低氧脅迫與常氧條件下斑馬魚(yú)鰓中熱休克蛋白基因家族的表達(dá)差異比較

，，、、、

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；4.遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201306)

水體中氧含量是魚(yú)類生存的關(guān)鍵因素之一，影響著魚(yú)體的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、繁殖等生命過(guò)程。水體中正常的氧濃度為6.5～7.0 mg/L，當(dāng)水體中的溶解氧濃度低于2.0 mg/L時(shí)為低氧/缺氧(Hypoxia)狀態(tài)[1-2]。氧分子是真核細(xì)胞線粒體有氧能源的終端電子受體。氧含量的減少會(huì)降低細(xì)胞的能量代謝，從而激發(fā)活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡[3]。過(guò)強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的低氧刺激會(huì)打破生物體與環(huán)境間的平衡，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，但輕度、較長(zhǎng)時(shí)間的低氧環(huán)境則可以增加生物體對(duì)低氧的耐受力[2-4]。

熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是生物受到環(huán)境中的物理、化學(xué)、生物等刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而大量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，又稱應(yīng)激蛋白，從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物等各種有機(jī)體均廣泛存在，是機(jī)體自我保護(hù)的物質(zhì)基礎(chǔ)[5-7]。當(dāng)生物體受到外界刺激時(shí)，細(xì)胞便會(huì)自動(dòng)關(guān)閉正常蛋白的合成進(jìn)而迅速誘導(dǎo)合成一系列HSP蛋白來(lái)快速地調(diào)整應(yīng)激發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞的存活性能，提升細(xì)胞的抗損傷能力，幫助細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境，恢復(fù)正常的生理活動(dòng)[8]。HSP家族中，根據(jù)蛋白分子量的大小通常劃分為4類：HSP90家族[9]、HSP70家族[10-11]、HSP60家族和HSP40小分子家族。每個(gè)HSP家族成員均具有各自功能，但在生命活動(dòng)過(guò)程往往又相互協(xié)調(diào)，共同發(fā)揮作用。

斑馬魚(yú)Daniorerio是一種小型鯉科熱帶魚(yú)[12]，自20世紀(jì)70年代美國(guó)俄勒岡大學(xué)的George Streisinger教授利用斑馬魚(yú)進(jìn)行遺傳學(xué)及發(fā)育生物學(xué)方面的研究以來(lái)，斑馬魚(yú)已越來(lái)越多地被應(yīng)用于科學(xué)研究，成為繼小鼠后又一重要的模式生物[12-13]。為研究熱休克蛋白應(yīng)對(duì)低氧脅迫的生物學(xué)功能，本研究中以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，對(duì)低氧脅迫與常氧條件下斑馬魚(yú)鰓組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較了低氧脅迫與常氧條件下斑馬魚(yú)鰓中熱休克蛋白家族基因的表達(dá)差異，以期為揭示斑馬魚(yú)的低氧適應(yīng)機(jī)制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)樣本為大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(以下簡(jiǎn)稱本實(shí)驗(yàn)室)培育多代的野生型斑馬魚(yú)(WT)，養(yǎng)殖溫度為28 ℃，飼養(yǎng)水體溶解氧濃度為6.7 mg/L。每日8:00、19:00喂食豐年蟲(chóng)。

試驗(yàn)用試劑：RNA提取試劑盒NucleoZOL由吉泰生物公司提供；RNA測(cè)序建庫(kù)試劑盒VAHTS Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina?由諾維贊生物公司提供；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于天根生物公司；熒光定量PCR試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master購(gòu)于Roche公司；組織蛋白裂解液與Anti-ACTIN抗體購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；Anti-HSP47抗體與Anti-HSP90ab1抗體分別購(gòu)于Proteintech蛋白公司和Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本低氧處理 將野生型斑馬魚(yú)(WT)置于低氧馴化箱(長(zhǎng)沙華曉電子科技有限公司)進(jìn)行不同低氧條件脅迫處理。低氧脅迫的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：低氧脅迫初期，斑馬魚(yú)的游泳速度減慢，且成群聚集在水面，出現(xiàn)輕微浮頭現(xiàn)象。隨著低氧脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)群浮頭現(xiàn)象逐漸消失。低氧脅迫兩周后，斑馬魚(yú)恢復(fù)正常運(yùn)動(dòng)和生理狀況。故選取低氧馴化兩周后的斑馬魚(yú)來(lái)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。低氧脅迫時(shí)，水體中的溶解氧濃度按照每?jī)尚r(shí)1.0 mg/L的速度降低，6 h后溶解氧濃度降低至2.0 mg/L(記為中度低氧)；歷經(jīng)8 h將常氧濃度(6.7 mg/L)降低至1.0 mg/L氧濃度(記為重度低氧)。保持2.0 mg/L(中度低氧)、1.0 mg/L(重度低氧)的水體養(yǎng)殖環(huán)境，馴化斑馬魚(yú)兩周。每種溶解氧濃度條件(6.7、2.0、1.0 mg/L)下，養(yǎng)殖的斑馬魚(yú)至少為30尾。取常氧、低氧馴化兩周后的斑馬魚(yú)各30尾，冰上麻醉，解剖獲得各組織。以15尾斑馬魚(yú)為一個(gè)單位進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，且每組樣本均設(shè)兩個(gè)重復(fù)，以常氧條件下的斑馬魚(yú)樣本作為對(duì)照。

1.2.2 鰓組織的轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)與測(cè)序 利用NucleoZOL試劑盒提取常氧(6.7 mg/L)、中度低氧(2.0 mg/L)、重度低氧(1.0 mg/L)條件下鰓組織的總RNA。具體步驟按照NucleoZOL試劑盒使用方法嚴(yán)格執(zhí)行。分別制備中度低氧、重度低氧下的斑馬魚(yú)鰓的RNA樣本各2個(gè)，每個(gè)RNA樣本的制備包括15尾斑馬魚(yú)，共制備4組低氧斑馬魚(yú)RNA樣本，分別為中度低氧(2.0 mg/L)的總RNA樣本(2.0 G1、2.0 G2)和重度低氧(1.0 mg/L)的總RNA樣本(1.0 G1、1.0 G2)，隨后將總RNA樣本放于冰箱(-20 ℃)中保存，用于后續(xù)建庫(kù)試驗(yàn)。4個(gè)總RNA樣本制備好后，按照VAHTS Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina?試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)，將4個(gè)轉(zhuǎn)錄組庫(kù)送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。而對(duì)照組常氧斑馬魚(yú)鰓的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)已由本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道[14]。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 對(duì)在常氧、低氧(1.0、2.0 mg/L)條件下馴化兩周的斑馬魚(yú)，提取鰓、心臟、皮膚、腎和肌肉組織的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行溶解曲線分析及計(jì)算其2-△△Ct值，并用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行One Way ANOVA 分析。比較低氧和常養(yǎng)條件下斑馬魚(yú)各組織中Hsp47、Hsp90ab1 基因的表達(dá)水平差異。以β-actin作為qRT-PCR的內(nèi)參基因，基因的引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

1.2.4 Western Blot法分析 分別提取常氧、中度低氧、重度低氧條件下的斑馬魚(yú)鰓組織蛋白，加入組織蛋白裂解液(強(qiáng)裂解液A∶液B=100∶1)，充分裂解后離心提取上清，加入含有巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水煮10 min變性。從每個(gè)樣本提取30 μg的蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 蛋白膠電泳。用孔徑為0.45 μm 的PVDF 膜(Millipore) 在250 mA 下轉(zhuǎn)膜1 h。封閉后分別用Anti-HSP47抗體(1∶1000)、Anti-HSP90ab1抗體(1∶1000)和Anti-ACTIN抗體(1∶2000) 孵育過(guò)夜。再用PBST 洗滌3 次(每次5 min)，二抗孵育(1∶2000)，室溫下靜置1 h。用PBST 洗滌3次，加入顯影液，使用化學(xué)發(fā)光成像儀成像，檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與基因差異表達(dá)分析

對(duì)從低氧斑馬魚(yú)鰓中提取的4個(gè)RNA(2.0 G1、2.0 G2、1.0 G1、1.0 G2)進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序，得出數(shù)據(jù)后與本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的常氧斑馬魚(yú)鰓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比[14](常氧斑馬魚(yú)鰓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index. html)。 對(duì)比后選取P<0.05、|lgFC|>2的基因作為差異基因進(jìn)行后續(xù)分析。

斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄組用于比較的基因共17 813個(gè)，在兩個(gè)低氧脅迫條件下發(fā)生顯著改變的基因數(shù)目各不相同。其中，共有1582個(gè)基因表達(dá)量在兩個(gè)低氧脅迫下均顯著上調(diào)，2134個(gè)基因表達(dá)量在兩個(gè)低氧脅迫下同時(shí)顯著下調(diào)。在兩種低氧濃度下表達(dá)量均發(fā)生顯著改變的基因中，篩選出全部HSP蛋白家族基因進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種低氧脅迫下，斑馬魚(yú)HSP蛋白家族基因中產(chǎn)生顯著變化的基因共28個(gè)，其中16個(gè)HSP蛋白家族基因表達(dá)量顯著上調(diào)，12個(gè)HSP蛋白家族基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。表達(dá)量增加最多的是Hsp47基因，除分子量較大的Hsp90ab1基因外，其他表達(dá)量上升的熱休克蛋白基因均為Hsp40的同源基因，均為小分子量HSP蛋白基因(圖1)。

2.2 低氧脅迫下Hsp47與Hsp90ab1基因的表達(dá)

低氧脅迫下，在表達(dá)顯著上升的HSP家族基因中挑選出表達(dá)量增加最大的Hsp47基因、分子量最大的Hsp90ab1基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。按照前述低氧處理方法進(jìn)行中度低氧(2.0 mg/L)、重度低氧(1.0 mg/L)馴化。提取常氧、中度低氧和重度低氧3個(gè)培養(yǎng)環(huán)境下的試驗(yàn)組斑馬魚(yú)鰓、心臟、皮膚、腎臟、肌肉組織的總RNA，電泳檢測(cè)后進(jìn)行后續(xù)qRT-PCR試驗(yàn)。

從圖2可見(jiàn)：與常氧相比，在重度低氧脅迫(1.0 mg/L)時(shí)，斑馬魚(yú)鰓、肌肉和心臟中的Hsp47基因表達(dá)極其顯著升高(P<0.001)；在中度低氧脅迫(2.0 mg/L)時(shí)，斑馬魚(yú)肌肉中Hsp47基因表達(dá)比常氧條件下極其顯著升高(P<0.001)，

注：熱圖中每個(gè)方格表示HSP蛋白家族基因在低氧脅迫下的表達(dá)量豐度，豐度隨顏色由綠到黑到紅依次增加。綠色代表低氧脅迫下表達(dá)量下調(diào)的基因，紅色代表低氧脅迫下表達(dá)量上調(diào)的基因Note：Heat map indicates HSP family genes expression abundance during increase from green color,then black to red color hypoxia stresses in a pane.Green indicates the down-regulated genes while red indicates up-regulated genes during the hypoxia stress圖1 低氧脅迫下HSP蛋白家族基因差異表達(dá)熱圖Fig.1 Heat map of the differential expression of HSP genes during hypoxia stress

在鰓中的表達(dá)也比常氧下的表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。與常氧條件下相比，兩種低氧脅迫下，Hsp47基因在皮膚和腎臟中的表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)。

低氧脅迫下，在各組織中的大分子量蛋白基因Hsp90ab1表達(dá)量與Hsp47基因有明顯差異。從圖3可見(jiàn)：與常氧時(shí)相比，在重度低氧脅迫(1.0 mg/L)時(shí)，除心臟之外，斑馬魚(yú)鰓、肌肉、皮膚和腎臟中的Hsp90ab1基因表達(dá)極其顯著升高(P<0.001)；在中度低氧脅迫(2.0 mg/L)時(shí)，僅有鰓與肌肉中的Hsp90ab1基因表達(dá)量比常氧時(shí)極其顯著升高(P<0.001)，而心臟與腎臟中的Hsp90ab1基因表達(dá)量表現(xiàn)出顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)。

綜上所述，低氧脅迫下的斑馬魚(yú)，其Hsp47和Hsp90ab1基因在各組織中均有表達(dá)，且斑馬魚(yú)鰓和肌肉組織中兩種熱休克蛋白基因的表達(dá)量均為顯著增加。可以推測(cè)，斑馬魚(yú)鰓和肌肉中的熱休克蛋白在低氧應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。

注：*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05);**表示與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01);***表示與對(duì)照組差異極其顯著(P<0.001)，下同Note:*means significant difference compared with the control(P<0.05); **means very significant difference compared with the control(P<0.01); ***means very significant difference compared with the control(P<0.001)，et sequentia圖2 常氧與低氧脅迫下Hsp47基因在各組織中的表達(dá)量比較Fig.2 Relative expression of Hsp47 gene in different tissues in the zebrafish exposed to normoxia and hypoxia

圖3 常氧、低氧脅迫下Hsp90ab1基因在各組織中的表達(dá)量比較Fig.3 Relative expression of Hsp90ab1 gene in different tissues in zebrafish exposed to normoxia and hypoxia

本試驗(yàn)中用Western Blot方法，檢測(cè)了常氧與低氧脅迫下斑馬魚(yú)鰓中HSP47和HSP90ab1蛋白的表達(dá)。如圖4所示，在中度低氧(2.0 mg/L)與重度低氧(1.0 mg/L)脅迫下，斑馬魚(yú)鰓中的HSP47和HSP90ab1蛋白表達(dá)量均顯著高于常氧條件下的蛋白表達(dá)量(P<0.05)。

圖4 常氧與低氧脅迫下鰓中HSP47和HSP90ab1蛋白的表達(dá)Fig.4 Protein expressions of HSP47 and HSP90ab1 in the gills of zebrafish exposed to normoxia and hypoxia

3 討論

3.1 低氧環(huán)境下熱休克蛋白的調(diào)控作用

氧濃度變化對(duì)生物體生存影響較大，在應(yīng)對(duì)生存環(huán)境的氧氣條件改變時(shí)，生物體會(huì)產(chǎn)生熱激蛋白來(lái)應(yīng)對(duì)這一變化，包括Hsp70、Hsp90和Hsp27等基因[15]。研究表明，當(dāng)小鼠急速運(yùn)動(dòng)后處于低氧狀態(tài)時(shí)，檢測(cè)小鼠腓腸肌中Hsp70的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)低氧與常氧相比，其表達(dá)量明顯上升；進(jìn)一步將急性低氧處理后的小鼠放在低氧環(huán)境和常氧環(huán)境中觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠腓腸肌中Hsp70在低氧環(huán)境下表達(dá)量更高[16]。HIFs低氧誘導(dǎo)因子，在低氧狀態(tài)下會(huì)大量表達(dá)，而HSPs熱激蛋白基因中大多數(shù)是HIFs基因的靶基因。低氧狀態(tài)下HIF-1可以誘導(dǎo)Hsp70的轉(zhuǎn)錄[17-18]；HSP70蛋白也可通過(guò)VHL途徑調(diào)控HIF-1α使其降解[19-20]。還有研究發(fā)現(xiàn)，果蠅在經(jīng)過(guò)低氧處理后，血紅細(xì)胞中HSP70蛋白過(guò)表達(dá)的果蠅更耐低氧[21]。HSP90也是一種重要的應(yīng)對(duì)氧氣改變的應(yīng)激蛋白。研究顯示，急性低氧處理大鼠后，大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的Hsp90 mRNA表達(dá)量明顯增加[22]，而對(duì)大鼠先進(jìn)行慢性間歇性低壓低氧處理，再進(jìn)行急性低氧處理，可檢測(cè)到大鼠心肌細(xì)胞中的Hsp27、Hsp70 mRNA的表達(dá)量顯著升高[23]。可見(jiàn)，大鼠的心肌細(xì)胞通過(guò)增加Hsp27、Hsp70、Hsp90 mRNA的表達(dá)來(lái)保護(hù)心肌細(xì)胞免受低氧損傷[24]。面對(duì)水體中溶解氧含量的降低，魚(yú)類也會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身的生理活動(dòng)來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境的改變，其中應(yīng)激蛋白起到不可忽視的作用[25]。

3.2 低氧環(huán)境下斑馬魚(yú)熱休克蛋白基因的表達(dá)差異

本研究中選取模式生物斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象，將其分別放于重度低氧(1.0 mg/L)和中度低氧(2.0 mg/L)的環(huán)境中馴化兩周，運(yùn)用高通量測(cè)序測(cè)定斑馬魚(yú)在兩個(gè)低氧濃度下鰓組織中熱應(yīng)激蛋白基因的變化情況，檢測(cè)到在整個(gè)斑馬魚(yú)體內(nèi)由低氧引起顯著改變的熱激蛋白基因有28個(gè)。在表達(dá)量上升的16個(gè)基因中，除Hsp90ab1基因的分子量較大外，其他基因均為Hsp40同源基因，均為小分子HSPs蛋白家族基因(圖1)。而在表達(dá)量下降的熱休克蛋白基因中，除Hsp90aa1.2和Hsp70.3兩個(gè)基因?qū)儆诖蠓肿訜嵝菘说鞍谆蛲?，大多?shù)是小分子的HSPs蛋白家族基因(圖1)?？梢酝茰y(cè)，斑馬魚(yú)在面對(duì)低氧應(yīng)激時(shí)，小分子HSPs顯得更為重要。其他類似研究也表明，小分子HSPs在應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)，由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的分子伴侶功能，所起到的作用更大[26-27]。

熱休克蛋白HSP47是熱休克蛋白家族中唯一具有膠原特異性的小分子蛋白，首次在小鼠的內(nèi)胚層細(xì)胞中分離出來(lái)[28]。大多數(shù)研究表明，HSP47主要分布在生物體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與膠原前體的加工、折疊、合成和分泌等過(guò)程，它同時(shí)參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等生理活動(dòng)[29]。當(dāng)生物體遭遇外界刺激時(shí)，HSP47通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白運(yùn)輸、聚集和解離等活動(dòng)來(lái)起到保護(hù)細(xì)胞的作用[28]。HSP90ab1屬于大分子的熱休克蛋白，不僅參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖和分化等調(diào)控過(guò)程，也參與細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)等調(diào)控[30]。同時(shí)也有研究表明，Hsp47與Hsp90ab1基因是低氧應(yīng)答基因HIF的靶基因，參與HIF低氧作用下的調(diào)控機(jī)制，在生物體面對(duì)低氧刺激時(shí)起到必不可少的作用[19]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫下，Hsp47和Hsp90ab1基因在鰓和肌肉中的mRNA 表達(dá)量顯著高于其他組織(皮膚、心臟和腎臟)中的表達(dá)量(圖2、圖3)，這表明鰓和肌肉中的熱休克蛋白在低氧應(yīng)激中起著重要作用。鰓是大多數(shù)水生生物直接與水環(huán)境接觸，進(jìn)行氧氣交換的器官，在應(yīng)對(duì)環(huán)境中氧氣改變時(shí)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的改變。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)對(duì)重度低氧(1.0 mg/L)脅迫時(shí)，Hsp47、Hsp90ab1基因在大多數(shù)組織中的表達(dá)量明顯高于中度低氧(2.0 mg/L)脅迫與常氧組(圖2，圖3)。可以推測(cè)，氧濃度越低，組織應(yīng)對(duì)低氧濃度的反應(yīng)越強(qiáng)烈。有研究檢測(cè)到，在子癇患者體內(nèi)隨病情的加重其體內(nèi)的低氧應(yīng)答基因HIF和熱激蛋白基因Hsp70的表達(dá)量均呈正相關(guān)?？梢?jiàn)，低氧脅迫下，氧濃度越小，其熱激蛋白的表達(dá)量也會(huì)隨之增加[31]。

由此可知，當(dāng)生物體的生存環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，熱激蛋白是機(jī)體應(yīng)對(duì)環(huán)境變化時(shí)所產(chǎn)生的最重要蛋白之一。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、生物信息學(xué)、Western blot等手段，挖掘出HSP47和HSP90ab1蛋白可能是斑馬魚(yú)低氧應(yīng)激中最重要的熱休克蛋白成員，具有重要的適應(yīng)功能。這些研究結(jié)果也為后續(xù)進(jìn)一步描繪斑馬魚(yú)低氧應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。