扇貝裙邊ACE抑制肽的分離鑒定及其降血壓活性研究

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(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

中國幅員遼闊，海水資源豐富，海水可養(yǎng)殖面積為2600.11 km2[1]。中國海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%，占世界貝類總產(chǎn)量的60%[2]， 2015年，中國扇貝產(chǎn)量達(dá)到 179萬t，約占貝類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的13%[3]。隨著凍貝柱、干貝柱的加工和出口量越來越大，扇貝裙邊數(shù)量也日益增多[4]，約占扇貝總質(zhì)量的27.8%。扇貝裙邊的營養(yǎng)組成與扇貝柱相似[5]，是理想的高蛋白、低脂肪、低糖類原料，故可作為開發(fā)活性肽的重要資源。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin convert enzyme，ACE)是一種含Zn2+輔基的二肽羧肽酶[6]，在生物體的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin System，RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system，KKS)中可催化無活性的血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)轉(zhuǎn)化成具有收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，促使血壓升高，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(Angiotensin convert enzymepeptides，ACE抑制肽)是一類具有ACE抑制活性的多肽物質(zhì)，大多由2～12個(gè)氨基酸組成，極個(gè)別由更多個(gè)氨基酸組成[7]，其可通過抑制ACE酶的活性，達(dá)到預(yù)防和治療高血壓等相關(guān)疾病的目的[7-8]。

目前，常見的具有ACE抑制作用的降血壓藥物有卡托普利、依那普利、阿拉普利和賴諾普利等，雖然此類藥物的藥效明顯，但由于其是化學(xué)合成藥物，均存在一定的副作用，如過敏反應(yīng)、皮膚皮疹、咳嗽、味覺紊亂等[9-10]。所以，近年來人們開始從各種食物中不斷探求具有ACE抑制活性的天然成分，用天然具有ACE抑制活性的肽作為合成藥物的替代品[11]。然而，一些食源性ACE抑制肽在消化道內(nèi)可能會(huì)被消化酶分解，降低其ACE抑制活性和降血壓效果[12]，因此，需要通過體內(nèi)活性檢測(cè)(即動(dòng)物試驗(yàn))來進(jìn)一步評(píng)價(jià)ACE抑制肽的降血壓效果。

本研究中，從蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis裙邊酶解液中分離純化ACE抑制肽，并通過動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證ACE抑制肽的降血壓效果，旨在為來源于扇貝裙邊的ACE抑制肽的開發(fā)和利用提供依據(jù)，實(shí)現(xiàn)扇貝裙邊的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)原料與試劑 試驗(yàn)用扇貝裙邊來自大連某食品加工廠下腳料，于-18 ℃下冷凍貯存。

試驗(yàn)用主要試劑有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)、硼酸、硼砂、甲醇均購自Sigma公司；木瓜蛋白酶購自上海蓮冠生物化工有限公司；氫氧化鈉、冰醋酸均購自天津大茂化學(xué)試劑廠；三氟乙酸、乙腈(色譜級(jí))均購自天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備 勻漿機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)、Scientz-10N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、721型紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、高效液相色譜儀Aglient 1260 (安捷倫公司)、90-2低速臺(tái)式離心機(jī)[上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司]、精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、Orbitrap Q Exactive質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 扇貝裙邊酶解物的制備 將扇貝裙邊流水解凍后，在料液比為 1∶3(g∶mL)、木瓜蛋白酶為2%、pH為7.0、酶解溫度為60 ℃的條件下酶解1 h，于95 ℃沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至7.0，以9000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液冷凍干燥后即為扇貝裙邊酶解物。

1.2.2 ACE抑制活性的色譜條件與測(cè)定 采用大連依利特Hypersil BDS C18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為30 μL。

RP-HPLC系統(tǒng)流動(dòng)相的配制： 300 mL甲醇中加入0.5 mL冰醋酸和1 mL三氟乙酸(TFA)，用蒸餾水稀釋定容至1000 mL后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至3.3。

底物(HHL)的配制：用含有608 mmol/L NaCl的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.3)，將底物Hip-His-Leu配制成7.6 mmol/L的溶液。

在0.5 mL的Eppendof管中分別加入5 μL扇貝裙邊酶解物(5 mg/mL)和15 μL ACE(60 mU/mL)，置于37 ℃下保溫5 min后，再加入25 μL HHL(7.6 mmol/L)在37 ℃下反應(yīng)25 min，加入5 μL 0.1% TFA溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫，經(jīng)孔徑為0.22 mm的醋酸纖維膜過濾后，采用RP-HPLC定量ACE與底物反應(yīng)生成馬尿酸的量，來判斷ACE抑制活性。ACE抑制率計(jì)算公式為

ACE抑制率=(對(duì)照馬尿酸峰面積-樣品馬尿酸峰面積) / 對(duì)照馬尿酸峰面積×100%。

1.2.3 Sephadex LH-20凝膠層析 扇貝裙邊酶解產(chǎn)物采用Sephadex LH-20層析柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相為30%的甲醇溶液，流速為0.6 mL/min，樣品濃度為0.5 g/mL，上樣體積為10 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，自動(dòng)收集器以10 min/管的速度收集樣品。

1.2.4 RP-HPLC分離純化 將ACE抑制活性高的組分凍干收集，經(jīng)反相高效液相色譜分離純化。第一次RP-HPLC分離樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL，上樣量為20L，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為含有0.1% TFA的20%乙腈，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，多次收集分離組分，凍干后進(jìn)行ACE抑制活性檢測(cè)。第二次RP-HPLC分離條件中，除流動(dòng)相為含有0.1% TFA的10%乙腈外，其余條件與第一次均相同。

1.2.5 ESI MS/MS鑒定 ESI MS/MS條件：采用電噴霧正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍(質(zhì)荷比 m/z)為 100～1500，分辨率為 70 000；選擇其中強(qiáng)度較高的5個(gè)母離子峰采用高能碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)的方式碎裂母離子，同時(shí)在靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)內(nèi)進(jìn)行二級(jí)MS/MS 碎片離子掃描分析，其分辨率為 17 500。其中，一級(jí)譜的自動(dòng)增益控制(AGC)為 3e6，最大離子注射時(shí)間設(shè)置為 100 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為10 s；二級(jí)譜的自動(dòng)增益控制(AGC)為 5e5，最大離子注射時(shí)間設(shè)置為 120 ms。系統(tǒng)的操作和數(shù)據(jù)的采集都使用Xcalibur 2.1軟件(Thermo 公司)完成。

1.2.6 動(dòng)物試驗(yàn)樣品的制備與分組 將扇貝裙邊酶解液通過截留相對(duì)分子量3000的超濾膜，獲得相對(duì)分子量范圍為3000以下(含上述ACE抑制肽)的酶解液組分，冷凍干燥后，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。

試驗(yàn)用雄性原發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)，體質(zhì)量為240～280 g，12周齡，心臟收縮血壓(Systolic blood pressure,SBP)均高于180 mmHg。SHR適應(yīng)環(huán)境3 d后，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組(卡托普利)和酶解物組(表1)，采用灌胃法進(jìn)行試驗(yàn)。

動(dòng)物飼養(yǎng)條件：SHR飼養(yǎng)房間要保持SPF級(jí)，12/12 h明暗室，溫度為(23±2)℃，自由攝食且飲水，每5 d更換一次墊料，每天早8:00—9:00和晚20:00—21:00，各灌胃一次，灌胃28 d后，持續(xù)觀察7 d SHR的心臟收縮壓變化。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組Tab.1 Grouping of the test animals

1.2.7 心臟收縮血壓(SBP)的測(cè)定 采用尾套法測(cè)定SHR的心臟收縮壓。每天上午灌胃結(jié)束后，開始檢測(cè)SHR的尾部動(dòng)脈心臟收縮壓。檢測(cè)血壓前，先將固定籠子預(yù)熱到37 ℃，再將SHR固定在尾部測(cè)壓儀上，分別在第0、1、3、5、9、14、23、26、28、30、32、35天時(shí)測(cè)定SHR的心臟收縮壓，對(duì)每只SHR測(cè)定3次，取其平均值，整個(gè)飼養(yǎng)過程中記錄其體質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex LH-20層析柱對(duì)酶解產(chǎn)物的分離

如圖1所示，扇貝裙邊酶解產(chǎn)物通過Sephadex LH-20層析柱分離，得到7個(gè)組分峰(F1～F7)，對(duì)Sephadex LH-20分離的組分每隔一管測(cè)ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)組分峰F5、F6、F7具有ACE抑制活性，ACE抑制活性在70%以上。

對(duì)其半抑制濃度(IC50)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示，F(xiàn)5、F6、F7的IC50值分別為1.4、2.3、1.7 mg/mL。因此，對(duì)F5、F6、F7進(jìn)行進(jìn)一步分離。

圖1 扇貝裙邊酶解物經(jīng)Sephadex LH-20層析柱分離及ACE活性測(cè)定的結(jié)果Fig.1 Separation of scallop soft part excluding adductor hydrolyzate by Sephadex LH-20 and ACE activity determination

表2SephadexLH-20分離組分的IC50值

Tab.2IC50valuesofcomponentsseparatedbySephadexLH-20

峰號(hào)peak相關(guān)指數(shù)R2半抑制濃度IC50/(mg·mL-1)F50.991.4F60.992.3F70.991.7

2.2 RP-HPLC對(duì)活性組分的純化

將Sephadex LH-20層析柱分離得到的具有ACE抑制活性的F5、F6、F7組分，通過RP-HPLC C18分離，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)5-3、F7-4有ACE抑制活性。

圖2 具有ACE抑制活性組分的RP-HPLC圖譜Fig.2 RP-HPLC analysis of ACE inhibitory components

對(duì)圖2所得F5-3、F7-4組分通過RP-HPLC(10%乙腈)進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖3所示。其中F5-3、F7-4中僅有F5-3-3、F7-4-3經(jīng)檢測(cè)有ACE 抑制活性，根據(jù)出峰時(shí)間相同推測(cè)，F(xiàn)5-3-3和F7-4-3有可能含有同種序列的ACE 抑制肽，因此,僅對(duì)F5-3-3組分進(jìn)行質(zhì)譜分析。

圖3 F5-3和F7-4 組分RP-HPLC圖譜Fig.3 RP-HPLC analysis of F5-3 and F7-4 portions

2.3 ACE抑制肽的ESI MS/MS鑒定

F5-3-3經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜圖(圖4)和二級(jí)質(zhì)譜(圖5)鑒定獲得多肽序列，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果和肽段序列可信度及構(gòu)效關(guān)系篩選出一個(gè)二肽，相對(duì)分子質(zhì)量為304.17，氨基酸序列為Val-Trp(VW)。經(jīng)合成后測(cè)定其ACE活性，相關(guān)指數(shù)R2為0.99,IC50為86.9 μmol/L。

圖4 F5-3-3組分的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of F5-3-3 portion

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

2.4.1 SHR體質(zhì)量的變化 如圖6所示，空白組、陽性對(duì)照組、扇貝裙邊酶解物組3組SHR的體質(zhì)量隨時(shí)間的變化均有所增加，其中，扇貝裙邊酶解物組體質(zhì)量增加最多，在第28天停止灌胃后取試驗(yàn)鼠血液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，可能導(dǎo)致3組SHR的體質(zhì)量一定程度地下降，而后體質(zhì)量又繼續(xù)增加。

試驗(yàn)過程中，SHR正處于生長(zhǎng)期，其體質(zhì)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。然而，不同給藥組SHR的體質(zhì)量變化存在著較大的差別。如表3所示，空白對(duì)照組在第28天時(shí)體質(zhì)量增加了(17±9)g，陽性對(duì)照組增加了(9±5)g，酶解物組增加了(22±12)g，但各組間均無顯著性差異(P>0.05)。通過對(duì)SHR體質(zhì)量的監(jiān)測(cè)，說明灌胃的扇貝裙邊酶解物不會(huì)損害SHR的正常生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖5 F5-3-3組分的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 Tandem mass spectrum of F5-3-3 portion

注：*表示與空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)Note: *means significant difference compared with the blank control (P<0.05)圖6 雄性原發(fā)性高血壓大鼠的體質(zhì)量隨時(shí)間的變化Fig.6 Changes in SHR body weight with time after treatment

表328d中雄性原發(fā)性高血壓大鼠的體質(zhì)量變化

Tab.3ChangesinbodyweightSHRofmalewithin28days

組別groupSHR體質(zhì)量body weight of SHR/g0 d 28 d 差值 difference空白對(duì)照blank control 268±11280±1817±9陽性對(duì)照positive control 271±8273±129±5酶解物組enzymatic hydrolysate 269±6291±1222±12

2.4.2 SHR心臟收縮壓的變化 從圖7可見：空白對(duì)照組SHR的心臟收縮壓在整個(gè)檢測(cè)中無明顯變化，始終保持在(191±3) mmHg；陽性對(duì)照組的心臟收縮壓在28 d中隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，在灌胃5 d時(shí)降低到(164±5)mmHg，之后保持恒定并同空白對(duì)照組相比一直表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01)，在第28天時(shí)其心臟收縮壓降到了(140±3)mmHg；酶解物組的SBP在28 d中隨時(shí)間的延長(zhǎng)也逐漸降低，在灌胃9 d時(shí)達(dá)到(172±7)mmHg，之后基本保持恒定并同空白對(duì)照組相比一直表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01)，在第28天時(shí)其心臟收縮壓降到(161±3) mmHg，與陽性對(duì)照組保持著基本相同趨勢(shì)，但心臟收縮壓卻一直高于陽性對(duì)照組。

停止灌胃后，繼續(xù)跟蹤觀察SHR的心臟收縮壓變化情況。陽性對(duì)照組和酶解物組的心臟收縮壓在停止灌胃后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而開始上升，但在持續(xù)觀察的7 d內(nèi)，同空白對(duì)照組的心臟收縮壓相比仍都表現(xiàn)出了極顯著性差異(P<0.01)，此結(jié)果與Wang 等[13]研究結(jié)果相似，Wang等將牡蠣蛋白酶解物進(jìn)行長(zhǎng)效動(dòng)物試驗(yàn)，第28天時(shí)心臟收縮壓降低到(158±4)mmHg，而在停藥后第7天時(shí)心臟收縮壓上升到(171±8) mmHg。

注：**表示與空白對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)Note: **means very significant difference compared with the control(P<0.01)圖7 雄性原發(fā)性高血壓大鼠的SBP隨時(shí)間的變化Fig.7 Changes in SBP of male SHP with time

3 討論

目前，以水產(chǎn)品為原料的ACE抑制肽研究較多，已發(fā)現(xiàn)以大海馬Hippocampusramulosus[14]、刺參體壁Apostichopusjaponicus[15]、沙丁魚Sardinamelamosticta[16]、青柳蛤Mactrachinenesis[17]等為原料，通過酶解手段獲得具有ACE抑制活性的降血壓肽，如海馬蛋白來源的組分PH-I3,其IC50為0.896 mg/mL，該組分具有良好的pH穩(wěn)定性；刺參酶解產(chǎn)物小于相對(duì)分子量為3000的組分具有較高的ACE抑制活性，IC50為0.8 mg/mL，對(duì)ACE表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。此外，很多學(xué)者對(duì)以貝類為原料的ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定也展開研究。Wang等[13]從牡蠣酶解液中分離純化出VVYPWTORF九肽，其IC50為66mol/L；吳秉宇等[18]也以扇貝裙邊為原料通過酶解制備ACE抑制肽，發(fā)現(xiàn)一個(gè)LVIVP五肽具有較強(qiáng)的ACE抑制活性。本研究中從扇貝裙邊中鑒定出VW二肽，IC50為86.9 μmol/L，由于其肽鏈短，在化學(xué)合成制藥過程中具有一定優(yōu)勢(shì)。

鑒于ACE抑制肽可能在消化道中被消化酶酶解，其降血壓效果需要通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。目前，以水產(chǎn)品為原料的ACE抑制肽表現(xiàn)為短效的降壓活性，如用刺參ACE抑制肽灌胃SHR 4 h后，心臟收縮壓下降26 mmHg，此后血壓逐漸回升，24 h后與空白組大鼠無顯著性差異[15]；而長(zhǎng)效動(dòng)物試驗(yàn)多采用含有ACE抑制肽的酶解組分進(jìn)行研究，如沙丁魚酶解產(chǎn)物和青柳蛤酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出長(zhǎng)效的降壓活性，連續(xù)灌胃28 d，SHR心臟收縮壓均明顯低于對(duì)照組大鼠[16-17]。本研究中以扇貝裙邊酶解產(chǎn)物連續(xù)灌胃SHR 28 d后，又繼續(xù)觀察停藥后大鼠的心臟收縮壓情況，結(jié)果表明，停藥7 d內(nèi)，SHR的心臟收縮壓保持穩(wěn)定，顯著低于空白對(duì)照，說明以扇貝裙邊為原料的ACE抑制肽降壓效果良好，并在停藥后仍表現(xiàn)出降壓持效性，因此，以扇貝裙邊酶解產(chǎn)物開發(fā)降壓藥物或降壓保健食品具有一定的優(yōu)越性。此外，對(duì)扇貝裙邊酶解產(chǎn)物的降壓機(jī)制進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，給SHR灌胃后，能引起RAS系統(tǒng)中如ACE、AngⅡ(血管緊張素Ⅱ)、ATG(血管緊張素原酶)、ALD(醛固酮)等相關(guān)指標(biāo)下降(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，結(jié)果與鬼針草水提物[19]、牡蠣配伍葛根[20]、水解酪蛋白肽粉[21]等成分的降血壓機(jī)制類似，進(jìn)一步說明扇貝裙邊酶解產(chǎn)物是開發(fā)降壓藥物或保健食品的良好原料。

綜上所述，扇貝裙邊酶解產(chǎn)物具有良好的降血壓效果，扇貝裙邊資源豐富、價(jià)格低廉，可作為開發(fā)降血壓肽的良好原料，對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用,能極大地提高扇貝裙邊附加值，具有廣闊的應(yīng)用前景。