復(fù)方中草藥對大菱鲆幼魚生長性能及非特異性免疫指標(biāo)的影響

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(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000)

大菱鲆Scophthalmusmaximus俗稱多寶魚，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，是中國北方地區(qū)主要海水養(yǎng)殖魚類品種之一[1]。近年來，隨著大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)逐漸向集約化、規(guī)模化發(fā)展，養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)，常見癥狀有腹水病、紅體病、愛德華氏癥等一系列疾病[2]。為了預(yù)防疾病的暴發(fā)，促進(jìn)動物生長發(fā)育和提高飼料利用率，大量化學(xué)合成的飼料添加劑和抗生素藥品在飼料中普遍使用，導(dǎo)致魚體耐藥性和嚴(yán)重的藥物殘留問題，其中，2006年出現(xiàn)的“多寶魚藥殘超標(biāo)事件”，嚴(yán)重影響了大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。因此，研制大菱鲆配合飼料綠色添加劑，提高健康養(yǎng)殖水平是推動大菱鲆等海水養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵之一。

中草藥主要起源于中國，在中醫(yī)理論體系中，多數(shù)兼有藥用和食用雙重作用。中草藥作為一種天然綠色飼料添加劑，含有豐富的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，既可提高消化酶活性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高水產(chǎn)動物的生長性能，又可提高水產(chǎn)動物非特異性免疫功能，避免化學(xué)藥物和抗生素引起的藥殘超標(biāo)和耐藥性等一系列問題[3-5]。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中草藥黃芪、黨參、杜仲、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、牛膝、旱蓮草等多種中草藥對水產(chǎn)動物的消化吸收及生長有不同程度的促進(jìn)作用[6-11]。目前，中草藥飼料添加劑在生產(chǎn)過程中多為原料藥粉碎后直接攪拌添加到飼料中，因添加量大，飼料適口性受到影響。本試驗(yàn)中選取河北農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制的幾種中草藥添加劑，采用砂鍋熬煮方式，將熬煮中藥湯汁過濾后定量加入基礎(chǔ)飼料中，以此研究幾種不同配方中草藥對大菱鲆生長、免疫性能的影響，旨在為大菱鲆疾病防控及健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大菱鲆幼魚購于黃驊市鑫海生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的配制 中草藥添加劑：根據(jù)中藥配伍理論設(shè)計(jì)4組復(fù)方中草藥配方。配方Ⅰ由甘草(15 g)、當(dāng)歸(30 g)、茯苓(30 g)、白芍(30 g)、白術(shù)(30 g)、柴胡(30 g)組成；配方Ⅱ由炒枳實(shí)(60 g)、白術(shù)(120 g)組成；配方Ⅲ由金銀花(30 g)、杏仁(30 g)、五味子(30 g)、山楂(30 g)組成；配方Ⅳ由炒白術(shù)(60 g)、炒白芍(40 g)、陳皮(30 g)、防風(fēng)(40 g)、黃芪(90 g)。分別按配方抓取中草藥，在冷水中浸泡30 min，加入1 L蒸餾水在砂鍋中大火煮沸10 min，文火熬制30 min，熬制成湯藥，過濾殘?jiān)糁胁菟幩逡簜溆谩?/p>

試驗(yàn)飼料：在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對大菱鲆配合飼料配方的研究基礎(chǔ)上[12]，以魚粉、豆粕和蝦粉為蛋白源，魚油、玉米油作脂肪源，淀粉為糖源，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)水平為50%、脂肪水平為10%的基礎(chǔ)飼料配方。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料中所有原料均經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，按表1比例均勻混合。置于攪拌機(jī)中攪拌9 min，攪拌過程中按飼料質(zhì)量的2%添加不同配方中草藥浸出液及蒸餾水(基礎(chǔ)飼料只加蒸餾水)，飼料經(jīng)膨化機(jī)膨化后制作成顆粒狀飼料，自然風(fēng)干12 h，裝袋后于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。不同中草藥配方飼料營養(yǎng)成分測定(干物質(zhì)基礎(chǔ))結(jié)果顯示(表2)，各組試驗(yàn)飼料的營養(yǎng)水平符合大菱鲆幼魚飼料營養(yǎng)成分的需求。各組飼料的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分各營養(yǎng)指標(biāo)與對照組均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 試驗(yàn)飼料配方(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.1 Ingredients of experimental diets(dry matter basis) w/%

注：1)其他為魚油3.0%，玉米油3.0%，卵磷脂1.0%，膽堿0.5%, VC磷酸酯0.5%，DMPT 0.1%，復(fù)合維生素1.0%，復(fù)合礦物鹽0.5%

Note:1)The others include 3.0% fish oil, 3.0 % corn oil, 1.0% lecithin, 0.5% choline, 0.5% ascorbic acid, 0.1% DMPT, 1.0% witamin mix, and 0.5% mineral mix

表2不同中草藥配方飼料營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Tab.2 Approximate nutrition of diets containing different Chinese herbal medicine compounds(dry matter basis)w/%

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 將240尾平均體質(zhì)量為10 g的大菱鲆幼魚隨機(jī)分為5組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)放16尾幼魚，養(yǎng)殖箱為玻璃水族箱(0.4 m×0.5 m×0.6 m)。整個養(yǎng)殖期間采用循環(huán)流水系統(tǒng)，養(yǎng)殖用水為渤海自然海水(消毒、沉淀、沙濾)，鹽度為30.20±0.02，24 h連續(xù)充氧，日光燈照射10 h，冷暖機(jī)控制溫度為(17±1)℃，每天定量投喂2次(8:00和18:00)，每兩周稱重一次，日投喂量為體質(zhì)量的2%～3%。每天定時換水，每兩周測定溶解氧和氨氮等指標(biāo)，試驗(yàn)周期為8周。

1.2.3 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束后，對所有魚禁食1 d，稱重、測量其體長；從每組取3尾魚做體成分分析；從每組取6尾魚，用1.5 mL一次性無菌注射器(肝素鈉潤洗)從心臟抽血用于免疫指標(biāo)和理化指標(biāo)的測定。采血后解剖，取其胃、前腸組織用于消化酶的測定。將血樣置于冰箱(-20 ℃)中過夜，于4 ℃下以3000 r/min 離心10 min，得到血漿樣品，用于葡糖糖、甘油三酯和膽固醇等生化指標(biāo)測定。

1.2.4 指標(biāo)的測定與計(jì)算 大菱鲆幼魚的存活率(%)、增重率(WGR,%)、特定生長率(SGR，%/d)、蛋白質(zhì)效率(PER，%)、飼料系數(shù)(FCR)、肥滿度(CF，%)、腸脂體比(IPR，%)、臟體比(VSI，%)計(jì)算公式分別為

存活率=100%×N0/Nt，

增重率=100%×(Wt-W0)/W0,

特定生長率=100%×(lnWt-lnW0)/t,

蛋白質(zhì)效率=100%×(Wt-W0)/(F×P),

飼料系數(shù)=F/(Wt-W0)，

肥滿度=100%×Wt/L3,

腸脂體比=100%×Wc/Wt,

臟體比=100%×Wn/Wt。

其中：N0、Nt分別為試驗(yàn)開始和試驗(yàn)結(jié)束時大菱鲆體數(shù)量(ind.)；W0、Wt分別為試驗(yàn)開始和試驗(yàn)結(jié)束時大菱鲆體質(zhì)量(g)；Wc為腸系膜脂肪質(zhì)量(g)；Wn為內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量(g)；L為體長(cm)；F為飼料攝食量(g)；P為飼料中蛋白質(zhì)含量(%)；t為試驗(yàn)時間(d)。

采用國標(biāo)法、微量凱氏定氮法、索氏抽提(石油醚)法和馬弗爐550 ℃灼燒法分別測定體成分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量。

消化及免疫指標(biāo)：胃組織蛋白酶PPS(福林試劑比色法)、前腸脂肪酶LPS(比濁法)，以及血漿溶菌酶LZM(自身對照法)、堿性磷酸酶ALP(鐵氰化鉀法)、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px(二硫雙硝基苯甲酸法)、總超氧化物歧化酶T-SOD(羥胺法)活力均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA)，若組間有顯著性差異，再采用LSD法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中草藥配方飼料對大菱鲆生長性能的影響

從表3可見：D2組大菱鲆幼魚增重率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組D0(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著低于D0組(P<0.05)；D3、D4組增重率、特定生長率顯著低于D2組(P<0.05)，但與對照組無顯著性差異(P>0.05)；D1組各指標(biāo)均與對照組無顯著性差異(P>0.05)；各組間成活率無顯著性差異(P>0.05)。

表3 復(fù)方中草藥對大菱鲆生長性能及飼料利用情況的影響Tab.3 Effects of Chinese herbal medicine compounds on growth performance and feed utilization of turbot

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note: The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 飼喂不同復(fù)方中草藥飼料的大菱鲆形體指標(biāo)的變化

從表4可見：不同中草藥配方飼料對大菱鲆形體指標(biāo)的影響表明，D1組臟體比顯著高于D0組和D4組(P<0.05)，與其他中草藥組均無顯著性差異(P>0.05)；各組腸脂比及肥滿度均無顯著性差異(P>0.05)。

表4復(fù)方中草藥對大菱鲆形體指標(biāo)的影響

Tab.4 Effect of Chinese herbal medicine compounds on physique indices of turbot%

2.3 飼喂不同復(fù)方中草藥飼料的大菱鲆體內(nèi)營養(yǎng)成分的變化

從表5可見：各組大菱鲆幼魚全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分等指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)，D2組蛋白質(zhì)、粗脂肪含量較高。

表5復(fù)方中草藥對大菱鲆體內(nèi)營養(yǎng)成分的影響

Tab.5 Effect of Chinese herbal medicine compounds on whole body approximate composition of turbotw/%

2.4 飼喂不同復(fù)方中草藥飼料的大菱鲆消化酶指標(biāo)的變化

從表6可見：各試驗(yàn)組大菱鲆幼魚胃組織蛋白酶活力與D0組無顯著性差異(P>0.05)，其中，D4試驗(yàn)組顯著高于D2組(P<0.05)；D4組前腸脂肪酶活力顯著低于D0、D1、D2組(P<0.05)，D4組與D3組無顯著性差異(P>0.05)。

表6復(fù)方中草藥對大菱鲆消化酶指標(biāo)的影響

Tab.6EffectofChineseherbalmedicinecompoundsondigestiveenzymeactivitiesofturbot

組別 group胃蛋白酶/(U·mg-1prot)PPS前腸脂肪酶/(U·g-1prot)LPSD06.39±1.27ab102.95±5.63bD15.17±0.77ab115.44±5.57bD24.78±0.09a98.02±23.99bD35.11±1.51ab78.14±4.12abD46.79±0.36b54.71±27.61a

2.5 飼喂不同復(fù)方中草藥飼料的大菱鲆血漿生化指標(biāo)的變化

從表7可見：不同中草藥配方飼料對大菱鲆幼魚血漿中部分生化指標(biāo)有顯著性影響；其中，D1、D2、D3組血漿葡萄糖濃度顯著高于D0組，且D1組還顯著高于D2、D3、D4組(P<0.05)，D4組與對照組無顯著性差異(P>0.05)；D1組甘油三酯濃度顯著高于D0組(P<0.05)，D3、D4組顯著低于D0組(P<0.05)，D2組與D0組無顯著性差異(P>0.05)。

表7復(fù)方中草藥對大菱鲆血漿生化指標(biāo)的影響

Tab.7 Effect of Chinese herbal medicine compounds on plasma biochemical indices of turbotmmol/L

2.6 飼喂不同復(fù)方中草藥飼料的大菱鲆血漿非特異性免疫指標(biāo)的變化

從表8可見：D3組大菱鲆幼魚血漿中堿性磷酸酶活力顯著高于D0、D1、D4組(P<0.05)，其他各組間無顯著性差異(P>0.05)；D3組谷胱甘肽過氧化物酶活力顯著高于其他各組(P<0.05)；試驗(yàn)各組總超氧化物歧化酶和溶菌酶活力均無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 中草藥對大菱鲆生長的影響

本試驗(yàn)中，4組配方中草藥對大菱鲆生長均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用，并一定程度上降低了飼料系數(shù)，其中，由甘草、當(dāng)歸、茯苓、白芍、白術(shù)、柴胡組成的D1組和由炒枳實(shí)、白術(shù)(1∶2)組成的D2組，比對照組大菱鲆增重率分別增加了14.3%和24.9%，后者已構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異，因枳實(shí)和白術(shù)的配伍最早見于《金匱要略》枳術(shù)湯，用治“心下堅(jiān)，大如盤，邊如旋盤”。枳實(shí)辛散溫通，破氣消積，以瀉為主，白術(shù)甘溫補(bǔ)中，益氣生血，以補(bǔ)為藥，一消一補(bǔ)，相輔相成，從而補(bǔ)而不滯、消而不傷、健脾強(qiáng)胃、消食化積[13]。歷代醫(yī)者對兩者的配伍比例多有論述，結(jié)論尚不統(tǒng)一，一般枳、術(shù)配伍比例約為 2∶1時消重于補(bǔ)；枳、術(shù)配伍比例為1∶2時補(bǔ)重于消[14-15]。李新旺等[16]研究也表明，單味枳實(shí)、白術(shù)及配伍均能明顯改善動物腸胃運(yùn)動功能，以1∶2作用最佳。因此，本試驗(yàn)中D2組復(fù)方中草藥對大菱鲆的顯著促生長作用不無道理。此外，郭萍萍等[9]將甘草、白術(shù)、茯苓等中草藥粉碎后，按0.5%添加到大菱鲆飼料中投喂發(fā)現(xiàn)，20 d時大菱鲆增重率較對照組增加4.4%，但隨投喂時間的延長，增重率出現(xiàn)降低的趨勢。本試驗(yàn)中D1組復(fù)方中草藥也包含甘草、白術(shù)、茯苓，試驗(yàn)過程中并未發(fā)現(xiàn)增重率有明顯的先增加后降低的現(xiàn)象，試驗(yàn)結(jié)束時增重率較對照組增加了14.3%。推測除了配方略有不相同外，中草藥的添加形式和添加劑量也對中草藥藥效的發(fā)揮產(chǎn)生了影響。

表8 復(fù)方中草藥對大菱鲆血漿非特異性免疫指標(biāo)的影響Tab.8 Effect of Chinese herbal medicine compounds on plasma non-specific immune indices of turbot

3.2 中草藥對大菱鲆消化指標(biāo)的影響

關(guān)于中草藥對大菱鲆消化酶的影響已有相關(guān)報(bào)道。有研究表明，小劑量的白術(shù)、甘草、當(dāng)歸等不同復(fù)方中草藥可以提高消化酶活性[17-18]。在李順才[19]的研究中，由黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、山楂、甘草等20余種中草藥組成的添加劑，在添加量為1%時可顯著提高大菱鲆的胃蛋白酶活性，但添加量超過1%時則活性下降。本試驗(yàn)中4組中草藥配方理論上均有保肝健脾和促消化的功能。D1組中當(dāng)歸具有活血、補(bǔ)血、益氣之功用；白芍、白術(shù)、茯苓有保肝、健脾、促消化的作用。D2組中枳實(shí)、白術(shù)也能改善腸胃功能，促進(jìn)消化吸收。D3組中杏仁具有消食化積、潤肺寬胃、潤腸通便的作用；金銀花、五味子則有利膽保肝、抗炎解熱之功效。D4組中炒白術(shù)則緩和了生白術(shù)的燥性，具有增強(qiáng)健脾益氣之功能；炒白芍與白芍相比藥效有所減緩，主要以養(yǎng)血斂陰為主。結(jié)果表明，各組大菱鲆胃組織蛋白酶無顯著性差異，D4組前腸脂肪酶活力顯著低于對照組，并未得出中草藥可促進(jìn)大菱鲆消化酶活性的結(jié)論，具體原因還有待進(jìn)一步研究。脾臟是有頜脊椎動物的主要外周淋巴樣器官，也是重要的免疫器官，隨著魚類肝、脾所占體質(zhì)量比例的增大，機(jī)體免疫力也在增強(qiáng)[20]。李順才[19]發(fā)現(xiàn)，添加中草藥組大菱鲆的脾臟指數(shù)顯著高于未添加組，這與本試驗(yàn)中D1組顯著提高了大菱鲆的臟體比結(jié)論相一致。D1組中白芍含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等成分，對肝臟、腎臟起保護(hù)作用，因此，白芍對于D1試驗(yàn)組臟體比的顯著增加功不可沒。

3.3 中草藥對大菱鲆血清生化指標(biāo)的影響

血糖可以反映動物機(jī)體的營養(yǎng)狀況，主要來自對食物消化吸收后的葡萄糖及肝糖原的分解和異生作用，受到胰島素、腎上腺激素的控制和機(jī)體的各種調(diào)節(jié)[21-22]。養(yǎng)殖過程中的急性或慢性應(yīng)激可顯著影響魚類血清中葡萄糖水平，而面對應(yīng)激，機(jī)體組織利用血糖作為主要能量來源。本研究中發(fā)現(xiàn)，4組復(fù)合中草藥均不同程度地提高了大菱鲆葡萄糖含量，與齊茜等[23]用紫草、桑葉、金銀花等組成的復(fù)方中草藥對閃光鱘Acipenserstellatus的影響一致。因此，在維持葡萄糖動態(tài)平衡基礎(chǔ)上，葡萄糖的適量增加有助于提高魚類機(jī)體抗應(yīng)激能力。

甘油三酯和膽固醇是分析血脂的重要指標(biāo)，可以作為飼料中脂類代謝的指標(biāo)。本研究表明，D4組顯著降低了血清中甘油三酯含量，膽固醇含量也較對照組降低了19.6%，D3組甘油三酯和膽固醇含量較對照組分別降低了20.7%和2.3%，雖與對照組未構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但顯著低于D1組甘油三酯和膽固醇水平。原因可能是在于D3組中金銀花、杏仁通過與膽固醇結(jié)合及抑制膽固醇合成等發(fā)揮降脂作用，D4組中的黃芪主要藥用活性成分黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮等也均可降低甘油三酯和膽固醇含量，具有降脂作用[24]。

3.4 中草藥對大菱鲆非特異性免疫指標(biāo)的影響

中草藥對于免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的功能已有報(bào)道，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種中草藥一方面通過活化機(jī)體內(nèi)抗氧化酶，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力；另一方面通過激活補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞，誘生多種細(xì)胞因子等方式促進(jìn)機(jī)體非特異性免疫功能。本試驗(yàn)中4組復(fù)方中草藥均有一定的抗氧化和促免疫作用，如D1組的甘草、茯苓，D2組的枳實(shí)、白術(shù)，D3組的金銀花、杏仁、五味子，D4組的陳皮、防風(fēng)、黃芪等均可一定程度地清除機(jī)體自由基，改善機(jī)體抗氧化系統(tǒng)。由金銀花、五味子、苦杏仁和山楂組成的D3組顯著提高了大菱鲆血漿中谷胱甘肽過氧化物酶活力，其他組對大菱鲆血漿總超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性和非特異性免疫酶活性有一定改善，但促進(jìn)作用不顯著。其原因與D3組中金銀花、五味子、苦杏仁均有抗菌、抗病毒及抗氧化功能，且五味子的抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用尤為突出有關(guān)。任麗佳等[25]研究表明，五味子多糖能顯著降低大鼠血清中丙二醛含量，并顯著提高血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性。Leong等[26]也發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能通過激活 AML12 細(xì)胞中 ERK1/2 及 Nrf2，從而激活 MAPK 通路，最終使谷胱甘肽的表達(dá)顯著增強(qiáng)，這均與本試驗(yàn)結(jié)果一致；另一方面可能與方劑的配伍和作用側(cè)重點(diǎn)有關(guān)。因此，各組中草藥配方仍需進(jìn)行中草藥添加量及配方優(yōu)化的深入研究，以期為復(fù)方中草藥在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供更為可靠的參考。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)室自制4組復(fù)方中草藥配方均不同程度地促進(jìn)了大菱鲆的生長，4組配方作用各有所長。D1、D2組復(fù)方中草藥在提高增重率、降低餌料系數(shù)等指標(biāo)中作用顯著，以D2組復(fù)方中草藥最佳；D4組復(fù)方中草藥調(diào)節(jié)血脂作用顯著，可顯著降低大菱鲆血漿中甘油三酯和膽固醇含量；D3組復(fù)方中草藥可通過顯著提高大菱鲆血漿中谷胱甘肽過氧化酶活力，以提高大菱鲆非特異性免疫能力。