HPV-16 E7負(fù)載DC激活CIK細(xì)胞增強宮頸癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)的研究

陸暢暢 續(xù)力云 吳麗萍

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸鱗狀上皮病變的必要因素[1]。持續(xù)性高危型HPV感染（如 HPV-16、-18、-31、-33 和-58）是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的必要前提[2]。HPV早期區(qū)E6、E7基因編碼蛋白是非常理想的宮頸癌治療性靶蛋白，因為它們僅由病毒蛋白構(gòu)成，卻可在宿主細(xì)胞中表達；因此，一旦破壞體內(nèi)表達HPV E6、E7蛋白的細(xì)胞，就能阻止腫瘤的發(fā)生，同時破壞已經(jīng)癌變的腫瘤組織，而這樣的治療策略的實施依賴于細(xì)胞免疫的參與[3-4]。樹突狀細(xì)胞（DC）作為人體內(nèi)已知的抗原遞呈能力最強的抗原遞呈細(xì)胞，成為當(dāng)前抗病毒免疫和腫瘤免疫治療的研究熱點之一[5]。DC能攝取、加工抗原，表達高水平主要組織相容性復(fù)合體（MHC）等有助于抗原提呈的分子，有效地向T淋巴細(xì)胞提呈抗原，啟動患者自身特異性免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（CIK）細(xì)胞是新型的免疫活性細(xì)胞，是由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的殺傷細(xì)胞；其兼具T淋巴細(xì)胞強大的殺傷活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺傷特點[6-7]。然而，目前臨床無論是DC疫苗還是CIK細(xì)胞單獨應(yīng)用于抗腫瘤或抗病毒治療，效果均不是特別理想[8-9]。負(fù)載靶抗原的DC與CIK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用時，DC可增強CIK細(xì)胞的免疫應(yīng)答，CIK細(xì)胞的非MHC限制性可彌補DC MHC限制性的不足，兩者的互補作用產(chǎn)生雙重殺傷效應(yīng)[10-11]。因此，抗原致敏DC-CIK細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用，是宮頸癌細(xì)胞免疫治療的有益探索。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA法檢測HPV-16 E7負(fù)載DC對CIK細(xì)胞表型及細(xì)胞因子分泌水平的影響，乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞對宮頸癌細(xì)胞的殺傷活性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 細(xì)胞因子：IL-2、IL-4、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN-γ及IL-1α購自美國Pepro Tech公司。單克隆流式抗體：抗人PE-CD3、FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8、FITC-CD14、FITCCD56、APC-CD83、PerCP-Cy5.5-CD86和 PE-HLA-DR單抗，同型對照抗體 APC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG1及PerCP-Cy5.5-IgG1均購自美國BD公司。Alys-505培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、杜氏磷酸緩沖液（DPBS）、PBS購自美國Gbico公司。ELISA法檢測IL-12、IFN-γ、TNF-α的試劑盒均購自美國R&D公司。人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自中國天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。CytoTox 96R非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒（CytoTox 96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay）購自美國Promega公司。HPV-16 E7載體與陰性對照載體購自上海吉瑪公司。宮頸癌Hela細(xì)胞株購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫。FACS CaliburTM流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DC的分離培養(yǎng) 抽取26例健康志愿者外周血各 20ml，肝素抗凝，離心 900g，30min；吸取上層血漿，置于 56℃水浴鍋中 30min，隨后 4℃靜置 15min，離心800g，15min；取上層血漿4℃保存?zhèn)溆?。另取離心后細(xì)胞沉淀，加D-PBS混勻，緩慢加到裝有10ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，室溫離心吸取白膜層細(xì)胞，用含10%血漿的Alys-505培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以5×106/ml細(xì)胞密度接種于6孔板，于飽和濕度、37℃、5.0%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。保留貼壁細(xì)胞于6孔板中，于含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4及10%血漿的Alys-505培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，此即為分離的DC，第3天時半量換液并補充新鮮的細(xì)胞因子。

1.2.2 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng) 取DC的分離培養(yǎng)過程中未貼壁細(xì)胞，用含0.5%血漿的Alys-505培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，轉(zhuǎn)入6孔板，同時每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于飽和濕度、37℃、5.0%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，每孔分別加入50ng/ml CD3單抗，1000U/ml IL-2及1000U/ml IL-1α繼續(xù)培養(yǎng)。每3d調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，于含1000U/ml IL-2及0.5%血漿的Alys-505培養(yǎng)液中培養(yǎng)，第8天收獲CIK細(xì)胞。

1.2.3 DC-CIK細(xì)胞的共培養(yǎng) 將分離的DC與誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞以1∶10比例共同培養(yǎng)，每2d補充含0.5%血漿、1000U/ml IL-2、100ng/ml GM-CSF 的 Alys-505培養(yǎng)液，共培養(yǎng)5～7d后收獲DC-CIK細(xì)胞備用。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型

1.2.4.1 HPV-16 E7負(fù)載DC細(xì)胞表型檢測 應(yīng)用HPV-16 E7載體與陰性對照載體轉(zhuǎn)染DC，取轉(zhuǎn)染后第3天的 DC 2×106個，重懸于 200μl PBS，均分入 2管。對照管添加1μl熒光素標(biāo)記的同型對照抗體（APC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG1 及 PerCP-Cy5.5-IgG1），實驗管添加 1μl熒光素標(biāo)記的抗人抗體（APC-CD83、FITCCD14、PE-HLA-DR 及 PerCP-Cy5.5-CD86）。室溫避光孵育 30min，分別加 1ml PBS，離心 400g 5min，棄 PBS，重復(fù)3次，最后以500μl PBS重懸細(xì)胞，上機檢測HPV-16 E7負(fù)載DC細(xì)胞與陰性對照負(fù)載DC細(xì)胞表型。

1.2.4.2 HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞表型檢測 取最終培養(yǎng)的HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞各4×106個，重懸于 400μl PBS，均分入 a、b、c、d 管，a 管添加 1μl熒光素標(biāo)記的同型對照抗體（PE-IgG1、FITC-IgG2a），b管添加1μl熒光素標(biāo)記的同型對照抗體（FITC-IgG2a、APC-IgG1、PE-IgG1），c 管添加 1μl熒光素標(biāo)記的抗人抗體（PE-CD3、FITC-CD56），d管添加 1μl熒光素標(biāo)記的抗人抗體（FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8）。室溫避光孵育30min，以上各管各添加1ml PBS，離心400g 5min，棄PBS，重復(fù)3次，500μl PBS重懸沉淀，應(yīng)用 FACS CaliburTM流式細(xì)胞儀進行檢測，F(xiàn)lowJo軟件（美國）進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞的細(xì)胞因子表達水平檢測 采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平。具體步驟參照試劑說明書，繪制吸光值（OD值）與樣本濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品濃度。

1.2.6 HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷活性檢測 采用LDH釋放法。以含5%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮的Hela細(xì)胞作為靶細(xì)胞，加入96 孔板，每孔 1×104個細(xì)胞/50μl。以 HPV-DC-CIK、DC-CIK、CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按不同效靶比加入相應(yīng)數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞50μl。另設(shè)培養(yǎng)基對照孔，效、靶細(xì)胞自然釋放孔，靶細(xì)胞最大釋放孔，各組均設(shè)3個復(fù)孔。具體步驟參照試劑說明書，最后，根據(jù)孔內(nèi)于490nm處測吸光值（OD值）計算各組CIK細(xì)胞殺傷活性，殺傷活性（%）=（實驗組OD值-靶細(xì)胞自然釋放組OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組OD值）/（靶細(xì)胞最大釋放組OD值-靶細(xì)胞自然釋放組OD值）×100%。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較HPV-16 E7負(fù)載DC與陰性對照負(fù)載DC表型；（2）HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞表型；（3）比較HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平；（4）比較HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷活性。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV-16 E7負(fù)載DC與陰性對照負(fù)載DC表型比較見表1。

表1 HPV-16 E7負(fù)載DC與陰性對照負(fù)載DC表型比較（n=26，%）

由表1可見，與陰性對照負(fù)載DC比較，HPV-16 E7 負(fù)載 DC 中 CD83+、CD86+、HLA-DR+DC 細(xì)胞比例均上調(diào)（均P＜0.05），CD14+DC 細(xì)胞比例下調(diào)（P＜0.05）。2.2 HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DCCIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞表型比較見表2。

表2 HPV-16E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞表型比較（n=26，%）

由表2可見，HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞的細(xì)胞表型比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。與其他3組細(xì)胞比較，HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞中CD3+CD4+CIK 細(xì)胞比例下調(diào)（P＜0.05），CD3+CD8+、CD3+CD56+CIK細(xì)胞比例均上調(diào)（均P＜0.05）。

2.3 HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平比較見表3。

表3 HPV-16E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平比較（n=26）

由表3可見，HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞中L-12、IFN-γ、TNF-α水平比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。與其他3組細(xì)胞比較，HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞 IL-12、IFN-γ、TNF-α 水平均上調(diào)（均P＜0.05）。

2.4 HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷活性比較見圖1。

由圖1可見，HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷活性最強（均P＜0.05），DC-CIK細(xì)胞次之（P＜0.05）。

圖1 HPV-16 E7負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷活性比較（n=26；CIK細(xì)胞 vs DC-CIK細(xì)胞，*P＜0.05；陰性對照負(fù)載DC-CIK細(xì)胞vs HPV-16 E7負(fù)載-DC-CIK細(xì)胞，**P＜0.01）

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，占全世界婦女癌癥病死率第2位；HPV是宮頸癌的主要致病因子，幾乎所有的宮頸癌發(fā)病都與高危型HPV感染有關(guān)[1-2]。E6、E7蛋白是高危型HPV的主要致癌蛋白，只表達于HPV感染組織中，在正常組織中不表達，其中E7蛋白主要通過結(jié)合并降解成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白而使其喪失抑癌功能，因此E6、E7蛋白是宮頸癌治療的理想靶蛋白[4,12]。本研究應(yīng)用HPV-16 E7載體轉(zhuǎn)染人外周血來源DC，得到HPV16 E7負(fù)載DC，并發(fā)現(xiàn)HPV16 E7特異性負(fù)載可促使DC成熟，與陰性對照負(fù)載DC相比，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD83、CD86及HLA-DR表達上調(diào)，CD14表達下調(diào)。CD83、CD86及 HLA-DR分子均為T淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志分子[13-15]，免疫細(xì)胞功能的實施與細(xì)胞活化狀態(tài)密切相關(guān)，CD83、CD86及HLA-DR表達上調(diào)，利于腫瘤細(xì)胞的清除。

CIK細(xì)胞是在多種細(xì)胞因子即IL-2、IL-1、IFN-γ及抗CD3單克隆抗體等存在的條件下，應(yīng)用外周血、骨髓或臍血中分離出的單個核細(xì)胞，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)而獲得的非MHC限制性的高效溶腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞，在外周血淋巴細(xì)胞的比例僅為1%~5%；它兼具有T淋巴細(xì)胞強大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點，在腫瘤免疫治療中起到了不可替代的作用[16-17]。CIK細(xì)胞表面不表達Fc受體，不能產(chǎn)生抗體依賴性細(xì)胞毒反應(yīng)，DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)既可發(fā)揮CIK的非限制性細(xì)胞毒反應(yīng)，又可激發(fā)抗原負(fù)載的DC介導(dǎo)的MHC限制性細(xì)胞毒反應(yīng)，增強特異性殺傷作用。研究表明，經(jīng)DC刺激后的CIK細(xì)胞活性顯著增強[10-11]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過HPV-16 E7負(fù)載DC共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞比例均上調(diào)，細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α 的水平亦均上調(diào)，CIK 細(xì)胞表現(xiàn)出更強的宮頸癌Hela細(xì)胞殺傷活性。

綜上所述，HPV-16 E7負(fù)載DC不僅能激活CIK細(xì)胞，還可增強CIK細(xì)胞的宮頸癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)。HPV-16 E7負(fù)載DC與CIK細(xì)胞的協(xié)同作用對宮頸癌的細(xì)胞免疫治療具有重要意義。