野大黃含藥血清體外抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性試驗

蔡丙嚴(yán)，田其真，劉 莉，郝福星，戴建華

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種以種豬繁殖障礙、仔豬和育肥豬呼吸困難為主要特征的具有高度傳染性的病毒病[1]。近年來，該病對我國的生豬養(yǎng)殖造成了極大的損失，尤其是病毒容易發(fā)生變異[2]，現(xiàn)有疫苗毒株較多[3]，疫苗免疫尚有爭議[4]，替米考星、泰萬菌素等抗生素在控制豬繁殖與呼吸綜合征繼發(fā)感染中雖然取得一定效果[5,6]，但不能全面解決疫病防控中的一些難題。因此，生產(chǎn)中急需找到控制豬繁殖與呼吸綜合征感染的藥物來防控疫情的發(fā)生。中藥抗病毒已成為近年來國內(nèi)外研究的熱點，現(xiàn)代中藥藥理研究結(jié)果表明，部分清熱解毒功效的中藥具有抑制多種病原微生物的作用[7]。孫加節(jié)等[8]研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖在體外可有效阻斷或抑制PRRSV對Marc-145細胞的感染；趙昕等[9]研究表明，苦參堿在體外可有效抑制PRRS對Marc-145細胞的感染，在直接殺滅和復(fù)制抑制試驗中最高抑制率分別達到105.10%、91.53%；劉櫻等[10]研究表明，黃芪能對PRRS感染Marc-145細胞提供100%的保護率，板藍根多糖對細胞保護率能達到48.03%。本項目所選“野大黃”是由中藥野拔子、土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根等組成的復(fù)方，均為清熱解毒類中藥。野拔子是云南的一種藥食同源植物，具有疏風(fēng)解表、利濕、消食化積的功效，研究表明，其粗提液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有較好地抑制效果[11]。土大黃為蓼科植物鈍葉酸模及羊蹄的根與根莖，其性涼，味辛、苦，具有清熱行瘀、殺蟲、解毒之功，用于治療咳血、肺癰、腮腺炎、大便秘結(jié)、癰腫毒等[12]。癩蛤蟆草，藥名為荔枝草，本品味苦、辛，性涼，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱解毒利尿消腫、涼血止血等功效[13]。苧麻根是蕁麻科苧麻屬植物苧麻根莖，具有清熱解毒、止血、止痛、利水、消腫、安胎、接骨等功效[14]。上述4種單味中藥體外抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性尚未見報道，依據(jù)中獸醫(yī)對豬繁殖與呼吸綜合征的辯證原則，該病屬于瘟熱病范疇[15]。本試驗以野拔子、土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根清熱解毒的中藥科學(xué)組方，并飼喂SD大鼠，制備野大黃含藥血清，研究其體外抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性，為尋找治療豬繁殖與呼吸綜合征的高效純中藥制劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑野拔子、土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根4種中藥，采自云南祿勸彝族苗族自治縣海拔1700 m的當(dāng)?shù)匾吧幉?。利巴韋林注射液購自裕松源藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.1 g/L，批號：20170301001，臨用前細胞維持液配成 0.05 g/mL。DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司生產(chǎn)），按說明書配制，加入雙抗（各100 IU/mL）再加入犢牛血清，10%濃度為細胞生長液（以下稱生長液），5%濃度為維持液（以下稱維持液）；犢牛血清為杭州四季青公司生產(chǎn)；MTT（四唑溴鹽，Sigma公司產(chǎn)品），稱取四唑溴鹽，用 pH值7.2 的細胞維持液加溫攪拌溶解，使終濃度為5 mg/mL，用0.22 μm 混合纖維素酯微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃冰箱保存；裂解液二甲亞砜（DMSO），上海國藥集團生產(chǎn)。

1.2 毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性毒株P(guān)HTZ201606，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院豬病檢測中心分離鑒定，按Reed-Muench法測得病毒半數(shù)組織感染量（TCID50）為10-7.5/0.1mL，按終濃度100 TCID50用量使用。

1.3 Marc-145細胞由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制品重點實驗室提供，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4 SD大鼠18只SD大鼠，體質(zhì)量（250±5）g，雌雄各半，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實驗動物房提供。

1.5 野大黃中藥復(fù)方藥液制備野大黃由中藥野拔子18 g、土大黃14 g、癩蛤蟆草24 g和苧麻根10 g組成復(fù)方。稱取對應(yīng)份量的野拔子，加入野拔子總質(zhì)量4倍的蒸餾水浸泡36 h，使藥材充分膨脹后蒸餾2次，收集蒸餾液備用。向蒸餾后的殘渣、殘夜中加入對應(yīng)份量的土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根3味中藥，并添加藥材總質(zhì)量5倍的蒸餾水，浸泡24 h后進行2次煎煮，合并2次煎液加熱濃縮至稠狀，加質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇，沉淀48 h后過濾，反復(fù)進行2次，濾液加熱揮發(fā)至無醇味得到濾液，濾液中加入備用的野拔子蒸餾液，調(diào)節(jié)藥液的pH值為7.2～7.4，高壓蒸汽滅菌121℃、15 min，冷卻后用生理鹽水調(diào)至其生藥含量為2 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 野大黃與利巴韋林對照品含藥血清制備將18只SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為野大黃組、利巴韋林對照組、空白對照組，每組6只，雌雄各半，分籠喂養(yǎng)。野大黃組和利巴韋林對照組分別以2、0.025 g/mL的藥物濃度灌胃，每天2次，每次1 mL，空白對照組以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥共3 d。末次給藥后1 h腹主動脈無菌采血，血樣于無菌離心管中靜置2 h以上，待血塊收縮良好后，50×g無菌分離血清10 min，經(jīng)56℃、30 min滅活處理，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 含藥血清對Marc-145細胞毒性測定取已長滿單層Marc-145細胞的96孔培養(yǎng)板，棄生長液，用PBS洗板2次，以不含胎牛血清的DMEM將野大黃、利巴韋林對照含藥血清及空白對照組血清均以2 倍濃度梯度稀釋為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16共5 個濃度，分別加至96孔細胞板上，每孔100 uL，每個稀釋度做4個重復(fù)，同時設(shè)細胞對照孔（不加血清，僅加細胞維持液），置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況，細胞生長情況判定標(biāo)準(zhǔn)：“-”表示細胞單層、輪廓清晰度完好，細胞折光性良好；“+” 表示細胞單層、輪廓清晰度較好，折光性稍差；“++”表示部分細胞腫脹、變形，單層完整性遭到破壞；“+++”表示細胞大面積腫脹、變形、脫落，折光性差，無完整單層細胞[16]。連續(xù)觀察72 h，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入MTT（終濃度0.5 mg/mL）50 uL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄MTT上清，每孔加入DMSO100 uL，振蕩5～10 min，酶標(biāo)儀測OD492值，計算細胞存活率[17]。細胞存活率=（含藥血清各稀釋度組平均OD492/正常細胞對照孔平均OD492）×100%。含藥血清無毒濃度判定標(biāo)準(zhǔn)為：含藥血清各稀釋度組與正常細胞對照孔比較，以細胞不出現(xiàn)腫脹、變形、脫落及MTT法測得細胞存活95%以上的最小稀釋度為含藥血清應(yīng)用的無毒濃度[18]。

1.8 野大黃含藥血清體外抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性作用將野大黃、利巴韋林對照含藥血清及空白對照組血清在最大無毒范圍內(nèi)以無血清DMEM 進行2 倍濃度梯度稀釋，最終為1∶4、1∶8、1∶16 3個濃度，分3種加藥方式觀察野大黃含藥血清抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性。

第1種方式：先加入含藥血清，后加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒，目的是觀察含藥血清對豬繁殖與呼吸綜合征病毒吸附細胞的阻斷作用。取已長滿單層Marc-145細胞的96孔培養(yǎng)板，先加入野大黃、利巴韋林對照、空白對照各3個濃度的血清，每孔加入100 uL，每份血清平行測定4孔，同時設(shè)正常細胞和病毒對照孔，培養(yǎng)2 h，取出細胞板，然后每孔接種100 TCID50豬繁殖與呼吸綜合征病毒液100 uL，繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察致細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）進展情況。CPE記錄標(biāo)準(zhǔn)：“-”為無CPE；“+”為25% 細胞出現(xiàn)CPE；“++”為50% 細胞出現(xiàn)CPE；“+++”為75%細胞出現(xiàn)CPE；“++++”為100%細胞出現(xiàn)CPE[19]。當(dāng)病毒對照孔出現(xiàn)“+++”以上病變時，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入MTT（終濃度0.5 mg/mL）50 uL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄MTT上清，每孔加入DMSO 100 uL，振蕩5～10 min，酶標(biāo)儀測OD492值，計算病毒抑制率。病毒抑制率=（各試驗組平均OD492－病毒對照孔平均OD492）/(正常細胞對照孔平均OD492－病毒對照孔平均OD492)×100%。

第2種方式：先加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒，后加含藥血清，目的是觀察含藥血清對豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的抑制作用。取已長滿單層Marc-145細胞的96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 TCID50豬繁殖與呼吸綜合征病毒液100 uL，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h吸附感染細胞，然后加入野大黃、利巴韋林對照、空白對照各3個濃度的血清，每孔100 uL，每份血清平行測定4孔，同時設(shè)正常細胞和病毒對照孔，同第1種方式培養(yǎng)、CPE檢查、計算病毒抑制率。

第3種方式：含藥血清與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合后加入細胞培養(yǎng)板，目的是觀察含藥血清對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的直接殺滅作用。取野大黃、利巴韋林對照、空白對照各3個濃度的血清，分別與豬繁殖與呼吸綜合征病毒等量混合，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，將混合液加入已長滿單層Marc-145細胞的96孔培養(yǎng)板中，同時設(shè)正常細胞和病毒對照孔，同第1種方式培養(yǎng)、CPE檢查、計算病毒抑制率。

1.9 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以±s表示（均值±標(biāo)準(zhǔn)差），檢測結(jié)果采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行組間單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對Marc-145細胞毒性測定結(jié)果由表1可知，野大黃含藥血清與空白對照血清在稀釋度為1∶4及其以上時，其細胞存活率均達到95%以上，在5個稀釋度中，鏡檢Marc-145細胞單層完好，輪廓清晰，未見細胞腫脹、變形，僅在1∶1和1∶2這2種較低稀釋度時，細胞折光性較差，其原因可能是血清中的一些其他成分對細胞的存活有一定影響，與正常細胞對照差異顯著（P＜0.05）。利巴韋林含藥血清在1∶4稀釋度時，細胞存活率達到95.05%，但其在1∶1和1∶2這2種較低稀釋度時，對Marc-145細胞的生長表現(xiàn)出了一定的毒性，其細胞存活率分別為62.88%、83.26%，鏡檢Marc-145細胞單層完整性遭到破壞，見有大量細胞腫脹、變形、收縮且與周圍細胞分界明顯，與正常細胞對照差異顯著（P＜0.05）。依據(jù)細胞不出現(xiàn)腫脹、變形、脫落，細胞存活95% 以上的最小稀釋度為血清體外抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的無毒濃度。野大黃含藥血清、利巴韋林對照血清及空白對照血清無毒稀釋度均選擇1∶4。

表1 含藥血清對Marc-145細胞毒性測定結(jié)果Table 1 Determination of cytotoxicity of drug containing serum on Marc-145 cells

2.2 野大黃含藥血清體外抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性作用結(jié)果由表2可知，在第1種加藥方式中，與正常細胞對照相比，各濃度含藥血清組其OD492均值顯著降低（P＜0.05）；與病毒對照比，各濃度野大黃含藥血清組、利巴韋林對照含藥血清，其OD492均值顯著升高（P＜0.05）；與各濃度空白對照血清組比，各濃度野大黃含藥血清組與利巴韋林對照含藥血清組，其OD492顯著升高（P＜0.05），對豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制率明顯升高；與各濃度利巴韋林對照含藥血清組比，在1∶4 稀釋度時，野大黃含藥血清組與利巴韋林對照血清組OD492均值差異不顯著，但野大黃含藥血清組對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制率為71.16%，大于利巴韋林對照含藥血清組的病毒抑制率63.58%，同時，利巴韋林對照含藥血清組在1∶4 稀釋度時Marc-145細胞已出現(xiàn)約25%的CPE病變；從對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制率來比較，野大黃含藥血清組在1∶8稀釋度時病毒抑制最高，為80.77%，而利巴韋林對照含藥血清組在1∶16稀釋時其病毒抑制最高，為77.44%。綜合比較，在第1種加藥方式中，即預(yù)防性給藥時，野大黃含藥血清對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制作用優(yōu)于利巴韋林含藥血清對照組。

表2 第1種給藥方式對豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of first dosing methods on the proliferation of PRRSV

由表3可知，在第2種加藥方式中，各濃度含藥血清組與正常細胞對照比，其OD492均值均顯著降低（P＜0.05）。與病毒對照、各濃度空白對照血清組比，各濃度野大黃含藥血清組、利巴韋林對照血清，其OD492均值顯著升高（P＜0.05），對豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制率明顯升高，這些結(jié)果與第1種加藥方式相同；與各濃度利巴韋林對照血清組比，野大黃含藥血清組在1∶4 稀釋度時，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制率最高為77.30%，隨著稀釋度的逐漸升高，其對病毒的抑制率逐漸降低，呈現(xiàn)出典型的量效關(guān)系，即病毒抑制率與血清稀釋度成反比，在1∶16稀釋度時，病毒抑制率為66.60%，且已出現(xiàn)約25%的CPE病變。利巴韋林對照含藥血清組在1∶4和1∶8這 2種稀釋度時，病毒抑制率分別為78.96%、79.70%，在1∶16稀釋度時病毒抑制率下降至70.29%，亦呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。綜合比較，在第2種加藥方式中，即治療給藥時，利巴韋林含藥對照血清組對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制作用優(yōu)于野大黃含藥血清組。

由表4可知，在第3種加藥方式中，各濃度含藥血清組分別與正常細胞對照、病毒對照相比，各濃度野大黃含藥血清組、利巴韋林對照含藥血清、各濃度空白對照血清組比與各濃度空白對照血清組比，其OD492均值、對豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制率等結(jié)果均與第1種加藥方式相同。與各濃度利巴韋林對照血清組比，在1∶4 稀釋度時，野大黃含藥血清組與利巴韋林對照含藥血清組OD492均值差異顯著（P＜0.05），兩者對豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制率分別為83.51%、73.07%，相差約10%。同時，野大黃含藥血清組與利巴韋林對照含藥血清組，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制率呈現(xiàn)出典型的量效關(guān)系，即隨稀釋度的逐漸升高，病毒抑制率逐漸降低。在1∶16稀釋度時，利巴韋林對照含藥血清組病毒抑制率為63.55%，已出現(xiàn)約25%的CPE。因此，綜合比較，第3種加藥方式，即對豬繁殖與呼吸綜合征病毒有直接殺滅作用，野大黃含藥血清組優(yōu)于利巴韋林對照含藥血清組。

表3 第2種給藥方式對豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的抑制作用Table 3 Inhibitory effects of second dosing methods on the proliferation of PRRSV

表4 第3種給藥方式對豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的抑制作用Table 4 Inhibitory effects of third dosing methods on the proliferation of PRRSV

3 討論

中藥體外抗病毒研究多以中藥提取物直接加入體外培養(yǎng)的細胞中，通過觀察中藥是否能抑制細胞病變的產(chǎn)生、MTT染色測量吸光值，計算病毒抑制率等綜合判定中藥體外抗病毒活性[20]。本研究采用將中藥提取物飼喂SD大鼠制備含藥血清，以血清藥理學(xué)的方法驗證野大黃含藥血清體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活性。血清藥理學(xué)方法是將受試藥物經(jīng)口給予動物后，取其血清作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中研究其藥理作用[21]，其優(yōu)點是克服了以往的離體試驗方法中藥粗提物對試驗結(jié)果的干擾，如中藥粗提物的pH 值、鞣質(zhì)、無機物等許多非特異性理化因素，容易造成試驗結(jié)果的假陽性或假陰性[22]。同時，血清藥理試驗結(jié)果與在體試驗有較好的一致性，不僅能反映中藥母體藥物及其可能的代謝產(chǎn)物的藥理作用，而且還能反映可能藥物誘導(dǎo)機體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用[23]。中藥血清藥理在醫(yī)學(xué)研究中報道較多，如彭志等采用觀察CPE 及MTT 法，觀察了銀黃清肺膠囊含藥血清體外抗呼吸道合胞病毒作用[24]。本試驗選取4味中藥野拔子、土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根組方為野大黃，制備含藥血清，方中各單味藥以血清藥理的方法體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性在獸醫(yī)研究中尚屬首次報道。

中藥提取物體外抗病毒作用機制的研究，通常以中藥提取物抑制病毒吸附、抑制病毒復(fù)制、直接殺滅病毒3個方面進行闡述，落實到具體的體外抗病毒試驗中是分3種加藥方式觀察抗病毒活性。多數(shù)研究報道表明，中藥提取物的體外抗病毒作用機理是能較好地抑制病毒吸附和直接殺滅病毒作用[25]，而不具備抑制病毒復(fù)制作用或作用相對較差[26]。本研究結(jié)果表明，野大黃含藥血清在3種給藥方式中，以含藥血清與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合后直接加入Marc-145細胞，其病毒抑制率最高，其次是先加入含藥血清后加入病毒，再次是先加入病毒后加入含藥血清，其病毒抑制率分別為83.51%、80.77%、77.30%，說明野大黃含藥血清能直接殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒，同時，其能阻斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒對Marc-145細胞的吸附與侵入，但對進入細胞內(nèi)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制其脫殼、生物合成及釋放作用相對較差，該研究結(jié)果與多數(shù)研究結(jié)果相一致[27]。中藥無論是單體還是復(fù)方提取物，均有多種成分，這些化學(xué)成分的作用并非簡單的疊加，而是相互影響、彌補，通過多層次，多個作用途徑，多靶點和機理發(fā)揮綜合作用[28]，因此野大黃含藥血清的確切抗病毒機制有待進一步研究。

豬繁殖與呼吸綜合征是我國也是國際養(yǎng)豬業(yè)在今后相當(dāng)長一段時間內(nèi)面臨的一個難題。其致病機理、新型疫苗研發(fā)及綜合防控研究是當(dāng)今科技工作者研究的熱點，伴隨無抗養(yǎng)殖的需求，研發(fā)新型、高效治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物，減少養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失是當(dāng)前亟待解決的課題。本研究發(fā)現(xiàn)野大黃含藥血清體外具有顯著殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性，該發(fā)現(xiàn)豐富了野大黃中藥復(fù)方中野拔子、土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根等的臨床藥理研究資料，也為豬繁殖與呼吸綜合征的治療提供了新的思路，為后續(xù)研發(fā)新型抗豬繁殖與呼吸綜合征純中藥制劑奠定基礎(chǔ)。

野大黃含藥血清體外具有顯著的抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性，以同時給藥時具有直接殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒作用，在1∶4 稀釋度時，野大黃含藥血清對豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制率為83.51%，有望作為抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物進行開發(fā)。