(fā)現(xiàn)無論是紫菀的主成分紫菀酮，還是黃酮類成分(橙皮苷、槲皮素、山萘酚等)，這些成分在生紫菀中含量普遍都較低，而在炒紫菀中卻含量普遍較高，且各類炮制紫菀中成分含量都高于生紫菀，表明中藥炮制技術(shù)確實有著良好的作用。因此我們應(yīng)良好的繼承發(fā)揚傳統(tǒng)炮制技術(shù)，并與現(xiàn)在科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，科學(xué)有效的傳承發(fā)展中藥炮制技術(shù)。